Boncuklar Üzerinde Galectin-3 - U1 snRNP Kompleksi ile Birleştirme Etkinliğinin Tamamlayıcısı

Bu rapor, bir galektin-3 U1 snRNP kompleksinin pre mRNA substratına bağlandığı, fonksiyonel bir kompleks oluşturduğu ve ekleme reaksiyonunun ürünlerine yol açtığı dokümantasyonu için deneysel kanıt sağlar. Bu protokol, tamamlamaya kadar ilerleyebilen ekleme reaksiyonunu başlatmak için anti-gal3 antikorlarına kovalent olarak bağlanmış boncuklar üzerinde immünosenksiyonu olan galektin-3 U1 snRNP'yi kullanır. Protokoldeki kritik bir adım, galektin-3 U1 snRNP kompleksini içeren boncukların peletlendikten sonra sıvının dikkatli bir şekilde uzaklaştırılması ve bunun ekleme reaksiyonunun başlatılmasında hemen kullanılmasıdır.

Nükleer ekstrakttan U1 snRNP'leri tüketmek için, 200 mikrolitre nükleer ekstraktı 100 mikrolitre anti-U1 boncuk ile inkübe edin. Karışıma beş mikrolitre RNA ekleyin ve mikro tüp kafasını bir saat boyunca dört santigrat derecede kuyruk üzerinde döndürün. Karışımı santrifüjleme ile pelet haline getirin ve bağlanmamış malzemeyi bir Hamilton şırıngası kullanarak toplayın.

U1 tükenmiş nükleer ekstraktın tüm hacmini, orijinal tükenmemiş nükleer ekstraktın ayrı bir 50 mikrolitrelik alikotu ile birlikte, bir mikro diyalizörün ayrı bölmelerinde, dört santigrat derecede% 60 tampon D'ye karşı 75 dakika karıştırarak diyalize edin. 8K moleküler ağırlığı kesilmiş bir diyaliz membranı kullanın. Diyalizden hemen sonra, preparatları 20 mikrolitrelik alikotlara bölün, ardından kuru buz etanol banyosunda dondurun ve eksi 80 santigrat derecede saklayın.

Kullanmadan hemen önce, anti-gal3 boncukları 0,5 mililitre TX yıkama tamponu ile iki kez yıkayın. Her yıkama için yıkama tamponunu ve santrifüjü ekleyin. Boncuklardan sıvıyı çıkarmak için süpernatanı önce bir mikropipetle ve ardından bir Hamilton şırıngasıyla çıkarın.

Nükleer özü %12 ila %32 gliserol gradyanı üzerinde fraksiyonlayın. 10S bölgesine yakın olan üç, dört ve beş gliserol gradyan fraksiyonlarını birleştirin ve karıştırın. Üçten beşe kadar iki adet 150 mikrolitrelik birleşik gradyan fraksiyonları hazırlayın ve bunları 50 mikrolitre anti-gal3 boncuklara yerleştirin.

Paralel olarak, her biri 150 mikrolitre fraksiyon bir olan iki numune hazırlayın ve bunları 50 mikrolitre anti-gal3 boncuklara yerleştirin. Kontrol olarak, 50 mikrolitre anti-gal3 boncuğuna 150 mikrolitre %60 tampon D yerleştirin. Tüplere hafifçe vurarak hafifçe karıştırın, ardından bir saat boyunca dört santigrat derecede kuyruk üzerinde döndürün.

Numuneleri nazik santrifüjleme ile peletleyin. Süpernatantın çoğunu bir mikropipet ile çıkarın. İğne ucunu boncukların dibine dikkatlice sokarak bir Hamilton şırınga kullanarak süpernatanı çıkarın.

Ekleme reaksiyonları için boncukları hemen kullanın. Ekleme reaksiyonunu metin el yazmasında açıklandığı gibi birleştirin ve bir boncuk örneği setine ekleyin. Toplam 24 mikrolitrelik bir hacimde, ancak U1 tükenmiş nükleer ekstrakt olmadan aynı birleştirme reaksiyonu setini birleştirin ve diğer boncuk setine ekleyin.

Toplam 12 mikrolitre hacminde herhangi bir boncuk yokluğunda gerçekleştirilecek bir kontrol ekleme reaksiyonu hazırlayın. Bu kontrol reaksiyonu nükleer ekstrakt,% 60 tampon D ve radyoaktif ekleme substratı içerir. Tüpleri hafifçe vurarak karıştırın ve 90 dakika boyunca 30 santigrat derecede kuyruk üzerinde döndürün, ardından karışımı nazikçe santrifüjleyerek peletleyin.

Boncuk içeren tüplere 24 mikrolitre 2X SDS numune tamponu ve nükleer ekstrakt içeren ancak boncuk içermeyen kontrol tüpüne 12 mikrolitre 2X SDS numune tamponu ekleyerek reaksiyonu durdurun ve proteinleri boncuklardan çıkarın. Her tüpü girdaplayın. Tüpleri yedi dakika boyunca 100 santigrat derecede ısıtın.

Tüpleri, oda sıcaklığında 10 ila 15 saniye boyunca sallanan bir kova rotorunda 1.000 kez G'de santrifüjleyin. Süpernatanları taze mikro tüplere aktarın. Proteinleri sindirmek ve çözündürmek için mililitre proteinaz K başına 20 miligram ekleyin.

Tüpleri 37 santigrat derecede 40 dakika inkübe edin. İnkübasyondan sonra, tüpleri yavaşça santrifüjleyin. Boncuk kısımlarını 39.5 mikrolitre TE ve 10 mikrolitre üç molar sodyum asetat ile seyreltin.

Nükleer ekstrakt kontrolünü 63.5 mikrolitre TE ve 10 mikrolitre sodyum asetat ile seyreltin. Metin el yazmasında açıklandığı gibi RNA'yı çıkarın ve analiz edin. Anti-gal3 ile immünopresipite edilmiş gliserol gradyanının 10S bölgesinden U1 snRNP ve gal3 U1 snRNP komplekslerinden tükenmiş nükleer ekstraktlar, bir ekleme reaksiyonunda karıştırıldı.

Bu reaksiyon karışımı, U1 snRNA'nın yanı sıra U1'e özgü protein U1-70K içeriyordu. Beklendiği gibi, anti-gal3 gal3'ü çökeltti. U1 snRNA, U1-70K proteini ve gal3, pre-immün kontrol çökeltisinde bulunmadı.

Pozitif bir kontrol olarak gerçekleştirilen tükenmemiş bir nükleer ekstrakt ile karşılaştırıldığında, U1 snRNP'den tükenmiş nükleer ekstrakt, ekleme aktivitesi göstermedi. U1 ile tükenmiş nükleer ekstrakttaki ekleme aktivitesi, boncuk bağlı gal3 U1 snRNP kompleksi tarafından yeniden oluşturulabilir. Ekleme reaksiyonunun her iki ürünü de bağlanmış ekzonlar ve eksize edilmiş intron lariat ve ayrıca ara ürünlerde bulundu.

Üç ila beş arasındaki fraksiyonların bileşenleri, U1 ile tükenmiş nükleer ekstrakta eklemenin geri kazanılmasında kritik öneme sahipti. Bu fraksiyonlar tek başına tampon ile değiştirildiğinde, herhangi bir ekleme aktivitesi gözlenemedi, bu da anti-gal3 boncuklarının U1'den yoksun nükleer ekstrakttaki ekleme aktivitesinin restorasyonundan sorumlu olmadığını gösterir. Daha ikna edici bir şekilde, üç ila beş arasındaki fraksiyonlar, immünopresipitasyon prosedüründe fraksiyon bir ile değiştirildiğinde ve daha sonra U1 tükenmiş nükleer ekstrakta eklendiğinde, ekleme reaksiyonunun hiçbir ara ürünü veya ürünü bulunmadı. Bu protokolü denerken, bir kişi immünopresipitasyonu tamamlarken, diğer kişi ekleme reaksiyonunu mümkün olduğunca az gecikmeyle hazırlamalıdır.

U1 ile tükenmiş bir nükleer ekstrakta ekleme aktivitesini geri kazandıran galektin-3 U1 SNRP'nin polipeptit bileşiminin proteomik analizi büyük ilgi görecektir.