Name: Astrosit Bölgesi Hacminin Analizi ve Kalın Serbest Yüzen Doku Kesitlerinde Döşeme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 53 s
Description: Öğrenin fare beyni kalın serbest yüzen doku kesitlerinde astrosit bölgesi hacmi ve örtüşme analizi yapmayı. Konfokal mikroskopi ve özel yazılım ile astrosit morfolojisini inceleyin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Mikroskopi, kısmen NIH-NINDS Sinirbilim Merkezi Destek Hibe P30 NS045892 ve NIH-NICHD Zihinsel ve Gelişimsel Engelliler Araştırma Merkezi Destek Hibe U54 HD079124'ün finansmanıyla desteklenen UNC Sinirbilim Mikroskopi Çekirdeğinde (RRID: SCR_019060) gerçekleştirildi. Şekil 1, BioRender.com ile oluşturulmuştur. Şekil 4'teki görüntüler ve veriler, yayımcının izniyle önceki bir yayın9'dan yeniden yazdırılmıştır.

<ol><li>Stogsdill, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytic+neuroligins+control+astrocyte+morphogenesis+and+synaptogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Astrocytic neuroligins control astrocyte morphogenesis and synaptogenesis.</a> Nature. 551 (7679), 192-197 (2017).</li>
<li>Akdemir, E. S., Huang, A. Y., Deneen, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytogenesis%3A+where%2C+when%2C+and+how%5BTitle%5D)+AND+%22F1000Research%22%5BJournal%5D)">Astrocytogenesis: where, when, and how.</a> F1000Research. 9, F1000 Faculty Rev-233 (2020).</li>
<li>Bushong, E. A., Martone, M. E., Jones, Y. Z., Ellisman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protoplasmic+astrocytes+in+CA1+stratum+radiatum+occupy+separate+anatomical+domains%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%3A+The+Official+Journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Protoplasmic astrocytes in CA1 stratum radiatum occupy separate anatomical domains.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 22 (1), 183-192 (2002).</li>
<li>Houades, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shapes+of+astrocyte+networks+in+the+juvenile+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron+Glia+Biology%22%5BJournal%5D)">Shapes of astrocyte networks in the juvenile brain.</a> Neuron Glia Biology. 2 (1), 3-14 (2006).</li>
<li>Zuchero, J. B., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glia+in+mammalian+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Glia in mammalian development and disease.</a> Development. 142 (22), 3805-3809 (2015).</li>
<li>Srinivasan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+transgenic+mouse+lines+for+selectively+targeting+astrocytes+and+studying+calcium+signals+in+astrocyte+processes+in+situ+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">New transgenic mouse lines for selectively targeting astrocytes and studying calcium signals in astrocyte processes in situ and in vivo.</a> Neuron. 92 (6), 1181-1195 (2016).</li>
<li>Testen, A., Kim, R., Reissner, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+three-dimensional+imaging+of+individual+astrocytes+using+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">High-resolution three-dimensional imaging of individual astrocytes using confocal microscopy.</a> Current Protocols in Neuroscience. 91 (1), 92(2020).</li>
<li>Takano, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemico-genetic+discovery+of+astrocytic+control+of+inhibition+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Chemico-genetic discovery of astrocytic control of inhibition in vivo.</a> Nature. 588 (7837), 296-302 (2020).</li>
<li>Baldwin, K. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HepaCAM+controls+astrocyte+self-organization+and+coupling%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">HepaCAM controls astrocyte self-organization and coupling.</a> Neuron. 109 (15), 2427-2442 (2021).</li>
<li>Amberg, N., Hippenmeyer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+mosaic+dissection+of+candidate+genes+in+mice+using+mosaic+analysis+with+double+markers%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">Genetic mosaic dissection of candidate genes in mice using mosaic analysis with double markers.</a> STAR Protocols. 2 (4), 100939(2021).</li>
<li>Dumas, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+utero+electroporation+of+multiaddressable+genome-integrating+color+%28MAGIC%29+markers+to+individualize+cortical+mouse+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">In utero electroporation of multiaddressable genome-integrating color (MAGIC) markers to individualize cortical mouse astrocytes.</a> Journal of visualized experiments: JoVE. (159), e61110(2020).</li>
<li>Garcia-Marques, J., Nunez-Llaves, R., Lopez-Mascaraque, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NG2-glia+from+pallial+progenitors+produce+the+largest+clonal+clusters+of+the+brain%3A+time+frame+of+clonal+generation+in+cortex+and+olfactory+bulb%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%3A+The+Official+Journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">NG2-glia from pallial progenitors produce the largest clonal clusters of the brain: time frame of clonal generation in cortex and olfactory bulb.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 34 (6), 2305-2313 (2014).</li>
<li>Clavreul, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+astrocytes+develop+in+a+plastic+manner+at+both+clonal+and+cellular+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">Cortical astrocytes develop in a plastic manner at both clonal and cellular levels.</a> Nature Communication. 10 (1), 4884(2019).</li>
<li>O'Donnell, J., Ding, F., Nedergaard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+functional+states+of+astrocytes+during+sleep+and+wakefulness%3A+Is+norepinephrine+the+master+regulator%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Sleep+Medicine+Reports%22%5BJournal%5D)">Distinct functional states of astrocytes during sleep and wakefulness: Is norepinephrine the master regulator.</a> Current Sleep Medicine Reports. 1 (1), 1-8 (2015).</li>
</ol>

Yazarların çıkar çatışması yoktur.

Bu protokol, fare korteksindeki astrosit bölgesi hacmini ve astrosit döşemesini analiz etmek için kurulmuş bir yöntemi açıklar ve perfüzyonla başlayan ve görüntü analizi ile biten tüm önemli adımları detaylandırır. Bu protokol, seyrek veya mozaik bir astrosit popülasyonunda floresan proteinleri eksprese eden farelerden beyinler gerektirir. Bu gereksinimin dışında, bu protokol için her yaştan fare kullanılabilir, perfüzyon ayarlarında sadece küçük ayarlamalar yapılır ve gömme kalıbına eklenen dondurucu ortamın hacmi kulla...

Astrositler, beyinde birçok önemli işlevi yerine getiren özenle dallanmış hücrelerdir1. Fare korteksinde, radyal glial kök hücreler, geç embriyonik ve erken doğum sonrası aşamalarda astrositlere yol açar2. Doğum sonrası ilk üç hafta boyunca, astrositler boyut ve karmaşıklık bakımından büyür ve sinapslarla doğrudan etkileşime giren binlerce ince dal geliştirir1. Aynı zamanda, astrositler komşu astrositlerle etkileşime girerek beynidöşemek için ayrık, örtüşmeyen bölgeler oluşturur 3, aynı zamanda boşluk kavşak kanalları4 aracılığıyla iletişimi sürdürür. Astrosit morfolojisi ve organizasyonu, hakaret veya yaralanma5'i takiben birçok hastalık durumunda bozulur ve bu süreçlerin uygun beyin fonksiyonu için önemini gösterir. Normal gelişim, yaşlanma ve hastalık sırasında astrosit morfolojik özelliklerinin analizi, astrosit biyolojisi ve fizyolojisi hakkında değerli bilgiler sağlayabilir. Ayrıca, genetik manipülasyonu takiben astrosit morfolojisinin analizi, astrosit morfolojik karmaşıklığının kurulmasını ve sürdürülmesini yöneten hücresel ve moleküler mekanizmaları ayırt etmek için değerli bir araçtır.
Fare beynindeki astrosit morfolojisinin analizi, hem astrosit dallanma karmaşıklığı hem de astrosit döşemesi ile karmaşıktır. Astrosit-spesifik bir belirteç olarak ara filament glial fibriler asidik proteini (GFAP) kullanan antikor boyaması, sadece ana dalları yakalar ve astrosit morfolojik karmaşıklığını büyük ölçüde hafife alır1. Glutamat taşıyıcı 1 (GLT-1; slc1a2), glutamin sentetaz veya S100β gibi diğer hücreye özgü belirteçler, astrosit dalları6'yı etiketlemek için daha iyi bir iş çıkarır, ancak yeni bir sorun ortaya çıkarır. Astrosit bölgeleri büyük ölçüde örtüşmez, ancak periferik kenarlarda küçük bir örtüşme derecesi vardır. Dallanmanın karmaşıklığı nedeniyle, komşu astrositler aynı renkte etiketlendiğinde, bir astrositin nerede bittiğini ve diğerinin nerede başladığını ayırt etmek imkansızdır. Astrositlerin endojen floresan proteinlerle seyrek veya mozaik etiketlenmesi her iki sorunu da çözer: floresan işaretleyici, tüm dalları yakalamak için hücreyi doldurur ve komşularından ayırt edilebilen bireysel astrositlerin görüntülenmesine izin verir. Viral enjeksiyon, plazmid elektroporasyonu veya transgenik fare çizgileri dahil olmak üzere genetik manipülasyon olsun veya olmasın, astrositlerin seyrek floresan etiketlemesini sağlamak için birkaç farklı strateji kullanılmıştır. Bu stratejilerin uygulanmasına ilişkin ayrıntılar daha önce yayınlanmış çalışmalarda veprotokoller 1,7,8,9,10,11,12,13'te açıklanmıştır.
Bu makalede, seyrek bir astrosit popülasyonunda floresan etiketleme ile fare beyinlerinden astrosit bölgesi hacmini ölçmek için bir yöntem açıklanmaktadır (Şekil 1). Fare korteksindeki bir astrositin ortalama çapı yaklaşık 60 μm olduğundan, bireysel astrositleri bütünüyle yakalamadaki verimliliği artırmak için 100 μm kalınlığında bölümler kullanılır. İmmünoboyama gerekli değildir, ancak konfokal görüntüleme ve analiz için endojen floresan sinyalini arttırmak için önerilir. İmmün boyama ayrıca ince astrosit dallarının daha iyi tespit edilmesini sağlayabilir ve görüntü elde etme sırasında endojen proteinlerin fotobeyazlatmasını azaltabilir. Kalın kesitlere antikor penetrasyonunu arttırmak ve doku hacmini görüntüleme yoluyla kesitlemeden korumak için serbest yüzen doku kesitleri kullanılır. Astrosit bölgesi hacminin analizi, ticari olarak temin edilebilen görüntü analiz yazılımı kullanılarak gerçekleştirilir. Ek olarak, bu protokol, komşu astrositlerin farklı floresan etiketlerini ifade ettiği mozaik etiketli doku kesitlerinde astrosit döşemesinin analizi için bir yöntemi açıklamaktadır. Bu protokol, normal beyin gelişimi sırasında astrosit büyümesini ve genetik manipülasyonun astrosit gelişimi üzerindeki etkisini karakterize etmek için 1,8,9 numaralı son çalışmalarda başarıyla kullanılmıştır.

<table><tbody><tr><td>#5 forseps</td><td>Roboz</td><td>RS-5045</td><td></td></tr><tr><td>1 mL TB Şırınga</td><td>Becton Dickinson (BD)</td><td>309623</td><td></td></tr><tr><td>10x TBS (tris-tamponlu salin)</td><td></td><td></td><td>30 g Tris, 80 g NaCl, 2 g KCl, HCl ila pH 7.4, dH2O ila 1 L; oda sıcaklığında saklayın (RT)</td></tr><tr><td>12 oyuklu plaka</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-106MP</td><td></td></tr><tr><td>1x TBS</td><td></td><td></td><td>100 mL 10x TBS + 900 mL dH<alt>2</alt>O; RT</td></tr><tr><td>1x TBS + Heparin</td><td></td><td></td><td>28.2 mg Heparin + 250 mL 1x TBS'de saklayın; 4 & derecede saklayın; C</td></tr><tr><td>24 oyuklu plaka</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-107MP</td><td></td></tr><tr><td>TBS'de</td><td></td><td></td> %30 <td>Sükroz 15 g sükroz, 1x TBS ila 50 mL; 4 &°C'de saklayın; TBS</td></tr><tr><td></td><td></td><td>40 g PFA,</td><td>4-6 NaOH peletleri, 100 mL 10x TBS, dH2O ila 1 L'de C%4 PFA (paraformaldehit); 4 &°C'de saklayın; C</td></tr><tr><td>Avertin</td><td></td><td></td><td>0.3125 g tri-bromoetanol, 0.625 mL metilbutanol, dH2O ila 25 mL; 4 ° C'de saklayın; C; yaptıktan 2 hafta sonra atın</td></tr><tr><td>Bloke etme ve antikor tamponu</td><td></td><td></td><td>TBST'de% 10 keçi serumu; 4 ° C'de saklayın; C</td></tr><tr><td>CD1 fareler</td><td>Charles River</td><td>022</td><td></td></tr><tr><td>Beyinler için toplama şişesi</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-337-20</td><td></td></tr><tr><td>Konfokal edinim yazılımı</td><td>Olympus</td><td>FV31S-SW</td><td></td></tr><tr><td>Konfokal mikroskop</td><td>Olympus</td><td>FV3000RS</td><td></td></tr><tr><td>Lameller</td><td>Fisher Scientific</td><td>12544E</td><td></td></tr><tr><td>Kriyostat</td><td>Termo Scientific</td><td>CryoStar NX50</td><td></td></tr><tr><td>Kriyostat bıçağı</td><td>Thermo Scientific</td><td>3052835</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Gömme kalıp</td><td>Polysciences</td><td>18646A-1</td><td></td></tr><tr><td>Donma Ortamı</td><td></td><td></td><td>2:1 %30 sükroz:OCT; RT</td></tr><tr><td>GFP antikoru</td><td>Aves Labs'ta</td> saklayın <td>GFP1010</td><td></td></tr><tr><td>Gliserol</td><td>Thermo Scientific</td><td>158920010</td><td></td></tr><tr><td>Keçi anti-tavuk 488</td><td>Invitrogen</td><td>A-11039</td><td></td></tr><tr><td>Keçi anti-tavşan 594</td><td>Invitrogen</td><td>A11037</td><td></td></tr><tr><td>Keçi Serumu</td><td>Gibco</td><td>16210064</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3149</td><td></td></tr><tr><td>Hidroklorik asit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>258148</td><td></td></tr><tr><td>Imaris</td><td>Bitplane</td><td>N/A</td><td>Sürüm 9.8.0</td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MathWorks</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Amazon'dan metal öğle yemeği tenekesi</td><td>KOVA</td><td>N/A</td><td>, "DIY Büyük Eğlence Kutusu"</td></tr><tr><td>Metilbutanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>152463</td><td></td></tr><tr><td>Mikro Diseksiyon Makası</td><td>Roboz</td><td>RS-5921</td><td></td></tr><tr><td>Montaj ortamı</td><td></td><td></td><td>20 mM Tris pH 8.0, %90 Gliserol, %0.5 N-propil gallat; 4 & deg'de saklayın; C; 2 aya kadar iyi</td></tr><tr><td>Oje</td><td>VWR</td><td>100491-940</td><td></td></tr><tr><td>N-propil gallat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>02370-100G</td><td></td></tr><tr><td>O.C.T.</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-730-571</td><td></td></tr><tr><td>Yağ</td><td>Olympus</td><td>IMMOIL-F30CC</td><td>Mikroskop/objektife özel</td></tr><tr><td>Ameliyat Makası 6"</td> <td>Roboz</td><td>RS-6820</td><td></td></tr><tr><td>Orbital platform çalkalayıcı</td><td>Fisher Scientific</td><td>88861043</td><td>Gerekli minimum hız: 25 rpm</td></tr><tr><td>Boya Fırçası</td><td>Bogrinuo</td><td>N/A</td><td>Amazon'dan, "Detay Boya Fırçaları - Minyatür Fırçalar"</td></tr><tr><td>Paraformaldehit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Pastör pipeti (5.75")</td><td>VWR</td><td>14672-608</td><td></td></tr><tr><td>Pastör pipeti (9")</td><td>VWR</td><td>14672-380</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum klorür</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541-500G</td><td></td></tr><tr><td>Tıraş bıçağı</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-640</td><td></td></tr><tr><td>RFP antikor</td><td>Rockland</td><td>600-401-379</td><td></td></tr><tr><td>Kesit ortamı</td><td></td><td></td><td>1: 1 gliserol: 1x TBS; RT Slides'ta saklayın</td></tr><tr><td></td><td>VWR</td><td>48311-703</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum chrloide</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358-212</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum hidroksit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5881</td><td></td></tr><tr><td>Sükroz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>TBST (TBS + Triton X-100)</td><td></td><td></td><td>1x TBS'de %0,2 Triton; RT</td></tr><tr><td>Transfer Pipetinde</td> saklayın <td>VWR</td><td>414004-002</td><td></td></tr><tr><td>Tri-bromoetanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T48402</td><td></td></tr><tr><td>Tris(hidroksimetil)aminometan</td><td>Termo Bilimsel</td><td>424570025</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>93443</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100 ( yüksek kaliteli)</td> <td>Fisher Scientific</td><td>50-489-120</td><td></td></tr><tr><td>XTSpotsConvexHull</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>özel XTension ek materyal olarak sağlar</td></tr></tbody></table>

astrosit bölgesi hacminin analizi ve kalın serbest yüzen doku kesitlerinde döşeme

Analysis of Astrocyte Territory Volume and Tiling in Thick Free-Floating Tissue Sections

Astrositler, beyindeki hemen hemen her tür hücre ve yapı ile etkileşime girmelerini sağlayan şaşırtıcı derecede morfolojik karmaşıklığa sahiptir. Bu etkileşimler sayesinde, astrositler sinaps oluşumu, nörotransmisyon ve iyon homeostazı dahil olmak üzere birçok kritik beyin fonksiyonunu aktif olarak düzenler. Kemirgen beyninde, astrositler doğum sonrası ilk üç hafta boyunca boyut ve karmaşıklık bakımından büyür ve beyni döşemek için farklı, örtüşmeyen bölgeler oluşturur. Bu protokol, fare beyninden serbest yüzen doku kesitleri kullanarak astrosit bölgesi hacmini ve astrosit döşemesini analiz etmek için yerleşik bir yöntem sağlar. İlk olarak, bu protokol serbest yüzen doku kesitlerinin doku toplanması, kriyoseksiyonu ve immün boyama adımlarını açıklar. İkincisi, bu protokol, ticari olarak temin edilebilen görüntü analiz yazılımını kullanarak astrosit bölgesi hacminin ve bölge örtüşme hacminin görüntü alımını ve analizini açıklar. Son olarak, bu makale bu yöntemlerin avantajlarını, önemli hususlarını, ortak tuzaklarını ve sınırlamalarını tartışmaktadır. Bu protokol, astrositlerin seyrek veya mozaik floresan etiketlemeli beyin dokusunu gerektirir ve ortak laboratuvar ekipmanı, konfokal mikroskopi ve ticari olarak temin edilebilen görüntü analiz yazılımı ile kullanılmak üzere tasarlanmıştır.

Şekil 1, bu protokol için ana adımların ve iş akışının şematik bir taslağını sunmaktadır. Şekil 2 , bir yüzey oluşturmak, yüzeye yakın noktalar oluşturmak ve dışbükey bir gövde oluşturmak için görüntü analiz yazılımını kullanan önemli adımların ekran görüntülerini göstermektedir. Şekil 3 , astrosit bölgesi örtüşmesini/döşemesini belirlemek için bu tekniğin uygulanmasını göstermektedir. Şekil 4'te, daha ...

Bu protokol, fare beyninin serbest yüzen doku bölümlerini bölümleme, boyama ve görüntüleme yöntemlerini açıklar, ardından astrosit bölgesi hacminin ve astrosit bölgesi örtüşmesinin veya döşemesinin analizinin ayrıntılı bir açıklaması gelir.

Astrosit Bölgesi Hacminin Analizi ve Kalın Serbest Yüzen Doku Kesitlerinde Döşeme

Astrocytes possess an astounding degree of morphological complexity that enables them to interact with nearly every type of cell and structure within the ...

Astrositlerin karmaşık morfolojilerini nasıl geliştirdiklerini ve kurduklarını anlamak, beynin nasıl geliştiğini ve çalıştığını anlamak için çok önemlidir. Bu protokol, beyin dokusundaki astrosit morfolojisinin temel yönlerinin nasıl analiz edileceğini açıklar. Bu protokol, kalın doku kesitlerinde astrosit bölgesi hacmini ölçmek için özel bir kod kullanır.Bu strateji, komşu astrositler arasındaki bölge çakışması miktarını ölçmek için de uygulanabilir. Bu protokolü astrositlerin genetik manipülasyonu ile birleştirerek, araştırmacılar astrosit gelişiminde ve astrosit-astrosit etkileşiminde spesifik proteinlerin ve yolakların rolünü doğrudan araştırabilirler Başlamak için, 50 mililitrelik bir tüpe 1 mililitre% 10 Triton X ekleyerek ve tüpü TBS ile 50 mililitreye doldurarak yeni bir TBST çözeltisi hazırlayın. 15 mililitrelik tüp.Ardından, farklı sütunlardaki farklı çözeltilerde farklı sıralara farklı numuneler yerleştirmek için 24 delikli bir plakayı etiketleyin, ardından yıkama 1, 2 yıkama ve yıkama 3 olarak etiketlenmiş ilk üç sütuna bir mililitre TBST ekleyin ve dördüncü sütuna 1 mililitre blokaj çözeltisi ekleyin. 5,75 inçlik bir Pasteur pipetinin ucunu bir Bunsen brülörü kullanarak küçük bir kancada eriterek bir cam toplama hazırlayın, ardından doku bölümlerini 12 delikli plakadan 24 delikli plakanın yıkama 1 sütununa aktarın, ardından bölümleri yıkama 1, 2'de her biri 10 dakika boyunca yıkayın, ve bölümleri bir kuyudan diğerine aktarmak için cam toplama kullanarak 3 kuyucuk, ardından bölümleri blokaj çözeltisinde bir saat boyunca inkübe edin. Antikoru antikor çözeltisine ekleyerek q mililitre birincil antikor çözeltisi hazırlayın, ardından kısaca vorteks yapın ve 4 santigrat derecede 4.000 kez g'ye eşit veya daha büyük 5 dakika boyunca santrifüj yapın.Daha sonra, sallanırken bölümleri 2 ila 3 gece boyunca 4 santigrat derecede primer antikorda inkübe edin. Birincil antikor inkübasyonundan sonra, yıkama kuyularından gün-1 TBST'yi aspire edin, daha sonra her yıkama kuyusuna 1 mililitre yeni TBST ekleyin ve bölümleri ilk yıkama kuyusuna taşıyın. Daha sonra, sekonder antikordaki bölümleri oda sıcaklığında 3 saat boyunca inkübe edin.İkincil antikor inkübasyonundan sonra, gün-2 TBST'yi yıkama kuyularından aspire edin, ardından her yıkama kuyusuna 1 mililitre yeni TBST ekleyin ve bölümleri ilk yıkama kuyusuna taşıyın. Son yıkama sırasında, montaj ortamını 4 santigrat dereceden çıkarın ve oda sıcaklığına ısınmasına izin verin, ardından 2'ye 1 TBS ve deiyonize su karışımı hazırlayın ve bir Petri kabına ekleyin. Daha sonra, yüzeye 800 mikrolitre 2'ye 1 TBS karışımı ve deiyonize su ekleyerek bir mikroskop slaytı hazırlayın.Bölümleri yıkama 3 kuyusundan Petri kabına aktarın, daha sonra ince bir boya fırçası kullanarak, bölümleri Petri kabından slayttaki sıvıya birer birer aktarın. Ardından, bölümleri boya fırçasını kullanarak slaytta düz olacak şekilde dikkatlice düzenleyin. Slayttaki fazla sıvıyı bir P-1000 pipetle dikkatlice çıkarın ve ardından vakum aspirasyonu uygulayın.Slayttan tüm fazla sıvı çıkarıldıktan sonra, her bölüme hemen 1 damla montaj malzemesi eklemek için bir transfer pipeti kullanın ve yavaşça kızağın üzerine bir kapak kayması yerleştirin. Montaj ortamının birkaç dakika yayılmasına izin verin ve ardından kapağın altından çıkan fazla montaj ortamını vakum aspirasyonu ile çıkarın. Daha sonra, kapak kaymasının dört kenarını da şeffaf oje ile kapatın.Slaytları oda sıcaklığında 30 dakika kurumaya bırakın ve ardından 4 santigrat derecede düz bir şekilde saklayın. 10x hedefi kullanarak, görüntüleme için tek tek hücreleri bulun ve deneyle ilgili belirli beyin bölgesini veya alt bölgesini not edin, ardından odak düğmesini kullanarak, tüm astrositin bölüm içinde bulunup bulunmadığını belirleyin. Daha sonra, daha yüksek büyütmeli bir yağ hedefine geçin ve hücreyi odaklayın.Göz merceğinden bakarken, hücrenin üstünden altına doğru hareket etmek için odak düğmesini kullanın, ardından tüm hücrenin bölüm içinde bulunduğundan emin olmak için hücreyi görsel olarak inceleyin. Konfokal mikroskoplarla ilişkili yakalama yazılımını kullanarak, uygun bir sinyal-gürültü oranı ve ayrıntı seviyesi elde etmek için edinme parametrelerini ayarlayın, ardından 40x hedefi için 2x yakınlaştırma kullanın ve 60x veya 63x hedef kullanıyorsanız yakınlaştırma kullanmayın. Z-yığınının üst ve alt sınırlarını 0,5 mikrometrelik bir adım boyutuyla ayarlayın ve tüm astrositin hücrenin herhangi bir floresan etiketlemesi olmadan ilk ve son görüntülerle yakalanmasını sağlayın.Analize başlamadan önce, dosyayı XT klasörünün rtmatlab alt klasörüne yapıştırarak dışbükey gövde uzantısı dosyası XtspotsConvexHull'u yükleyin. Imaris Dosya Dönüştürücüsü'nü kullanarak görüntüleri IMS formatına dönüştürün. Ardından, görüntü analiz yazılımında bir görüntü dosyası açın ve hücrenin dahil etme kriterlerini karşıladığından emin olmak için görüntüyü 3B modunda görüntülemek için 3B Görünüm düğmesini seçin.Bir yüzey oluşturmak için mavi Yeni Yüzeyler Ekle simgesini tıklayın, ardından yüzey oluşturma aracının boyutunun altındaki kutulara boyutlar girerek veya sarı kutunun kenarlarını sürükleyerek hücrenin etrafında ilgi çekici bir bölge oluşturun. Ardından, sarı çubuğu sürükleyerek veya kutuya değerler girerek Eşik Mutlak Yoğunluğunu ayarlayın, böylece gri yüzey hücre sınırının ötesine geçmeden hücre sinyalinin mümkün olduğunca çoğunu doldurur. Daha sonra, yüzeyi oluşturmayı bitirmek için yeşil oka tıklayın.Yeni oluşturulan yüzeyi dikkatlice inceleyin ve hücrenin parçası olmayan yüzey parçalarını seçerek silin, ardından Kalem Düzenleme aracına ve ardından Sil seçeneğine tıklayın. Kalan yüzey parçalarını birleştirmek için, tümünü seçmek için Huni Filtresi simgesine tıklayın, ardından Kalem Düzenle simgesine tıklayın ve Birleştir seçeneğini belirleyin. Turuncu Yeni Noktalar Ekle simgesine tıklayın ve açılır listeden doğru kaynak kanalı seçin ve ardından kutuya tahmini XY çap değeri 0,400 mikrometre girin.Ardından, noktaları oluşturmayı tamamlamak için yeşil oka tıklayın, ardından noktaları yeniden seçin. Filtre simgesini tıklatın ve açılır listeden analiz edilen yüzey X yüzeylerinin bulunduğu Yüzeylere En Kısa Mesafe X Yüzeyleri'ni seçerek hem alt eşik hem de üst eşik güç düğmelerinin yeşil olmasını sağlayın. Ardından, alt eşik kutusuna minimum eksi 1,0 mikrometre mesafe ve üst eşik kutusuna maksimum 0,1 mikrometre mesafe girin, ardından yeni oluşturulan noktaların yazılım penceresinin sol üst panelinde seçildiğinden emin olmak için Bölümü Yeni Noktalara Çoğalt düğmesine tıklayın.Daha sonra, Dişli Aletleri simgesine tıklayın ve ardından Dışbükey Gövde eklentisine yalnızca bir kez tıklayın ve MATLAB penceresinin görünmesini bekleyin ve ardından 3B görünümde sağlam bir gövdeyle sonuçlanan kayboldu. Sol üst panelde, X Noktalarının Dışbükey Gövdesi, X Seçimlerinin Yeni Oluşturulan Noktalar olduğu En Kısa Mesafe seçildiğinden emin olun ve ardından seçmek için gövdeye tıklayın. Ardından, Grafik İstatistikleri simgesine tıklayın.Seçim sekmesinde, üstteki açılır listeden Belirli Değerler'in seçildiğinden emin olun ve ardından alt açılır listeden Ses Düzeyi'ni seçin, ardından gövdenin ses düzeyini kaydedin ve bir sonraki görüntüye geçerek dosyayı kaydedin. Astrosit bölgesi hacmi, membran hedefli kırmızı floresan proteinini ifade eden astrositlerde ölçüldü. Astrositle zenginleştirilmiş hücre adezyon molekülü hepaCAM'in yıkılması, astrosit bölgesi hacmini önemli ölçüde azaltır.Çift işaretleyicili mozaik analizi, vahşi tip astrositlerin kırmızı bir floresan proteinini ve hepaCam nakavt astrositlerinin yeşil bir floresan proteinini ifade ettiği fareler üretmek için kullanıldı. Komşu kırmızı ve yeşil floresan protein astrosit çiftleri arasındaki bölge örtüşme yüzdesi hesaplandı. HepaCAM ve yeşil astrositlerin genetik modifikasyonuna sahip fareler, sadece vahşi tip astrosit çiftlerine kıyasla, kırmızı vahşi tip komşularıyla bölge örtüşme hacminin önemli ölçüde arttığını gösterdi.Bu sonuç, hepaCAM'in normal astrosit bölgesi hacmi ve astrosit döşemesi için gerekli olduğunu göstermektedir. Hücrenin dahil etme kriterlerini karşıladığından emin olmak çok önemlidir. Tamamlanmamış bir hücre daha küçük bir bölge hacmine sahip olacak ve genel sonuçlarınızı ve sonuçlarınızı etkileyebilir.

analysis-astrocyte-territory-volume-tiling-thick-free-floating-tissue

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Bu video, birincil ve ikincil antikorlar kullanılarak floresan olarak işaretlenmiş astrositlerle sabit bir fare beyin dokusu bölümünün immün boyama prosedürünü gösterir ve konfokal mikroskopi yoluyla lekeli astrositlerin görüntülerini yakalar.

Bir Fare Beyin Dokusu Bölümünde Floresan Etiketli Astrositlerin İmmün Boyanması

Kaynak: Moye, S. L., et.al.  Lucifer Sarı İyontoforezi Kullanarak Astrosit Morfolojisinin Görselleştirilmesi. J. Vis. Uzm.  (2019).  Bu video, sabit beyin dilimlerinde astrosit morfolojisini incelemek için floresan boya iyontoforezinin kullanımını göstermektedir. Düşük voltajlı bir akım altında sitoplazmaya anyonik, hidrofilik bir boya vermek için astrosit soma'nın bir elektrotla delinmesini detaylandırır, bu da boyanın soma ve dalları yaymasını ve etiketlemesini sağlar. Konfokal mikroskopi...

Sabit Bir Fare Beyin Diliminde Floresan Boya İyontoforezi Kullanılarak Astrosit Morfolojisinin Görselleştirilmesi

Kaynak: Bagheri, M., et. al. Astrositlerin Üç Boyutlu Konfokal Morfometrik Analizi için Protokol. J. Vis. Uzm. (2015).Bu video, konfokal bir mikroskop kullanılarak bir fare beyni bölümünde floresan olarak işaretlenmiş astrositlerin görüntülenmesini göstermektedir. Beyin bölümü uygun objektif merceğin altına yerleştirilir ve uygun floroforlar ve filtreler seçilir. Pozlamayı otomatik olarak optimize ettikten sonra, yüksek çözünürlüklü 2D görüntüler sağlamak için tarama parametreleri tanımlanır.

İmmün Etiketli Astrositlerin Konfokal Mikroskopi Kullanılarak Üç Boyutlu Görüntülenmesi

CNS'deki astrositler, zararlı uyaranlara yanıt olarak fonksiyonel ve yapısal özelliklerini değiştirir. Bu rapor, hastalıklı durumlarda veya terapötik müdahaleler sonrasında üç boyutlu astrosit morfolojisinin değerlendirilmesi için bir protokol sunmaktadır.

Astrositler Üç boyutlu Konfokal Morfometrik Analizi Protokolü

Burada astrositik ağlar organizasyonu değerlendirmek için bir protokol mevcut. Açıklanan yöntemi hücre sayısı, boyutu, alan ve bir çekirdek içinde pozisyon gibi bu ağların açıklayıcı ölçüleri sağlamak için önyargı en aza indirir. Anizotropi vektörel bir analizi ile değerlendirilir.

Boyut, şekil ve yön ağlar yönetim eşleşmiş Astrocytes analiz

Açıklanan boru hattı, gigabaytlardan daha büyük elektron mikroskobu veri kümelerinin tüm hücre morfolojilerini ayıklamak için segmentasyonu için tasarlanmıştır. Hücreler 3B olarak yeniden oluşturulduktan sonra, bireysel ihtiyaçlar etrafında tasarlanmış özelleştirilmiş yazılım, görüntüleme tıkanıklığının üstesinden gelmek için sanal gerçekliği kullanarak doğrudan 3D olarak nitel ve nicel bir analiz yapmak için kullanılabilir.

Glial ve Nöronal Hücrelerin 3D Rekonstrüksiyonu ve Sanal Gerçeklik Analizi Için Bir Yöntem

Astrositler morfolojik olarak karmaşık hücrelerdir, çoklu süreçleri ve gür bölgeleri ile örneklenirler. Ayrıntılı morfolojilerini analiz etmek için, hafifçe sabit dokuda hücre içi Lucifer sarı iontoforezi gerçekleştirmek için güvenilir bir protokol salıyoruz.

Lucifer Sarı İontoforez kullanarak Astrosit Morfolojisini Görselleştirme

Burada, organellerin hücre içi naklini ve murine astrositlerinde plazma membran proteinlerinin ticaretini görselleştirmek için in vitro canlı görüntüleme yöntemini açıklıyoruz. Bu protokol aynı zamanda kargo taşımacılığı güzergahları ve kinetik belirlemek için bir görüntü analizi metodolojisi sunar.

Astrositlerde Organeller ve Diğer Kargoların Hücre İçi Taşınmasının Görselleştirilmesi ve Analizi

Astrositler serebral korteksi düzgün bir şekilde döşer ve karmaşık morfolojilerinin analizini hücresel düzeyde zorlaştırır. Burada sağlanan protokol, kortikal astrositleri ayırmak ve hacimlerini ve morfolojilerini kullanıcı dostu bir görüntü analizi ardışık düzeni ile analiz etmek için rahim elektroporasyonunu temel alan çok renkli etiketleme kullanır.

Kortikal Fare Astrositlerini Bireyselleştirmek için Çok Elbiseli Genom Bütünleştirici Renk (MAGIC) İşaretçilerinin Utero Elektroporasyonunda

CLARITY yöntemini kullanarak viral vektör iletimini ve beyin temizlemeyi birleştirmek, aynı anda çok sayıda nöron ve astrositin araştırılmasına izin verir.

Temizlenmiş Beyinlerde Astrositler ve Nöronlar Arasındaki Mekansal Etkileşimin İncelenmesi

Öğrenin fare beyni kalın serbest yüzen doku kesitlerinde astrosit bölgesi hacmi ve örtüşme analizi yapmayı. Konfokal mikroskopi ve özel yazılım ile astrosit morfolojisini inceleyin.

Astrosit Bölgesi Hacminin Analizi ve Kalın Serbest Yüzen Doku Kesitlerinde Döşeme

Daha fazla video keşfet