Astrositler Üç boyutlu Konfokal Morfometrik Analizi Protokolü
December 11th, 2015
CNS'deki astrositler, zararlı uyaranlara yanıt olarak fonksiyonel ve yapısal özelliklerini değiştirir. Bu rapor, hastalıklı durumlarda veya terapötik müdahaleler sonrasında üç boyutlu astrosit morfolojisinin değerlendirilmesi için bir protokol sunmaktadır.
Bu prosedürün genel amacı, konfokal mikroskopi ile elde edilen astrositlerin üç boyutlu görüntülerini analiz ederek astrosit morfolojisini değerlendirmektir. Bu yöntem, patolojik durumlarda veya bir müdahale stratejisinin etkisi olarak çeşitli hücre tiplerinde ortaya çıkabilen morfolojik değişiklikleri değerlendirmek için kullanılabilir. Bu tekniğin temel avantajı, hücresel mimari ile ilişkili birçok parametrenin aynı anda incelenebilmesidir.
Dr.Mariam Bodel bu prosedürü gösterecektir: İmmünohistokimyasal boyama için slaytların hazırlanmasını takiben, 10 dakika boyunca iki kez ksilene batırılarak bölümler ayırın. Yıkadıktan sonra bölümleri yeniden sulandırmak için slaytları %99.8 ve %70 etanolün her birinde 10 dakika inkübe edin. PBS, slaytları gece boyunca dört santigrat derecede bir ila 1500 glial fibriler asidik protein veya GFAP birincil antikor çözeltisi seyreltmesinde inkübe eder.
İnkübasyondan sonra, bölümleri PB S3'te beş dakika boyunca yıkayın. Daha sonra slaytları bir ila 100 alkalin fosfataz konjuge ikincil antikor çözeltisi ile oda sıcaklığında bir saat inkübe edin. Yine, kullanmadan önce 30 dakikadan daha kısa bir süre boyunca, PB S3'teki bölümü beş kez yıkayın.
Üç mililitre substrat tamponuna bir damla kırmızı kromojen çözeltisi ekleyin. Her slaytı bu çözeltinin 100 mikrolitresinde karanlıkta 15 ila 20 dakika inkübe edin. Ardından slaytları PB S3'te beş dakika boyunca yıkayın.
Son olarak, çekirdekleri PBS'de bir ila 500 oranında seyreltilmiş DPI ile boyayın. Bölüme bir ila iki damla Antifa ortamı uygulayın ve hemen bir kapak fişi ile kapatın. Sızdırmazlığı sağlamak için slaytları mikroskopiden önce 24 ila 48 saat boyunca dört santigrat derecede inkübe edin.
Konfokal mikroskobu başlatmak için, mikroskop tablasına bir slayt yerleştirin ve 63 x objektifi seçin. Edinme yazılımını açtıktan sonra, edinme sekmesindeki akıllı kuruluma tıklayın ve uygun dörtlü katı seçin. Burada, dappy ve Alexa, kat 5 55 kullanılır.
Ardından, en iyi sinyale ve ardından uygula'ya tıklayın. Ardından, bilgisayarın en uygun pozlama parametrelerini belirlemesine izin vermek için pozlamayı ayarla'ya tıklayın Görüntüyü optimize etmek için kanallar penceresini açın ve görüntüyü canlı olarak değiştirin. Gerekirse odağı ayarlayın.
Ardından iğne deliğini optimize etmek için bir au'ya tıklayın, kazancı en iyi yoğunluk için ayarlayın. Son olarak, dijital kazancı iki ile üç arasında ayarlayın. Bu optimizasyondan sonra, canlı görüntüyü durdurun ve çekim modu penceresini açın.
X x Y'ye tıklayarak çerçeve boyutunu ayarlayın ve 10 24 x 10 24'ü seçin. Ayrıca yavaş bir hız seçin. Ardından, ortalama sekmesini açın ve dörtten büyük veya dörte eşit bir sayı seçin.
Ardından tutturma düğmesine tıklayın ve yakalanan 2D görüntüyü kaydedin. 3D görüntülemeyi ayarlamak için akıllı kurulum sekmesini açın ve Zs yığını öğesini işaretleyin, bu Zs yığını penceresinin açılmasına neden olacaktır. Zack'in ilk ve son konumlarını ayarlamak için tekrar canlı'ya tıklayın ve odağı astrositin en üst konumuna ayarlayın.
Önce sete tıklayın. Şimdi odağı astrositin en alt konumuna ayarlayın ve en son ayarla'ya tıklayın, ardından canlı görüntüyü durdurun. Ardından, optimal'e tıklayarak aralığı seçin.
Buradaki dilim sayısını ayarlamak için aralık 1.01 mikrometredir. Son olarak, başlat'a tıklayın, deneyin ve tarama tamamlandıktan sonra görüntüleri kaydedin. Ayrıca, 10 x veya 20 x objektif kullanarak bir 2D görüntü elde edin.
Floresan yoğunluğu ölçümleri için, görüntü penceresinde dikdörtgen veya daire aracını seçin ve astrosit çekirdeği soma hücre gövdesi ve bölgesinin hacmini ve yüzey alanını ölçmek için ölçüm için bir alanı vurgulayın. 3D görüntüleri, analiz yazılımındaki Velocity 6.1 gibi uygun bir analiz yazılım programına aktarın. Yeni bir kitaplık oluşturun ve tüm görüntüleri sol gri sütuna sürükleyin.
Bir 3D görüntü seçin ve dapi gibi edinilen ilgi alanlarından birini açın. Nükleer ölçümlerde, kontrastı optimize etmek için parlaklığı manuel olarak ayarlayın. Şimdi araçlar menüsünü seçin.
Hacim yap'ı seçin ve Zack görüntülerinden tek bir 3B görüntü oluşturun. Düzenle menüsünü açın ve özelliklere tıklayın. X, Y ve Z özelliklerinin görüntülendiğinden emin olun.
Bunu takiben, araç çubuğundan serbest ROI aracını seçin. Seçilen aracı kullanarak, astrosit çekirdeğinin hacmini ve yüzey alanını ölçmek için DPI etiketli çekirdeğin etrafına bir çizgi çizin. Yine freehand ROI aracını kullanarak, tüm dalların yüzeyini takip eden somanın etrafına bir çizgi çizerek tüm astrositin hacmini ve yüzey alanını ölçün.
Görüntü penceresinin üst kısmındaki ölçümler menüsüne tıklayın, nesneleri bul'u pencerenin üst kısmına sürükleyin ve bir popülasyona açıklayıcı bir ad verin, ilgili rengi seçin ve yeni bir pencere açacak olan ölç'e tıklayın. Bu yeni pencerede. Parametre olarak hacim veya yüzey alanını seçin ve Tamam'ı tıklayın.
Verileri kaydetmek için ölçüm menüsüne tıklayın ve ölçüm öğesi yap'ı seçin. Pencereden çağrılan yeni bir ölçüm öğesi seçin. Veriler için bir dosya adı girin ve Tamam'ı tıklatın.
Son olarak, istatistiksel analiz yapmak ve veri grafikleri oluşturmak için ölçüm verilerini uygun bir yazılım paketine aktarın. Burada araştırmacılar, amiloid beta one 40 veya amiloid beta one 40 ve Ian ile tedavi edilen sıçanlardan alınan sabit beyin dokusundaki astrositleri karşılaştırdılar. Amiloid proteini ile tedavi enjeksiyonu, daha kalın ve daha uzun dallara sahip astrositlerle sonuçlandı.
Ian ile tedavi edilen hayvanlardan elde edilen bu astrositler, kısa ve ince dalları olan bir yıldız formu sergiledi. Ian ile tedavi edilen sıçanlar ayrıca beyin dilimlerinde azalmış astrosit GFAP pozitif floresan gösterdi. Spesifik astrosit hacimlerinin morfometrik analizi, astrosit çekirdeğinin, hücre gövdesinin, tüm astrositin ve astrosit bölgesinin hacminin, tek başına amiloid tedavisine kıyasla Ian tedavisi ile azaldığını ortaya koydu.
Bu görüntüye hakim olduktan sonra, düzgün bir şekilde gerçekleştirilirse analiz tekniği hücre başına birkaç dakika içinde tamamlanabilir. Bu prosedürü denerken, yapıyı yüksek hassasiyetle işaretlemek önemlidir. Geliştirildikten sonra deneye başlamadan önce ilgilenilen yapıyı manuel olarak işaretleme alıştırması yapmak en iyisidir.
Bu teknik, hücre biyolojisi, histoloji ve patoloji alanındaki araştırmacıların sağlıklı veya hastalık ortamında bir hücrenin yapısını keşfetmelerinin yolunu açtı. Bu videoyu izledikten sonra, 3D resimler kullanarak tek bir hücre için 12 farklı parametreyi ölçmeyi iyi anlamış olmalısınız.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Genel Bakış
Bu rapor, konfokal mikroskopi kullanarak üç boyutta astrosit morfolojisini değerlendirmek için bir protokol sunar. Yöntem, patolojik koşullar altında veya tedavi edici müdahalelerin ardından astrositlerdeki morfolojik değişiklikleri değerlendirir.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Hücre Biyolojisi
- Patoloji
Arka Plan
- Merkezi sinir sistemindeki astrositler zararlı uyaranlara tepki olarak değişiklikler gösterir.
- Astrosit morfolojisini anlamak, çeşitli nörolojik koşulları incelemek için önemlidir.
- Bu protokol, çoklu hücresel mimari parametrelerinin eşzamanlı analizini sağlar.
- Konfokal mikroskopi, yüksek çözünürlüklü üç boyutlu görüntüler sağlar.
Çalışmanın Amacı
- Hastalık koşullarında astrosit morfolojisini değerlendirmek.
- Tedavi edici müdahalelerin astrosit yapısı üzerindeki etkilerini değerlendirmek.
- Morfolojik analiz için güvenilir bir protokol geliştirmek.
Kullanılan Yöntemler
- İmmünohistokimyasal boyama için slaytların hazırlanması.
- Ksilien kullanılarak kesitlerin deparafinlendirilmesi.
- Derecelendirilmiş etanol çözeltileri ile kesitlerin rehidrasyonu.
- Astrosit tanımlama için GFAP birincil antikoru ile inkübasyon.
Ana Sonuçlar
- Astrositlerde morfolojik değişikliklerin gösterimi.
- Müdahalelere yanıt olarak yapısal değişikliklerin tanımlanması.
- Gelecek çalışmalar için protokolün doğrulanması.
Sonuçlar
- Protokol, astrosit morfolojisini etkili bir şekilde değerlendirir.
- Bulgular, merkezi sinir sistemi patolojisinde astrosit rollerinin anlaşılmasına katkıda bulunur.
- Gelecekteki uygulamalar, nörolojik hastalıklar için tedavi stratejilerini geliştirebilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Quantitative assessment of astrocyte morphology enables mechanistic de-risking in neurodegenerative target validation by linking structural changes to therapeutic interventions. This 3D confocal morphometric approach supports predictive confidence in early discovery by providing multiparametric readouts that reflect pathway-specific glial responses. The method enhances translational continuity from in vitro or in vivo models to preclinical decision-making through standardized, reproducible imaging workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypothesis by quantifying astrocyte structural remodeling in response to amyloid beta and intervention strategies.
- Operational Value: Enables functional target validation through multiparametric analysis of glial reactivity, reducing mechanistic ambiguity in CNS target engagement.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream workflows by establishing baseline and intervention-induced morphological phenotypes.
- Operational Value: Addresses assay standardization and reproducibility through quantitative 12-parameter morphometric outputs suitable for high-content screening adaptation.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Discusses disease relevance by modeling reactive astrogliosis in amyloid-exposed rat brain tissue, aligning with translational biomarker pathways in neurodegeneration.
- Operational Value: Describes continuity from discovery through preclinical validation by enabling longitudinal tracking of astrocyte structural changes across treatment conditions.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from hypothesis testing to lead identification by providing quantitative glial morphology data that informs target selection and pathway de-risking.
- Discovery Biology: Explains how the method supports hypothesis testing, pathway clarification, or biological de-risking through structural phenotyping of astrocytes in pathological and intervention contexts.
- Screening: Describes assay readiness, reproducibility, or quantitative outputs when supported by the article via standardized 3D imaging and multiparametric analysis.
- Analytics: Highlights measurements, readouts, or statistical outputs that help teams compare conditions, including volume, surface area, branch length, number, fluorescence intensity, and density.
- Translational Research: Connects the method to preclinical continuity or biomarker alignment only when the source supports it via disease-relevant astrocyte reactivity modeling.
- Enterprise Reuse: Frames the method as a reusable capability rather than a single-use technique through standardized imaging and analysis protocols applicable across cell types and conditions.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence, target validation, reduction of mechanistic ambiguity.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions.
Implementation Considerations
- Required scientific expertise in confocal microscopy, immunohistochemical staining, and 3D image analysis.
- Instrumentation and analytical infrastructure needs including confocal microscope with Z-stack capability and 3D analysis software such as Volocity.
- Cross-team standardization requirements for staining protocols, imaging parameters, and morphometric measurement consistency.
- Adaptation considerations across model systems including in vivo and in vitro astrocyte preparations from various species.
- Practical limitations supported by source material including the need for precise manual structure marking and optimization of imaging settings for signal-to-noise ratio.
