Astrositler Üç boyutlu Konfokal Morfometrik Analizi Protokolü

Bu prosedürün genel amacı, konfokal mikroskopi yoluyla elde edilen astrositlerin üç boyutlu görüntülerini analiz ederek astrosit morfolojisini değerlendirmektir. Bu yöntem, çeşitli hücre tiplerinde patolojik koşullar altında veya bir müdahale stratejisinin etkisi olarak ortaya çıkabilen morfolojik değişiklikleri değerlendirmek için kullanılabilir. Bu tekniğin temel avantajı, hücresel mimariyle ilişkili birçok parametrenin eş zamanlı olarak incelenebilmesidir.

Dr. Mariam Bodel bu prosedürü gösterecektir. İmmünohistokimyasal boyama için lamların hazırlanmasını takiben, kesitleri iki kez 10 dakika boyunca ksilen içinde bekleterek deparafinize edin. Yıkama işleminden sonra, kesitleri yeniden hidrate etmek için lamları %99,8, %95 ve %70'lik etanol çözeltilerinin her birinde 10 dakika boyunca inkübe edin. Lamları, 4 °C'de gece boyunca 1:1500 dilüsyondaki glial fibriler asidik protein veya GFAP primer antikor çözeltisi içinde inkübe edin.

İnkübasyonun ardından, kesitleri PB S ile beşer dakikadan üç kez yıkayın. Ardından, lamları 1:100 oranında seyreltilmiş, alkali fosfataz konjuge ikincil antikor çözeltisi ile oda sıcaklığında bir saat boyunca inkübe edin. Kullanımdanten en geç 30 dakika önce, kesiti tekrar PB S ile beşer dakikadan üç kez yıkayın.

Üç mililitre substrat tamponuna bir damla kırmızı kromojen çözeltisi ekleyin. Her bir lamı, bu çözeltinin 100 mikrolitresi içinde karanlıkta 15 ila 20 dakika inkübe edin. Ardından lamları PBS ile beş dakika boyunca 3 kez yıkayın.

Son olarak, çekirdekleri PBS içinde 1/500 oranında seyreltilmiş DPI ile boyayın. Kesitin üzerine bir ila iki damla Antifa medyumu uygulayın ve hemen bir lameliyle kapatın. Sızdırmazlığı sağlamak için lamları mikroskopi öncesinde 4 °C'de 24 ila 48 saat inkübe edin.

Konfokal mikroskopiye başlamak için, bir lamı mikroskop tablasına yerleştirin ve 63 x objektifi seçin. Görüntüleme yazılımını açtıktan sonra, görüntüleme sekmesindeki smart setup seçeneğine tıklayın ve uygun florofor kombinasyonunu seçin. Burada, dappy ve Alexa Fluor 555 kullanılmıştır.

Ardından, best signal seçeneğine, ardından apply butonuna tıklayın. Daha sonra, bilgisayarın optimal pozlama parametrelerini belirlemesine izin vermek için set exposure kısmına tıklayın. Görüntüyü optimize etmek için kanallar penceresini açın ve görüntüyü canlı (live) moda getirin. Gerekirse odaklamayı ayarlayın.

Ardından, pinhole ayarını optimize etmek için bir au üzerine tıklayın ve en iyi yoğunluk için kazancı (gain) ayarlayın. Son olarak, dijital kazancı iki ile üç arasına ayarlayın. Bu optimizasyondan sonra canlı görüntüyü durdurun ve görüntüleme modu penceresini açın.

X by Y seçeneğine tıklayarak çerçeve boyutunu ayarlayın ve 10 24 by 10 24 seçeneğini belirleyin. Ayrıca düşük bir hız seçin. Ardından, ortalama sekmesini açın ve dört veya daha büyük bir sayı seçin.

Ardından snap düğmesine tıklayın ve yakalanan 2D görüntüyü kaydedin. 3D görüntülemeyi kurmak için smart setup sekmesini açın ve ZS stack öğesini işaretleyin; bu işlem Zs stack penceresinin açılmasını sağlayacaktır. Zack için ilk ve son konumları ayarlamak için tekrar live seçeneğine tıklayın ve odağı astrosite en yakın üst konuma getirin.

Önce set düğmesine tıklayın. Şimdi odağı astrositin en alt konumuna ayarlayın ve set last düğmesine tıklayın, ardından canlı görüntüyü durdurun. Sonrasında, optimal düğmesine tıklayarak aralığı seçin.

Buradaki kesit sayısını ayarlamak için aralık 1,01 µm olarak belirlenir. Son olarak, başlangıç (start) ve deney (experiment) butonlarına tıklayın ve tarama tamamlandığında görüntüleri kaydedin. Ayrıca, 10x veya 20x objektif kullanarak 2D bir görüntü elde edin.

Floresans yoğunluğu ölçümleri için görüntü penceresindeki dikdörtgen veya daire aracını seçin ve astrosit çekirdek soma hücre gövdesi ile bölgesinin hacmini ve yüzey alanını belirlemek amacıyla ölçüm yapılacak alanı işaretleyin. 3D görüntüleri, analiz yazılımındaki Velocity 6.1 gibi uygun bir analiz yazılımı programına aktarın. Yeni bir kütüphane oluşturun ve tüm görüntüleri sol taraftaki gri sütuna sürükleyin.

Bir 3D görüntü seçin ve dapi gibi ilgilendiğiniz edinilmiş kanallardan birini açın. Nükleer ölçümler için, kontrastı optimize etmek üzere parlaklığı manuel olarak ayarlayın. Şimdi araçlar menüsünü seçin.

Make volume seçeneğini seçin ve Zack görüntülerinden tek bir 3D görüntü oluşturun. Düzenleme menüsünü açın ve özelliklere tıklayın. X, Y ve Z özelliklerinin görüntülendiğinden emin olun.

Bunun ardından, araç çubuğundan serbest el ROI (ilgili bölge) aracını seçin. Astrosit çekirdeğinin hacmini ve yüzey alanını ölçmek için seçilen aracı kullanarak DPI ile işaretlenmiş çekirdeğin etrafına bir hat çizin. Yine serbest el ROI aracını kullanarak, tüm dalların yüzeyini takip edecek şekilde somanın etrafına bir hat çizerek tüm astrositin hacmini ve yüzey alanını ölçün.

Görüntü penceresinin üst kısmındaki ölçümler menüsüne tıklayın, nesneleri bul (find objects) seçeneğini pencerenin üst kısmına sürükleyin ve popülasyon bir'e tanımlayıcı bir isim verin, ilgili rengi seçin ve yeni bir pencere açacak olan ölç (measure) düğmesine tıklayın. Bu yeni pencerede, parametre olarak hacim veya yüzey alanı seçeneklerinden birini belirleyin ve tamam'a tıklayın.

Verileri kaydetmek için ölçüm menüsüne tıklayın ve ölçüm yap öğesini seçin. Pencereden yeni bir ölçüm öğesi seçin. Veriler için bir dosya adı girin ve tamam'a tıklayın.

Son olarak, istatistiksel analiz yapmak ve veri grafikleri oluşturmak için ölçüm verilerini uygun bir yazılım paketine aktarın. Burada araştırmacılar, amyloid beta one 40 veya amyloid beta one 40 ve Ian ile işlem görmüş sıçanların fikse edilmiş beyin dokusundaki astrositleri karşılaştırmışlardır. Amyloid proteini ile yapılan işlem enjeksiyonu, daha kalın ve daha uzun dallara sahip astrositlerle sonuçlanmıştır.

Ian ile tedavi edilen hayvanlardan alınan bu astrositler, kısa ve ince dallara sahip yıldızsı bir form sergilemiştir. Ian ile tedavi edilen sıçanların beyin kesitlerinde ayrıca azalmış astrosit GFAP pozitif floresan belirginleşmişti. Spesifik astrosit hacimlerinin morfometrik analizi, sadece amiloid tedavisine kıyasla Ian tedavisi ile astrosit çekirdeği, hücre gövdesi, tüm astrosit ve astrosit bölgesinin hacminin azaldığını ortaya koymuştur.

Bu görüntüleme tekniğinde uzmanlaşıldığında, işlem uygun şekilde gerçekleştirilirse hücre başına analiz birkaç dakika içinde tamamlanabilir. Bu prosedür uygulanırken, yapının yüksek hassasiyetle işaretlenmesi önemlidir. Deney geliştirildikten sonra başlatılmadan önce, ilgilenilen yapının manuel olarak işaretlenmesi üzerine pratik yapılması en iyisidir.

Bu teknik; hücre biyolojisi, histoloji ve patoloji alanındaki araştırmacıların, sağlıklı veya hastalıklı bir ortamdaki hücre yapısını incelemelerinin önünü açmıştır. Bu videoyu izledikten sonra, 3D görüntüler kullanarak tek bir hücre için 12 farklı parametrenin nasıl ölçüleceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.