Name: Astrositler Üç boyutlu Konfokal Morfometrik Analizi Protokolü (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 13 s
Description: Öğrenin, konfokal mikroskopi ile astrosit morfolojisini üç boyutlu analiz etmeyi. Bu yöntem, patolojik koşullarda veya terapötik müdahaleler sonrası hücresel mimari değişikliklerini değerlendirmeye yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.

Bu çalışma Tıp Bilimleri İran Üniversitesi Etik Komitesi (Tahran, İran) tarafından onaylanan Laboratuvar Hayvanları Bakım ve Kullanım (NIH) için Kılavuzu&#39;nda belirtilen politikalara uygun olarak yürütülmüştür. 1. Hayvanlar, Cerrahi ve Numune Hazırlıklar NOT: 3D odaklı mikroskopik analiz için beyin dokusunu hazırlayın. <ol><li> Iki gruba rastgele Divide hayvanları: Aβ 1-40 -injection (n = 8) ve genistein, tedaviden Aβ 1-40 -injection (n = 8); ameliyat öncesi sonda 1 saat ile genistein (örneğin, polietoksile hint yağı gibi bir araç içerisinde seyreltilmiş 10 mg / kg) tatbik. </li><li> Ketamin (100 mg / kg) ve ksilazin (10 mg / kg) ile anestezi. Ayak sıkıştırdıktan sonra geri çekme refleksi eksikliği ile doğru anestezi onaylayın. Kuruluğunu önlemek için ameliyat sırasında göze merhem kullanın. </li><li> Stereotaksik aparat ve tıraş baş hayvanları yerleştirin. IoD Uygulaine çözüm insizyon yapılmadan önce derisini temizlemek ve enfeksiyon riskini azaltmak için ameliyat sırasında steril operasyon siteyi tutmak için. Sıçan beyin atlas 8&#39;e göre, bregma -3.5 mm posterior, orta hatta kadar ± 2 mm lateral ve dura altında -2.8 mm hipokampus Aβ 1-40 stereotaxically (4 ul) enjekte edilir. Stereotaksik yöntem için bir önceki yayın 9 bakınız. </li><li> Hayvanlar hayvanların rahatı için tam bilinçli kadar post-operatif gözlem / bakım sağlar. Kurtarma sırasında sıcak hayvanları tutun ve tam iyileşme kadar diğer hayvanlarla bir kafese dönmelerini yok. Ameliyattan sonra hayvanlarda enfeksiyon belirtisi dikkat edin. </li><li> Üç hafta ameliyat sonrası ketamin (150 mg / kg) ile derin hayvanların anestezisi. 0.1 M PBS (pH = 7.4) içinde% 4 paraformaldehit ve ardından% 0.9 tuzlu su hayvanları perfüze transcardial tespit gerçekleştirmek, çıkarıp 10 de tarif edildiği gibi &lt;beyin tamir/ sup&gt;. </li><li> 4 ° C&#39;de 2-3 gün süreyle% 4 paraformaldehid içinde beyinleri sonrası sabitleyin. </li><li> Doku gömme ekipman kullanımı ile parafin blokları doku gömün ve doğru hizalama ya da kesit engel olabilir çünkü dolum-under veya aşırı doldurma kaseti kaçının. Parafin blok içinde doku yönüne dikkat edin. NOT: Sıçan hipokampus, örneğin, serebral hemisferin posterior kısmına yakındır. Böylece doku şekilde gömülü olmalıdır beynin posterior kısmında kesit başlar söyledi. Istenen anatomik yapıyı ulaşmak için bir rehber olarak Paxinos atlas 8 kullanın. </li><li> Hava hareketleri zor bölümlerden işlenmesini yapmak beri uzak, hava taslaklar veya kapı gelen mikrotom yerleştirin. </li><li> Bu derinlik gerekli olduğu gibi tam astrositlerin Z-Stack görüntüler üretmek için bir kalınlık ≥20 um ile bölümleri kullanın. Onlar istenmeyen kalınlığa sahip olabilir ısıl e, ilk çift bölümleri kullanmayınXpansion. </li><li> (5 ± 2 ˚C, parafin erime sıcaklığının altında) sadece yeterince uzun bölümler düzleştirmek için ılık su yüzeyinde bölümleri yerleştirin. NOT: bölümün genişleme yapısının morfoloji rahatsız edebilir Aşırı. Dikkatle bölümleri aktarmak için minik fırça kullanın. Her slaytta iki ya da üç bölümden toplayın. </li><li> Mağaza dik bir pozisyonda rafa slaytlar ve çeşitli saat veya O / N 37 ° C&#39;de kurumaya bırakın. </li></ol> 2. İmmünhistokimya <ol><li> Deparaffinize ksilen bölümler, 2 x 10 dakika, ve alkol gradyanı ile (99.8,% 95 ve% 70,% 10 dk) ve PBS rehidrate. </li><li> % 0.25 sığır serum albümini (BSA),% 0.25 Triton X-100 ve% 3.5 normal serum (4 ° C&#39;de O / N) içeren PBS içinde 1500: glial fibriler asidik protein (GFAP) yönelik antikorlar ile inkübe 1 seyreltilmiştir. </li><li> 3 x 5 dakika boyunca PBS bölümleri yıkayın. </li><li> İkincil alkalin fosfat ile konjüge edilmiş Antikorların kuluçkalayın1 saat s (PBS içerisinde 1: 100 seyreltilmiş, 21 ° C,). </li><li> 3 x 5 dakika boyunca PBS bölümleri yıkayın. NOT: Bu arka plan boyama en aza indirmek için ikincil antikorlar sonra düzgün bölümleri yıkamak önemlidir. </li><li> Sıvı Daimi Kırmızı kromojeni (15-20 dk) ile karanlıkta bölümleri inkübe edin. Not: Kullanımdan önce en fazla 30 dakika çözeltisi hazırlayın. </li><li> 3 x 5 dakika boyunca PBS bölümleri yıkayın. </li><li> Son olarak, 4-6-diamidino-2-fenilindol çekirdekleri leke (DAPI; PBS içerisinde 1: 500 seyreltilmiş), önceden kapak-kayma. Mikroskopi önce buzdolabı 24-48 saat slaytlar saklayın. </li></ol> 3. Konfokal Mikroskop NOT: kantitatif değerlendirme (aşağıya bakınız) için, hata riskini azaltmak için şube örtüşen minimum açıkça görülebilir DAPI lekeli çekirdeğe sahip bir astrosit seçin. Z-Stack görüntüler üreten zaman alıcıdır. Sabırlı olun ve işleme sırasında bitmiyor. Dik konfokal lazer tarama mikroskobu u olduğuastrositlerden 3D görüntüler oluşturmak için sed. <ol><li> Mikroskop-sahnede slayt yerleştirin ve 63X objektif seçin. </li><li> Görüntüleme yazılımı açın ve Start sisteminde tıklayın. Locate sekmesine tıklayın. Ata gidin ve uygun ışık ayarlamak için GFP seçin. </li><li> Işığı yansıtmak için Shutter açın. Shutter sağ tarafındaki Reflektör Revolver bulun ve astrositler (yeşil, kırmızı veya mor) tarafından yansıtılmalıdır rengi seçin; (FSet20 wf) kırmızı renk burada kullanıldı. NOT: mikroskobunun oküleri doğrudan resmi odaklanmak unutmayın. </li><li> En iyi Odağı bulmak için, tüm kapalı tıklayın ekran modunda mikroskop pimini koymak ve Toplama sekmesine tıklayın. </li><li> Toplama sekmesi altındaki Akıllı Kur tıklayın; Bir pencere açılır. Listeden (geçerli proje yani DAPI ve Alexa Fluor 555) uygun fluorofor seçin. Renk otomatik olarak seçilir. </li><li> En iyi sinyal üzerine tıklayın ve uygulayın, ardından Set Pozlama tıklayın; Daha sonra bilgisayar otomatik olarak pozlama parametrelerini ayarlamak olacaktır. </li><li> Görüntüyü optimize için Kanallar penceresine gidin. Kaldır Track2, Track1 vurgulayın ve canlı tıklayın. Gerekirse görüntü odaklanın. </li><li> Kanallar penceresinde aşağıdaki anahtarları ayarlamak; otomatik iğne deliği optimize etmek 1AU tıklayın. Aksi takdirde konfokal görüntüleri optimal olmayan olacaktır bu adımı yapmak çok önemlidir. En iyi yoğunluğunu (ekstra gürültüyü azaltmak için 800 altında bu ayarı tutmak) için Kazanç ayarlayın. Son olarak, 2 ve 3 arasında Dijital Kazanç ayarlayın. </li><li> Kaldır Track1 Track2 tıklayın ve Track2 için Adım 3.8 tekrarlayın. Sonra Canlı dur. </li><li> Toplama Modu penceresine gidin. Çerçeve Boyutu optimize ve Averaging görüntüyü geliştirin. Değiştirmek için çerçeve boyutu X * Y gidip x 1,024 1.024 seçin. Daha iyi bir görüntü oluşturmak için yavaş Speed ​​seçin. </li><li> Ortalaması gidin ve Numara ≥4 seçin. Bu ortalama değer özel üretmek için ortalama edilecek taramaların sayısını gösteriredinilen görüntüyü e. Şimdi Yapış düğmesini tıklatın ve yakalanan 2B görüntüyü kaydedin. </li><li> 3D görüntüleme için, Z-Stack penceresi açmak için neden Akıllı Kur kapsamında Z-Stack öğeyi işaretlemek. </li><li> Hücrenin derinliği, yani Z-Yığın için ilk ve son pozisyonları ayarlayın. İlk Canlı tıklayınız. Sonra Z-Stack başlatmak için dokuda astrosit en üst pozisyona odaklanmak için mikroskop odak sürücü kullanın. Set İlk tıklayın. Sonra Z-Stack tarama kesilmelidir dokuda astrosit en düşük pozisyona aşağı odaklanın. Set Son üzerine tıklayın. Sonra Canlı dur. </li><li> Aralığı Seçin; 1.01 mikron Bu çalışmada kullanılan; seçme aralığı dilim sayısını ayarlamak için Optimal tıklayarak yapılabilir. </li><li> Başlat Deneyi tıklayın. Tarama tamamlandığında görüntüleri kaydetme. Yüzey alanı ve astrosit topraklarının hacmi, tüm astrosit dahil sutyen: Bu görüntü aşağıdaki parametrelerin ölçümü için kullanılacaknches hücre gövdesi ve çekirdek. </li><li> Adımlar 3,6-3,11 de tarif edildiği gibi, bir 10X ya da 20X objektif kullanarak bir 2D görüntü elde. Bu görüntü ölçümü için antikorların floresan immüno ve astrosit yoğunluğu (sayı / 1000 um 2) yoğunluğu kullanılabilir. </li></ol> 4. Astrosit yoğunluğu ve GFAP + Floresans yoğunluğu <ol><li> 20X 2B görüntü açın. Görüntü penceresinin sol tarafındaki Histo (Hisogram) tıklayın. </li><li> Astrosit yoğunluğunu hesaplamak için, 20X objektif altında arka arkaya üç görsel alanları seçin. Alanlarda şube örtüşen, minimum net soma sergileyen astrositlerde sayısını. </li><li> Floresan ölçmek için, görüntü penceresinin altbilgi üzerinde uygun bir alet (dikdörtgen veya daire) seçin ve ölçümü için bir alan seçin. Ortalama değer ve standart sapma görüntünün altında otomatik olarak görünür unutmayın. Str arasındaki mevcut çalışmada, 0.7 mm 2 dikdörtgen alaniatum ve dentat girusun medial bıçak kullanılmıştır. </li></ol> 5. Astrosit Şubeler <ol><li> Şube uzunluğu ve toplam sayısını ölçmek için, görüntü analiz yazılımı (20X ile kazanılmış) 3D görüntüler kullanın. Seçilen astrosit her dalının uzunluğu boyunca elle bir çizgi çizin. Sonra hat-uzunluk ölçmek için uzman ölçme-aracını seçin. Şube sayısını ölçmek için, işaretli öğelerin sayısını saymak için sayım aracını seçin. </li></ol> 6. Hacim ve Yüzey Alanı NOT: 3D görüntü analiz yazılımı elle bir yapıya işaretleme odak ve eğitim gerektirir. Bir deney başlamadan önce birkaç kez uygulayın. <ol><li> Astrosit çekirdeğinin, soma, hücre gövdesi ve toprak hacim ve yüzey alanı ölçmek için, örneğin Volocity 6.1 gibi 3D görüntü analiz yazılımı (Merdivenleri 3,1-3,16 elde) 3D görüntü aktarmak. </li><li> Yazılımını açın ve yeni bir oluşturmakkütüphane. Yeni kütüphanede sol gri sütuna tüm görüntüleri sürükleyin. Sonra bir 3D görüntü seçin. Sağda, farklı renklerde, farklı kanallar vardır. Çevrede bir kanalda açın; Örneğin DAPI için mavi kanal çekirdeğe ölçerken. Optimal kontrast elde etmek için elle parlaklığını değiştirin. </li><li> Araçlar menüsünü seçin, Ses yapın ve Z-yığın görüntüleri dışarı tek bir 3D görüntü üretmek için gidin. Düzen menüsünde Özellikler&#39;i tıklatın ve X, Y ve Z özellikleri sunulmaktadır emin olun; aksi takdirde 3D analizlerini yürütmek mümkün değildir. </li><li> Araç çubuğundaki Freehand RIO aracı simgesini tıklayın. Astrosit çekirdeğinin hacmi ve yüzey alanı ölçmek için DAPI etiketli çekirdeği etrafında bir çizgi çizin. </li><li> Astrosit hücre gövdesi hacmi ve yüzey alanı ölçmek için şubeler hariç soma etrafında bir çizgi çizin. </li><li> Tüm astrosit (şubeler dahil hücre gövdesi) hacmi ve yüzey alanı ölçmek için aşağıdaki soma etrafında bir çizgi çizintüm branşlarda yüzey. </li><li> Astrosit topraklarının hacmi ve yüzey alanı değerlendirmek için şube uçları arasına bir çizgi çizin. NOT: Basın istenmeyen çizimleri silmek için klavyedeki Delete. </li><li> Bir ölçüm protokolünü oluşturmak için görüntü penceresinin üst kısmında ölçümler menüsüne tıklayın; farklı araçlar içeren bir pencere açılır. </li><li> Sürükle penceresi (bölme) üstüne nesneleri bulun. Nüfus 1 açıklayıcı bir ad verin ilişkili rengi seçin ve Tedbir tıklayın. Başka bir pencere açılır. </li><li> Bir parametre, yani hacim veya yüzey alanı seçin. Tamam&#39;a tıklayın. Veriler tabloda görünecektir. </li><li> Ölçüm menüsünde veri tıklayınız kaydetmek ve Ölçüm Item seçeneğini belirleyin. </li><li> Açılan pencereden adlı yeni bir ölçüm öğesini seçin. Sonra verilere bir ad verin ve Tamam&#39;a tıklayın. </li><li> Son olarak, Graph ped olarak istatistik yazılımı veri ihracat veya programı excel. Verileri analiz t-testi kullanın, ardından 2B gr arsaAPHS. </li></ol>

<ol><li>Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mystery+and+magic+of+glia%3A+a+perspective+on+their+roles+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The mystery and magic of glia: a perspective on their roles in health and disease.</a> Neuron. 60 (3), 430-440 (2008).</li>
<li>Pellerin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-dependent+regulation+of+energy+metabolism+by+astrocytes%3A+an+update%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Activity-dependent regulation of energy metabolism by astrocytes: an update.</a> Glia. 55 (12), 1251-1262 (2007).</li>
<li>Sofroniew, M. V., Vinters, H. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytes%3A+biology+and+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol%22%5BJournal%5D)">Astrocytes: biology and pathology.</a> Acta Neuropathol. 119 (1), 7-35 (2010).</li>
<li>Pekny, M., Nilsson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocyte+activation+and+reactive+gliosis%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Astrocyte activation and reactive gliosis.</a> Glia. 50 (4), 427-434 (2005).</li>
<li>Sofroniew, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+dissection+of+reactive+astrogliosis+and+glial+scar+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Molecular dissection of reactive astrogliosis and glial scar formation.</a> Trends Neurosci. 32 (12), 638-647 (2009).</li>
<li>Anderova, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+death%2Fproliferation+and+alterations+in+glial+morphology+contribute+to+changes+in+diffusivity+in+the+rat+hippocampus+after+hypoxia-ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Cell death/proliferation and alterations in glial morphology contribute to changes in diffusivity in the rat hippocampus after hypoxia-ischemia.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 31 (3), 894-907 (2011).</li>
<li>Hatten, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+regulation+of+astroglial+morphology+and+proliferation+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Neuronal regulation of astroglial morphology and proliferation in vitro.</a> J Cell Biol. 100 (2), 384-396 (1985).</li>
<li>Paxinos, G., Watson, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPaxinos%2C+G+%22A+stereotaxic+atlas+of+the+rat+brain%22">A stereotaxic atlas of the rat brain</a>. , Academic. New York. (1998).</li>
<li>Kirby, E. D., Jensen, K., Goosens, K. A., Kaufer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stereotaxic+surgery+for+excitotoxic+lesion+of+specific+brain+areas+in+the+adult+rat%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Stereotaxic surgery for excitotoxic lesion of specific brain areas in the adult rat.</a> J Vis Exp. (65), e4079(2012).</li>
<li>Bagheri, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloid+beta%281-40%29-induced+astrogliosis+and+the+effect+of+genistein+treatment+in+rat%3A+a+three-dimensional+confocal+morphometric+and+proteomic+study%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Amyloid beta(1-40)-induced astrogliosis and the effect of genistein treatment in rat: a three-dimensional confocal morphometric and proteomic study.</a> PloS One. 8 (10), e76526(2013).</li>
<li>Chvatal, A., Anderova, M., Kirchhoff, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+confocal+morphometry+-+a+new+approach+for+studying+dynamic+changes+in+cell+morphology+in+brain+slices%5BTitle%5D)+AND+%22J+Anat%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional confocal morphometry - a new approach for studying dynamic changes in cell morphology in brain slices.</a> J Anat. 210 (6), 671-683 (2007).</li>
<li>Kulkarni, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+3-D+analysis+of+GFAP+labeled+astrocytes+from+fluorescence+confocal+images%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroscie+Methods%22%5BJournal%5D)">Quantitative 3-D analysis of GFAP labeled astrocytes from fluorescence confocal images.</a> J Neuroscie Methods. 15 (246), 38-51 (2015).</li>
<li>Wagner, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Object-based+analysis+of+astroglial+reaction+and+astrocyte+subtype+morphology+after+ischemic+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neurobiol+Exp%22%5BJournal%5D)">Object-based analysis of astroglial reaction and astrocyte subtype morphology after ischemic brain injury.</a> Acta Neurobiol Exp. 73 (1), 79-87 (2013).</li>
</ol>

Bu çalışma Tıp Bilimleri İran Üniversitesi (Tahran, İran) Östergötland County Konseyi (İsveç) ve Hücresel ve Moleküler Araştırma Merkezi hibe ile desteklenmiştir.

Geçerli protokol, astrosit morfolojisi ile ilişkili 12 farklı parametrelerini değerlendirmek için 3D konfokal morfometrisi kullandı. Bu amaçla, Aβ 1-40 olan sıçanların hipokamp dokusunda - ya da bir anti-enflamatuvar ajan olarak genistein, ön muamele olmaksızın uyarılan astrogliyozun kullanılmıştır. 3D görüntüler ve morfometrik yazılımını kullanarak, astrositlerde morfolojisi yani astrogliyozun üzerinde genistein etkisini göstermek başardık. Beyin dokusu içi ve...

Sağlıklı, merkezi sinir sistemi (CNS) içinde, astrositler, kan akışı, enerji metabolizmasında, sinaptik fonksiyon ve plastisite ve hücre dışı iyon düzenlenmesinde önemli bir rol oynarlar ve nörotransmitter 1-3 homeostazı. Buna ek olarak, astrositler farklı zararlı uyaranlara ve hipertrofisi, çoğalması ve astrositler 4,5 fonksiyonel biçimlenme ile karakterizedir reaktif astrogliyozun yoluyla travma, enfeksiyon, iskemi veya nörodejenerasyon gibi anormal şartlarda cevap. Reaktif astrogliasis terapötik girişimlerin klinik sonuçlarını etkileyebilir, bu nedenle, dokuda inflamatuar yanıtı ve onarım sürecini mühendis ve olabilir. Buna göre, astrocytes MSS etkileyen hastalıkların çeşitli terapötik müdahaleler için potansiyel hedefler olarak son yıllarda nörobilimci dikkati aldık. Astrositler normalde iyi-d ile stellat şekli varsoma 6 çevresinde yayıldı efined dalları. Beyindeki hastalıklı durumda, astrosit dalları kıvrık hale gelir ve amiloid beta (Aβ) mevcudiyetinde, örneğin, şiş uçları 7 göstermektedir. Bu makale konfokal mikroskobu ile elde edilen astrositlerin 3D görüntüleri analiz etmek için bir protokol sunar. Her astrosit için on iki farklı sayısal parametreler ölçüldü: yüzey alanları ve astrosit topraklarında (bir astrosit kaplı dokusu), (şubeler dahil) tüm hücre, hücre gövdesi ve nükleus hacimleri; Toplam uzunluğu ve şube sayısının; astrosit tespiti için kullanılan antikorların flüoresan yoğunluğu; ve astrositlerde yoğunluğu (sayı / 1000 mikron 2). Bu amaçla, ya da bir anti-enflamatuvar madde olarak genistein muamelesi olmadan Aβ 1-40 enjeksiyon intrahipokampal maruz farelerin beyin bölümleri kullanılır. Açıklanan protokol morfometrik An için kullanılabilirin vitro veya farklı koşullar altında in vivo olarak farklı hücre tipleri Analizi.

<table><tbody><tr><td>Amiloid beta 1-40</td><td>Sigma Aldrich</td><td>79793</td><td>-70 &°C'de tutun; C</td></tr><tr><td>Genistein</td><td>Sigma Aldrich</td><td>446-72-0</td><td>-20 & derece; C</td></tr><tr><td>glial fibriler asidik proteine karşı polikolonal tavşan antikorları</td><td>DAKO</td><td>Z0334</td><td></td></tr><tr><td>alkalin fosfat konjuge domuz anti-tavşan IgG antikorları</td><td>DAKO</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sıvı Kalıcı Kromojen</td><td>DAKO</td><td>K0640</td><td></td></tr><tr><td>Sıvı kalıcı Kırmızı Yüzey Tamponu</td><td>DAKO</td><td>K0640</td><td></td></tr><tr><td>Cremophor EL</td><td>Sigma Aldrich</td><td>27963</td><td>Polietoksillenmiş hint yağı - Adım 1.1</td></tr><tr><td>LSM 700 Konfokal Lazer Tarama Mikroskobu</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Volocity 6.3</td><td>Perkin Elmer Inc.,Görüntü</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Analizi 2000</td><td>Tekno Optik</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Streotaksik aparat</td><td>Çalma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Grafik pedi Prizma 5</td><td>Grafik pedi yazılımı Inc.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

astrositler Üç boyutlu konfokal morfometrik analizi protokolü

Protocol for Three-dimensional Confocal Morphometric Analysis of Astrocytes

Beyindeki glial hücreleri gibi, astrositler, merkezi sinir sistemindeki çeşitli işlevsel rolleri vardır. Zararlı uyaranların varlığında, astrositler işlevsel ve yapısal özellikler, reaktif astrogliasis denilen bir durum değiştirir. Burada, astrositler morfolojik özelliklerin değerlendirilmesi için protokol verilmektedir. Bu protokol şube yüzey alanı ve bir astrosit (astrosit topraklarında) kapsamında dokusu, şube, hücre gövdesi ve nukleus dahil olmak üzere tüm astrosit, hacmi, yani 12 farklı parametrelerin ölçümü yanı sıra toplam uzunluğu ve numarasını içeren, şiddeti astrosit tespiti için kullanılan antikorların floresan immünoreaktivitesinin ve astrosit yoğunluğu (sayı / 1000 mikron 2) evi. Volocity 6,3 ölçümleri için kullanılmıştır gibi, bu amaç için, üç boyutlu (3D) odaklı mikroskopik resimleri oluşturulur, ve 3 boyutlu görüntü analizi yazılımı gibi bulundu. Amiloid beta 1-40 maruz Sıçan beyin dokusu </ya da terapötik bir müdahale olmaksızın alt&gt; (Aβ 1-40) bir yöntem mevcut için kullanılmıştır. Bu protokol, aynı zamanda, in vivo ya da in vitro koşullarında ya da diğer hücre 3D morfometrik analizi için kullanılabilir.

Bu bölüm 3B morfometrik analizi ile üretilen, nicel ve nitel gözlemlere ilişkin bazı örnekler verilmektedir. Daha önce de belirttiğimiz 12 parametrelerin tam sonuçlar için, önceki yayın 10 bakın. Nitel Gözlemler Astrositler Aβ 1-40 enjekte sıçanlar (Şekil 1) genellikle uzun olan ince veya kalın dalları sergiledi. Kısa dalları ile birkaç küçük stellat şeklindeki astrositler serebral korteks gözlendi ve astrositlerde kompakt b...

CNS'deki astrositler, zararlı uyaranlara yanıt olarak fonksiyonel ve yapısal özelliklerini değiştirir. Bu rapor, hastalıklı durumlarda veya terapötik müdahaleler sonrasında üç boyutlu astrosit morfolojisinin değerlendirilmesi için bir protokol sunmaktadır.

Astrositler Üç boyutlu Konfokal Morfometrik Analizi Protokolü

As glial cells in the brain, astrocytes have diverse functional roles in the central nervous system. In the presence of harmful stimuli, astrocytes modify ...

Bu prosedürün genel amacı, konfokal mikroskopi yoluyla elde edilen astrositlerin üç boyutlu görüntülerini analiz ederek astrosit morfolojisini değerlendirmektir. Bu yöntem, çeşitli hücre tiplerinde patolojik koşullar altında veya bir müdahale stratejisinin etkisi olarak ortaya çıkabilen morfolojik değişiklikleri değerlendirmek için kullanılabilir. Bu tekniğin temel avantajı, hücresel mimariyle ilişkili birçok parametrenin eş zamanlı olarak incelenebilmesidir.Dr. Mariam Bodel bu prosedürü gösterecektir. İmmünohistokimyasal boyama için lamların hazırlanmasını takiben, kesitleri iki kez 10 dakika boyunca ksilen içinde bekleterek deparafinize edin. Yıkama işleminden sonra, kesitleri yeniden hidrate etmek için lamları %99,8, %95 ve %70'lik etanol çözeltilerinin her birinde 10 dakika boyunca inkübe edin. Lamları, 4 °C'de gece boyunca 1:1500 dilüsyondaki glial fibriler asidik protein veya GFAP primer antikor çözeltisi içinde inkübe edin.İnkübasyonun ardından, kesitleri PB S ile beşer dakikadan üç kez yıkayın. Ardından, lamları 1:100 oranında seyreltilmiş, alkali fosfataz konjuge ikincil antikor çözeltisi ile oda sıcaklığında bir saat boyunca inkübe edin. Kullanımdanten en geç 30 dakika önce, kesiti tekrar PB S ile beşer dakikadan üç kez yıkayın.Üç mililitre substrat tamponuna bir damla kırmızı kromojen çözeltisi ekleyin. Her bir lamı, bu çözeltinin 100 mikrolitresi içinde karanlıkta 15 ila 20 dakika inkübe edin. Ardından lamları PBS ile beş dakika boyunca 3 kez yıkayın.Son olarak, çekirdekleri PBS içinde 1/500 oranında seyreltilmiş DPI ile boyayın. Kesitin üzerine bir ila iki damla Antifa medyumu uygulayın ve hemen bir lameliyle kapatın. Sızdırmazlığı sağlamak için lamları mikroskopi öncesinde 4 °C'de 24 ila 48 saat inkübe edin.Konfokal mikroskopiye başlamak için, bir lamı mikroskop tablasına yerleştirin ve 63 x objektifi seçin. Görüntüleme yazılımını açtıktan sonra, görüntüleme sekmesindeki smart setup seçeneğine tıklayın ve uygun florofor kombinasyonunu seçin. Burada, dappy ve Alexa Fluor 555 kullanılmıştır.Ardından, best signal seçeneğine, ardından apply butonuna tıklayın. Daha sonra, bilgisayarın optimal pozlama parametrelerini belirlemesine izin vermek için set exposure kısmına tıklayın. Görüntüyü optimize etmek için kanallar penceresini açın ve görüntüyü canlı (live) moda getirin. Gerekirse odaklamayı ayarlayın.Ardından, pinhole ayarını optimize etmek için bir au üzerine tıklayın ve en iyi yoğunluk için kazancı (gain) ayarlayın. Son olarak, dijital kazancı iki ile üç arasına ayarlayın. Bu optimizasyondan sonra canlı görüntüyü durdurun ve görüntüleme modu penceresini açın.X by Y seçeneğine tıklayarak çerçeve boyutunu ayarlayın ve 10 24 by 10 24 seçeneğini belirleyin. Ayrıca düşük bir hız seçin. Ardından, ortalama sekmesini açın ve dört veya daha büyük bir sayı seçin.Ardından snap düğmesine tıklayın ve yakalanan 2D görüntüyü kaydedin. 3D görüntülemeyi kurmak için smart setup sekmesini açın ve ZS stack öğesini işaretleyin; bu işlem Zs stack penceresinin açılmasını sağlayacaktır. Zack için ilk ve son konumları ayarlamak için tekrar live seçeneğine tıklayın ve odağı astrosite en yakın üst konuma getirin.Önce set düğmesine tıklayın. Şimdi odağı astrositin en alt konumuna ayarlayın ve set last düğmesine tıklayın, ardından canlı görüntüyü durdurun. Sonrasında, optimal düğmesine tıklayarak aralığı seçin.Buradaki kesit sayısını ayarlamak için aralık 1,01 µm olarak belirlenir. Son olarak, başlangıç (start) ve deney (experiment) butonlarına tıklayın ve tarama tamamlandığında görüntüleri kaydedin. Ayrıca, 10x veya 20x objektif kullanarak 2D bir görüntü elde edin.Floresans yoğunluğu ölçümleri için görüntü penceresindeki dikdörtgen veya daire aracını seçin ve astrosit çekirdek soma hücre gövdesi ile bölgesinin hacmini ve yüzey alanını belirlemek amacıyla ölçüm yapılacak alanı işaretleyin. 3D görüntüleri, analiz yazılımındaki Velocity 6.1 gibi uygun bir analiz yazılımı programına aktarın. Yeni bir kütüphane oluşturun ve tüm görüntüleri sol taraftaki gri sütuna sürükleyin.Bir 3D görüntü seçin ve dapi gibi ilgilendiğiniz edinilmiş kanallardan birini açın. Nükleer ölçümler için, kontrastı optimize etmek üzere parlaklığı manuel olarak ayarlayın. Şimdi araçlar menüsünü seçin.Make volume seçeneğini seçin ve Zack görüntülerinden tek bir 3D görüntü oluşturun. Düzenleme menüsünü açın ve özelliklere tıklayın. X, Y ve Z özelliklerinin görüntülendiğinden emin olun.Bunun ardından, araç çubuğundan serbest el ROI (ilgili bölge) aracını seçin. Astrosit çekirdeğinin hacmini ve yüzey alanını ölçmek için seçilen aracı kullanarak DPI ile işaretlenmiş çekirdeğin etrafına bir hat çizin. Yine serbest el ROI aracını kullanarak, tüm dalların yüzeyini takip edecek şekilde somanın etrafına bir hat çizerek tüm astrositin hacmini ve yüzey alanını ölçün.Görüntü penceresinin üst kısmındaki ölçümler menüsüne tıklayın, nesneleri bul (find objects) seçeneğini pencerenin üst kısmına sürükleyin ve popülasyon bir'e tanımlayıcı bir isim verin, ilgili rengi seçin ve yeni bir pencere açacak olan ölç (measure) düğmesine tıklayın. Bu yeni pencerede, parametre olarak hacim veya yüzey alanı seçeneklerinden birini belirleyin ve tamam'a tıklayın.Verileri kaydetmek için ölçüm menüsüne tıklayın ve ölçüm yap öğesini seçin. Pencereden yeni bir ölçüm öğesi seçin. Veriler için bir dosya adı girin ve tamam'a tıklayın.Son olarak, istatistiksel analiz yapmak ve veri grafikleri oluşturmak için ölçüm verilerini uygun bir yazılım paketine aktarın. Burada araştırmacılar, amyloid beta one 40 veya amyloid beta one 40 ve Ian ile işlem görmüş sıçanların fikse edilmiş beyin dokusundaki astrositleri karşılaştırmışlardır. Amyloid proteini ile yapılan işlem enjeksiyonu, daha kalın ve daha uzun dallara sahip astrositlerle sonuçlanmıştır.Ian ile tedavi edilen hayvanlardan alınan bu astrositler, kısa ve ince dallara sahip yıldızsı bir form sergilemiştir. Ian ile tedavi edilen sıçanların beyin kesitlerinde ayrıca azalmış astrosit GFAP pozitif floresan belirginleşmişti. Spesifik astrosit hacimlerinin morfometrik analizi, sadece amiloid tedavisine kıyasla Ian tedavisi ile astrosit çekirdeği, hücre gövdesi, tüm astrosit ve astrosit bölgesinin hacminin azaldığını ortaya koymuştur.Bu görüntüleme tekniğinde uzmanlaşıldığında, işlem uygun şekilde gerçekleştirilirse hücre başına analiz birkaç dakika içinde tamamlanabilir. Bu prosedür uygulanırken, yapının yüksek hassasiyetle işaretlenmesi önemlidir. Deney geliştirildikten sonra başlatılmadan önce, ilgilenilen yapının manuel olarak işaretlenmesi üzerine pratik yapılması en iyisidir.Bu teknik; hücre biyolojisi, histoloji ve patoloji alanındaki araştırmacıların, sağlıklı veya hastalıklı bir ortamdaki hücre yapısını incelemelerinin önünü açmıştır. Bu videoyu izledikten sonra, 3D görüntüler kullanarak tek bir hücre için 12 farklı parametrenin nasıl ölçüleceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

protocol-for-three-dimensional-confocal-morphometric-analysis

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Biz tek hücrelerin üç boyutlu konfokal floresans alınan tanımsız bir şekil morfolojisi değişiklikleri ölçmek için Imaris Nörobilim, ImarisXT ve MATLAB kullanan bir yazılım platformu geliştirdi. Bu yeni yaklaşım, reseptör aktivasyonunu takiben hücre şekli değişiklikleri ölçmek için kullanılır ve bu nedenle ilaç keşfi için olası ek bir araç temsil edilebilir.

Üç boyutlu Floresans Images Hücresel Morfoloji Değişiklikleri rakamlarla Analitik Aracı

Bu video, birincil ve ikincil antikorlar kullanılarak floresan olarak işaretlenmiş astrositlerle sabit bir fare beyin dokusu bölümünün immün boyama prosedürünü gösterir ve konfokal mikroskopi yoluyla lekeli astrositlerin görüntülerini yakalar.

Bir Fare Beyin Dokusu Bölümünde Floresan Etiketli Astrositlerin İmmün Boyanması

Kaynak: Moye, S. L., et.al.  Lucifer Sarı İyontoforezi Kullanarak Astrosit Morfolojisinin Görselleştirilmesi. J. Vis. Uzm.  (2019).  Bu video, sabit beyin dilimlerinde astrosit morfolojisini incelemek için floresan boya iyontoforezinin kullanımını göstermektedir. Düşük voltajlı bir akım altında sitoplazmaya anyonik, hidrofilik bir boya vermek için astrosit soma'nın bir elektrotla delinmesini detaylandırır, bu da boyanın soma ve dalları yaymasını ve etiketlemesini sağlar. Konfokal mikroskopi...

Sabit Bir Fare Beyin Diliminde Floresan Boya İyontoforezi Kullanılarak Astrosit Morfolojisinin Görselleştirilmesi

Kaynak: Bagheri, M., et. al. Astrositlerin Üç Boyutlu Konfokal Morfometrik Analizi için Protokol. J. Vis. Uzm. (2015).Bu video, konfokal bir mikroskop kullanılarak bir fare beyni bölümünde floresan olarak işaretlenmiş astrositlerin görüntülenmesini göstermektedir. Beyin bölümü uygun objektif merceğin altına yerleştirilir ve uygun floroforlar ve filtreler seçilir. Pozlamayı otomatik olarak optimize ettikten sonra, yüksek çözünürlüklü 2D görüntüler sağlamak için tarama parametreleri tanımlanır.

İmmün Etiketli Astrositlerin Konfokal Mikroskopi Kullanılarak Üç Boyutlu Görüntülenmesi

Beyin inflamatuar yanıtının karmaşıklığı hakkında yeni bilgiler edinmenin bir yolu sunulmaktadır. İmmünofloresan tabanlı protokolleri ve ardından fokal iskeminin bir fare modelinde mikroglia/makrofaj fenotip belirteçlerinin birlikte ekspresyon modelini araştırmak için üç boyutlu konfokal analizi tanımladık.

Deneysel Beyin Hasarında Polarizasyonun Mikroglia/Makrofaj Belirteçlerinin Üç Boyutlu Konfokal Analizi

Biz kendi kendine montajı, üç boyutlu demetleri boyuna hizalanmış astrositik somata ve süreçlerin bir roman biomaterial encasement içindeki gelişimi vitrin. Bunlar "yaşam iskele santimetre uzunluğunda, genişletme hizmet edebilir henüz test-yatak nörogelişimsel mekanizmaları incelemek veya yönetmenlik nöronal göç ve/veya aksonal neuroregeneration kolaylaştırmak için mikron çaplı çapı sergileyen", mühendislik kılavuz.

Astrocyte ağlar gelişimsel mekanizmaları özetlemek ve sinir sistemi yeniden oluşturma işlemi kolaylaştırmak için tasarlanmış üç boyutlu doku uyumlu

Burada astrositik ağlar organizasyonu değerlendirmek için bir protokol mevcut. Açıklanan yöntemi hücre sayısı, boyutu, alan ve bir çekirdek içinde pozisyon gibi bu ağların açıklayıcı ölçüleri sağlamak için önyargı en aza indirir. Anizotropi vektörel bir analizi ile değerlendirilir.

Boyut, şekil ve yön ağlar yönetim eşleşmiş Astrocytes analiz

Açıklanan boru hattı, gigabaytlardan daha büyük elektron mikroskobu veri kümelerinin tüm hücre morfolojilerini ayıklamak için segmentasyonu için tasarlanmıştır. Hücreler 3B olarak yeniden oluşturulduktan sonra, bireysel ihtiyaçlar etrafında tasarlanmış özelleştirilmiş yazılım, görüntüleme tıkanıklığının üstesinden gelmek için sanal gerçekliği kullanarak doğrudan 3D olarak nitel ve nicel bir analiz yapmak için kullanılabilir.

Glial ve Nöronal Hücrelerin 3D Rekonstrüksiyonu ve Sanal Gerçeklik Analizi Için Bir Yöntem

Astrositler morfolojik olarak karmaşık hücrelerdir, çoklu süreçleri ve gür bölgeleri ile örneklenirler. Ayrıntılı morfolojilerini analiz etmek için, hafifçe sabit dokuda hücre içi Lucifer sarı iontoforezi gerçekleştirmek için güvenilir bir protokol salıyoruz.

Lucifer Sarı İontoforez kullanarak Astrosit Morfolojisini Görselleştirme

CLARITY yöntemini kullanarak viral vektör iletimini ve beyin temizlemeyi birleştirmek, aynı anda çok sayıda nöron ve astrositin araştırılmasına izin verir.

Temizlenmiş Beyinlerde Astrositler ve Nöronlar Arasındaki Mekansal Etkileşimin İncelenmesi

Bu protokol, fare beyninin serbest yüzen doku bölümlerini bölümleme, boyama ve görüntüleme yöntemlerini açıklar, ardından astrosit bölgesi hacminin ve astrosit bölgesi örtüşmesinin veya döşemesinin analizinin ayrıntılı bir açıklaması gelir.

Astrosit Bölgesi Hacminin Analizi ve Kalın Serbest Yüzen Doku Kesitlerinde Döşeme

Öğrenin, konfokal mikroskopi ile astrosit morfolojisini üç boyutlu analiz etmeyi. Bu yöntem, patolojik koşullarda veya terapötik müdahaleler sonrası hücresel mimari değişikliklerini değerlendirmeye yardımcı olur.

Astrositler Üç boyutlu Konfokal Morfometrik Analizi Protokolü

Daha fazla video keşfet