Name: Hastalık ve Onarımda Hücresel Karışmayı Araştırmak için Mühendislik Tendon Toplulukları (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-03-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 32 s
Description: Keşfedin, tendon hasarı ve onarım mekanizmalarını incelemek için geliştirilen hibrit hidrojel eksplant assembloid modelini. Bu yenilikçi sistem, fare kuyruk tendonundan elde edilen yük taşıyan çekirdek matrisi ve yapay ekstrensek kompartmanı birleştirerek hücresel etkileşimleri ve iyileşme süreçlerini detaylı şekilde analiz etme imkanı sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma ETH Hibe 1-005733 tarafından finanse edilmiştir.

Hastalıkta hücresel etkileşimleri incelemek için fare tendon assembloidlerinin üretilmesi

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.

Genel olarak, burada sunulan montaj modeli sisteminin vurgulanması gereken birkaç kritik adımı vardır. İlk olarak, model sistemi yalnızca bileşenlerinin kalitesi kadar iyidir. Montaj işlemine başlamadan önce çekirdek eksplantını ve tohumlanacak hücre popülasyonlarını mikroskop altında kontrol etmek hayati önem taşır. İzole edilen hücre popülasyonlarının fenotipinin en az bir kez akış sitometrisi ile doğrulanması da benzer şekilde önemlidir. Özellikle yeni bir kollajen-1 partisi ilk kez kullanıldığında, hücreleri içine yerleştirmeden önce bir deneme çalışmasında çapraz bağlanma hızını kontrol etmek avantajlıdır. Montaj montajı, enfeksiyon riskini artıran çok sayıda manuel kullanım gerektirir. Enfeksiyon riskini en aza indirmek için, laminer hava akışına sahip steril bir biyogüvenlik başlığında çalışın, eldivenleri sık sık değiştirin ve eldivenleri ve çalışma alanını %80 etanol ile dekontamine edin. Benzer nedenlerle, 3D baskılı kelepçe tutucuları bir kereden fazla kullanmayın. Gömme işleminden önce, erken çapraz bağlanmayı önlemek için tüm hidrojel bileşenlerini (çapraz bağlama solüsyonu, kollajen-1 solüsyonu) buz üzerinde tutmak önemlidir. Sonuç olarak, çapraz bağlama çözeltisinin yüksek pH'ı ve düşük sıcaklığı nedeniyle hücre ölümünü sınırlamak için hücreler çapraz bağlama çözeltisine eklendikten sonra hızlı bir şekilde çalışılmalıdır. Çekirdek eksplantında kurumaya bağlı hücre ölümünü önlemek için, çapraz bağlama solüsyonunu kollajen-1 solüsyonu ile karıştırmadan hemen önce kenetlenmiş çekirdek eksplantlarını kaplayan ortamı aspire edin. Çekirdek eksplantının hidrojel içine merkezi yerleşimini garanti etmek için, hidrojeli hafifçe gerilmiş kenetlenmiş bir çekirdek eksplantının etrafına dökmek idealdir. Bunu yapmak için, dübel pimini ve M3 x 16 mm cıvata vidasını kullanarak kelepçe tutucuları uygun uzunluklarda deliklerle ayarlanmış (3D baskılı) bir plakaya sabitleyin. 50 dakikalık polimerizasyon süresinden sonra, gömülü çekirdek eksplantı, istenen kültür koşullarına bağlı olarak tekrar gerginliği giderilebilir. Asambloidin kültür sırasında yaşadığı gerginlik miktarı, deneysel sonuçlar üzerinde derin bir etkiye sahiptir ve örnekler ve koşullar arasında aynı tutulmalıdır21.
Bununla birlikte, mekanik (un-) yüklemenin deneysel sonuçlar üzerindeki büyük etkisi, özellikle çekirdek eksplantın korunan matris bileşiminin hücresel düzeydekompleks in vivo yükleme modellerini de yeniden oluşturması gerektiğinden, çoğu doku mühendisliği alternatifine göre assemboid modelinin ana avantajıdır. Uygulamada, şimdiye kadar sadece doğrusal elastik modülün, maksimum gerilme geriniminin ve montajların maksimum gerilme geriliminin ölçümü gösterilmiş olsa da, başka yerlerdeki tendon çekirdeği eksplantları için yorulma mukavemeti ve gerilme gevşemesi ölçümleri için protokoller tanımlanmıştır ve91,92 topluluklarına uygulanabilir olmalıdır. İn vivo benzeri yükleme modellerine ek olarak, montajın çok seviyeli modülerliği muhtemelen en büyük avantajıdır. Bireysel kültür odaları sayesinde, her numune için ayrı ayrı kontrol edilebilir bir dizi niş koşulu ayarlanabilir (yani sıcaklık, oksijen gerilimi, glikoz konsantrasyonu, takviye, uyarıcılar, inhibitörler ve bir plaka ile statik esneme). Daha sonra, ekstrinsik bölmenin matris sertliği ve matris bileşimi, hidrojel bileşimi aracılığıyla özelleştirilebilir ve örneğin, daha fazla kollajen-3 ve hücresel fibronektin 93,94,95 dahil ederek giderek daha hastalıklı bir doku mikro ortamının etkisinin incelenmesine izin verir. Dışsal bölmede değerlendirilen hücre popülasyonları, hangi hücrelerin tohumlanacağı seçilerek kolayca uyarlanabilir, ancak aynı zamanda, yerleşik genetiği değiştirilmiş hücre dizileri ve fare dizileri (yani, ScxLin hücre tükenmesi) kullanılarak tendon çekirdeği eksplantında da değiştirilebilir96. İki bölmenin farklı matrisi ve hücre bileşimi ayrıca, başka bir merkezi tendon ayırt edici özelliğiolan benzersiz bir bölümlere ayrılmış 3D yapı sağlar 1,30,46.
Bu sistemi kullanırken, sonuç parametrelerinin ayrıntı düzeyi için sistemin modülerliğinin sonuçlarını dikkate almak önemlidir. Hücre proliferasyonu ve alımı her bölme için ayrı ayrı değerlendirilebilirken, mekanik özellikler, sekretom bileşenleri ve bozunma ürünleri şu anda yalnızca tam montaj için ölçülebilir. Verimle ilgili olarak, uygun şekilde eğitilmiş bir kişi, normal bir iş gününde 50'ye kadar montaj hazırlayabilir ve ana darboğaz sıkıştırma prosedürüdür. Okuma yöntemlerinden bazıları birbirini dışlasa da, mekanik özellikleri ve sekretom bileşenlerini aynı numune üzerinde tekrar tekrar değerlendirmek ve ayrıca hücre popülasyonu kompozisyonu (akış sitometrisi), hücre transkriptomu (RT-qPCR, RNA dizilimi) veya matris ve hücre dağılımı (immünositokimya/floresan mikroskobu) uç noktalarda. Önceki yayınlarda, bu yöntemler, lezyon benzeri bir nişe maruz kalan kor // fibroblast ve kor // makrofaj topluluklarında hücreler arası, bölümler arası etkileşimleri kapsamlı bir şekilde karakterize etmek için kullanılmıştır84,85. Bu çalışmada, asambloid model sisteminin, farklı mikroçevresel uyaranlar altında çekirdek ve dışsal endotel hücreleri arasındaki çapraz bölmeli etkileşimi araştırma yeteneği araştırılmıştır.
Model sisteminin modülerliği, mevcut tasarım yinelemesinin aşağıdaki sınırlamalarının üstesinden gelmek için gerekli olan yöntemin gelecekte iyileştirilmesine izin verir. Bu çalışmada sunulan akış sitometrik analizi ve yakın zamanda yayınlanan tek hücreli RNA dizileme verileri, tendon çekirdeğinde yerleşik tenositlerin ve Aşil tendonundan türetilen popülasyonların daha önce varsayıldığından daha heterojen olduğunu ortaya koydu 24,34,59,84,97. Ek olarak, başlangıçta çekirdek veya hidrojelde yerleşik hücre popülasyonlarının göç davranışı, kültür sırasında asambloid bölümlendirmeyi bulanıklaştırır. Her iki faktör birlikte, transkriptomik farklılıkları belirli hücre tiplerine atfetmeyi ve proliferasyonu göçe dayalı süreçlerden ayırmayı zorlaştırır. Bu sınırlama, son in vivo çalışmalarda karakterize edilen sağlıklı veya hastalıklı tendonların hücresel bileşimine dayalı olarak floresanla aktive edilen hücre sıralaması (FACS) ile girdi popülasyonunun rafine edilmesi, tek hücreli RNA dizilimi uygulanarak okumanın iyileştirilmesi ve mikroskopi sırasında bir EdU (5-etinil-2'-deoksiüridin) boyama gibi proliferasyon belirteçlerinin entegre edilmesiyle aşılabilir.
Burada sunulan asambloidler, vücudun geri kalanından kopuk hastalıklı organları simüle eden şu anda mevcut olan in vitro sistemlerin çoğuyla bir zayıflığı da paylaşmaktadır98,99. Bununla birlikte, burada kullanılan kültür odası tabanlı platform, model sistemini, farklı organları taklit eden asambloidlerin birbirine bağlandığı ve organlar arası etkileşimlerin incelenebildiği çok organlı bir platforma entegrasyon için iyi konumlandırmaktadır.
Özünde, model sistemi pozisyonel kemirgen tendonlarına dayanmaktadır ve bu da kendine özgü dezavantajlarla sonuçlanır. İlk olarak, sonuçların çevrilebilirliği, tendon hastalıklarıgeliştirmeyen veya bunlardan muzdarip olmayan vahşi tip fareler tarafından engellenmektedir 8,100,101. İnsanlardan alınan doku ve hücrelerin veya tendon hastalığının özelliklerini sergileyen yeni geliştirilen fare suşlarının entegre edilmesi bu sorunu hafifletebilir102. İnsan bazlı bir asambloid'e geçiş, farklı hastalıklı tendonlardan (yani tendinit, tendinoz veya peritendinit) hasta kaynaklı dokularla ve hatta daha kişiselleştirilmiş tedavi programlarının kilidini açabilecek tedaviye dirençli donörlerle yapılan çalışmaları mümkün kılacağı için özellikle ilginçtir. İkincisi, murin kuyruk tendonu eksplantları, aşırı yüklenmeye bağlı mikro hasarı özellikle iyi idare etmez, bu da model sistemin akut tendon hasarının incelenmesi için uygulanabilirliğini sınırlar.
Tüm bu nedenlerden dolayı, eksplant // hidrojel toplulukları, niş kaynaklı mikro hasara yanıt olarak tendon çekirdek biyolojisini, matris yapısı-fonksiyon etkileşimlerini ve spesifik hücre popülasyonları arasındaki çapraz bölmeli etkileşimleri incelemek için birinci sınıf bir konumdadır. Bu oldukça yüksek verimli çalışmalardan elde edilen içgörüler, in vivo araştırma ve tedavi geliştirmeye yön verebilir.

Hareketi sağlamak için kas kuvvetlerini kemiklere aktarma işlevlerinde, tendonlar insan vücudunda meydana gelen en aşırı mekanik streslerden bazılarıyla karşı karşıyadır 1,2,3. Yaşlanan toplumlar, artan obezite prevalansı ve mekanik olarak zorlu spor aktivitelerinin artan popülaritesi nedeniyle, gelişmiş ülkelerde tendon hastalıkları ve yaralanmalarının prevalansının artacağı tahmin edilmektedir 4,5,6. Bu artışla mücadele etmek için yeni kanıta dayalı ve hastalık değiştirici tedavi rejimlerinin geliştirilmesi, şu anda mevcut olan model sistemlerinsınırlamaları nedeniyle engellenmiştir 1,7,8.
İdeal olarak, hastalık ve yaralanma onarım modelleri, hedef organın tanımlanmış bir dizi girdi parametresini (hastalık tetikleyicilerini taklit ederek, Tablo 1) ölçülebilir çıktı parametrelerine (hastalık ayırt edici özelliklerini temsil eden, Tablo 2) nasıl işlediğinin incelenmesine izin verirken, kafa karıştırıcı faktörleri kontrol eder. Bu tür model sistemleri kullanan çalışmalar daha sonra hastalık ve yaralanma onarımının altında yatan (pato-) fizyolojik süreçleri tanımlayabilecek ve kliniklerde hastalık ve yaralanma özelliklerini önlemek veya azaltmak için kullanılabilecek bilgileri edinebilecektir. Bu prensibi tendonlara uygulayarak, yararlı bir model sistemi, aşağıdaki ayırt edici özellikleri kapsayan hastalık ve yaralanmaya in vivo tendon yanıtının merkezi kısımlarını özetlemelidir: mikro hasar, inflamasyon, neovaskülarizasyon, hipersellülarite, hızlandırılmış matris döngüsü ve dekompartmantalizasyon 9,10,11,12,13,14,15 . Bu ayırt edici özellikleri temel alarak, başarılı bir tendon hastalığı ve yaralanma onarım modeli sistemi için aşağıdaki gereksinimler çıkarılabilir.
Mekanik aşırı yüklenmenin tendon hasarı ve hastalık patogenezinde merkezi bir faktör olduğu varsayılmaktadır ve bu nedenle mikro hasar oluşturmak için yaygın olarak kullanılan deneysel bir yaklaşımdır16. Bu nedenle, kontrol edilebilir mekanik yüklenebilirlik, tendon hastalığı ve yaralanma onarım modelleri için birincil ön koşuldur. İdeal olarak, model sistemi üç ana modu etkinleştirir: tek esneme-hasar yükleme, yorulma yükleme ve boşaltma 8,17,18. Mekanik deformasyon üzerine, dokuda yerleşik hücreler, boşaltma sırasında veya entezin yakınında meydana gelen çekme kuvvetleri, kesme kuvvetleri (hücreleri çevreleyen kollajen liflerinin kayması nedeniyle) ve sıkıştırma kuvvetlerinin karmaşık bir kombinasyonunu yaşar19,20. Model sistemleri, bu karmaşık yükleme düzenlerini mümkün olduğunca yakın bir şekilde yeniden oluşturmalıdır.
Matris mikro hasarını ortaya çıkarmanın alternatif bir yolu, (pro-) inflamatuar sitokinler, oksidatif stres veya yüksek glikoz konsantrasyonları gibi tendon hastalığı ve yaralanması için sistemik yatkınlıkları taklit eden biyokimyasal stres faktörlerinden yararlanmaktır 21,22,23. Sonuç olarak, kontrol edilebilir bir niş mikroçevre, bir tendon hastalığı ve yaralanma onarım modeli sistemi için avantajlıdır.
Model sistemlerin inflamasyonu, neovaskülarizasyonu ve hiper hücreselliği özetleyebilmesi için ortak bir ön koşul, bu süreçleri yönlendiren hücre popülasyonlarının seçici varlığıdır24. Enflamatuar süreçler için, bu popülasyonlar nötrofilleri, T hücrelerini ve makrofajları içerirken, neovaskülarizasyonu incelemek için endotel hücrelerine ve perisitlere ihtiyaç duyulacaktır 25,26,27,28,29. Tendon fibroblastları sadece tendon onarımı için hayati öneme sahip olmakla kalmaz, aynı zamanda proliferatif ve göç eden hücreler olarak tendon hastalığında gözlenen lokal hiperselülaritedende kısmen sorumludur 30,31,32,33,34,35,36.
Yerleşik hücre popülasyonlarındaki değişikliklerin yanı sıra, tendon matriksi bileşimi tendon hastalığı ve hasarında da değişir 7,37,38,39,40. Hastalıkla ilgili doğru mikroçevresel ipuçlarını sunmak için, model sistemler, örneğin kollajen-1, kollajen-3 ve hücresel fibronektin41'in ilgili orantılı kombinasyonlarını etkinleştirerek, hedeflenen hastalık veya yaralanma aşamasına uygun bir hücre dışı matris bileşimini entegre edebilmelidir.
Sağlıklı tendonların tendon çekirdeğine ve dışsal bölmelere (yani endotenon, epitenon ve paratenon) bölümlere ayrılması, işlevlerinin merkezinde yer alır ve genellikle hastalıklı veya yaralı tendonlarda bozulur 1,42,43,44,45,46,47 . Bu nedenle, 3D tendon bölümlendirmesinin tendon model sistemlerine dahil edilmesi, yalnızca bölümlere ayırma ve yeniden bölümlendirmenin altında yatan süreçleri daha yakından simüle etmek için gerekli değildir, aynı zamanda sitokinlerin ve besinlerin doğru uzay-zamansal gradyanlarının oluşturulmasına da yardımcı olur48,49.
Son olarak, modülerlik, model sistemlerin bir başka merkezi varlığıdır ve araştırmacıların, araştırılan süreçler sırasında daha önce tanımlanan stres faktörlerinin doğru göreceli katkısını ve etkileşimini birleştirmelerine olanak tanır 8,17.
Optimum girdi modalitelerini seçmenin yanı sıra, ortaya çıkan çıktıdaki değişiklikleri ölçebilmek, gözlemleyebilmek ve izleyebilmek önemli bir adımdır. Model sistemin mekanik özellikleri (yani, ayak bölgesi uzunluğu, doğrusal elastik modül, maksimum gerilme gerilmesi, maksimum gerilme gerilmesi, yorulma mukavemeti ve gerilme gevşemesi), tendonun ana işlevini50,51,52 karakterize ettikleri için burada merkezidir. Bu fonksiyonel değişiklikleri doku düzeyindeki değişikliklerle ilişkilendirmek için, yapısal matris hasarını tespit eden (kollajen) ve hastalık ve onarımla ilgili hücre popülasyonlarının proliferasyonunu ve alımını izleyen yöntemlerin etkinleştirilmesi önemlidir 30,53,54,55,56,57,58,59,60.
Ortaya çıkan hücre-hücre ve hücre-matris karışmasını incelemek için, proteinlerin miktar tayini için yeterli miktarlarda izole edilebilmesi veya işaretlenebilmesi gerekir (yani, ELISA, proteomik, immünohistokimya, akış sitometrisi)14,21,61,62. Popülasyona veya en azından bölmeye özgü gen ekspresyon analizi de mümkün olmalıdır (yani, floresanla aktive edilen hücre sıralama [FACS], tek hücreli/toplu RNA dizileme ve gerçek zamanlı kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (RT-qPCR))21,24,27,63. Model sistemi, yukarıda belirtilen çıktı parametrelerinin çoğunun aynı numune üzerinde ve birden fazla numune üzerinde, yüksek verimli çalışmaların kilidini açacak kadar hızlı bir şekilde ölçülmesine izin vermelidir.
İnsan tendon hastalığı ve yaralanma onarımını incelemek için şu anda mevcut olan model sistemler arasında, insan vücudunun kendisi elbette en temsili olanıdır. Aynı zamanda deneysel müdahale ile en az uyumlu olanıdır. Akut tendon yaralanması olan hastalar klinik çalışmalar için bol miktarda bulunurken, erken tendinopatisi (en yaygın tendon hastalığı) olan hastalar büyük ölçüde semptomsuzdur ve genellikle daha ciddi değişiklikler ortaya çıkana kadar klinik olarak tespit edilmez 14,64,65. Bu, tendon homeostazının raydan çıktığı kritik anı ve bu raydan çıkmanın arkasındaki mekanizmalarıbelirlemeyi zorlaştırır 16,66,67,68,69. Ek olarak, sağlıklı tendonlardan biyopsi çıkarmak, kalıcı hasara neden olabileceğinden etik olarak zordur. Ön çapraz bağ rekonstrüksiyonu cerrahisinden elde edilen hamstring tendon kalıntıları genellikle sağlıklı kontroller olarak kullanılır, ancak tendon hastalığı ve yaralanmasından yaygın olarak etkilenen rotator manşet, Aşil ve patellar tendonlara kıyasla işlev, mekanik özellikler, hücre popülasyonları ve matris bileşimi açısından tartışmalı bir şekilde farklılık gösterir 70,71,72,73.
İn vivo hayvan modelleri daha erişilebilir ve izlenebilirdir, ancak kullanımları hayvanlar üzerinde önemli bir etik yük ve araştırmacılar üzerinde ekonomik maliyet getirmektedir. Ek olarak, popüler model hayvanların çoğu ya kendiliğinden tendinopatik lezyonlar geliştirmez (yani sıçanlar, fareler, tavşanlar) ya da içinde yer alan çok hücreli iletişim yollarını izlemek için gerekli primerlerden ve genetiği değiştirilmiş suşlardan yoksundur (yani atlar, tavşanlar).
Basit 2D in vitro model sistemleri, karmaşıklık/izlenebilirlik spektrumunun diğer tarafındadır ve daha kontrol edilebilir bir dizi tetikleyiciye yanıt olarak belirli hücreler arası iletişim yollarının kontrollü, zaman açısından verimli çalışmasına daha iyi izin verir 8,74. Bununla birlikte, bu basitleştirilmiş sistemler genellikle tendon işlevselliğinin merkezinde yer alan çok boyutlu mekanik yüklemeyi (yani gerilim, sıkıştırma ve kesme) özetlemekte başarısız olur. Ek olarak, doku kültürü plastiğinin (çok) yüksek sertlikleri, ilgilenilen hastalık durumunu taklit etmesi amaçlanan kaplamalar tarafından sağlanan herhangi bir matris ipucunu geçersiz kılma eğilimindedir75,76.
Bu dezavantajın üstesinden gelmek için, bileşimi en azından kısmen istenen hastalık durumu77,78,79 ile eşleştirilebilen yüklenebilir bir matris sağlamak için giderek daha karmaşık doku mühendisliği 3D model sistemleri geliştirilmiştir. Yine de, bu sistemler sadece kompleksi doğru bir şekilde kopyalamakla kalmaz in vivo hücre dışı matris bileşimleri ve hücresel yükleme paternleri aynı zamanda genellikle uzun vadeli yüklenebilirlikten ve tendon hastalığını ve yaralanma onarımını koordine eden bölümler arası iletişim yollarını incelemek için gereken bölmeli arayüzlerden yoksundur 48,49,80.
Ex vivo tendon eksplant model sistemleri, periselüler nişler, çapraz bölmeli bariyerler ve ayrıca uzay-zamansal sitokin/besin gradyanları içeren ve gerildiğinde karmaşık yükleme modellerini özetleyen yerleşik bir in vivo benzeri matris bileşiminin belirgin avantajına sahiptir8. Boyuta bağlı besin difüzyon sınırlarının bir sonucu olarak, daha büyük hayvan modellerinden (yani atlardan) elde edilen eksplantların, tendon hastalığı ve yaralanma onarımının uzun süreli çalışması için canlı tutulması zordur 81,82,83. Bu arada, murin türlerinden (yani Aşil tendonu, patellar tendon) daha küçük eksplantların tekrarlanabilir şekilde kenetlenmesi ve mekanik olarak yüklenmesi zordur. Boyutları ayrıca, numuneleri bir araya getirmeden ve verimi düşürmeden hücre, protein ve gen düzeyinde okumalar için toplanabilecek malzeme miktarını da kısıtlar. Bu anlamda, murin kuyruğu tendon fasikülleri, tek bir fareden büyük miktarlarda kolayca temin edilebildikleri, kompleks in vivo periselüler matris bileşimini korudukları ve hücresel yükleme modellerini özetledikleri için tendon hastalığı ve yaralanma onarımının yüksek verimli çalışmasının kilidini açma potansiyeli sunar. Bununla birlikte, ekstraksiyon işlemi sırasında, dışsal bölmelerinin çoğunu kaybederler ve bunlarda, şimdi tendon hastalığını tetiklediği ve onardığı düşünülen vasküler, immün ve fibroblast popülasyonları bulunur 8,18.
Bu boşluğu doldurmak için, murin kuyruğu tendonundan türetilen kor eksplantlarının avantajlarını 3D hidrojel bazlı model sistemlerin avantajlarıyla birleştiren bir model sistem geliştirilmiştir. Bu model sistem, kuyruk tendonu eksplantları84,85 etrafına dökülen hücre yüklü (kollajen-1) bir hidrojelden oluşur. Bu yazıda, endotel hücre yüklü tip-1 kollajen hidrojel (dış bölme) içinde çekirdek eksplantlarının (iç bölme) birlikte kültürlenmesiyle elde edilebilecek faydalı okumaların yanı sıra gerekli üretim adımları ayrıntılı olarak verilmiştir.

<table><tbody><tr><td>0,4 mm x 25 mm enjeksiyon iğnesi (G27)</td><td>Sterican</td><td>9186174</td><td></td></tr><tr><td>3D baskı filamenti: Berrak polilaktik asit prusament</td><td>Prusa</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>%4 formaldehit</td><td>Roti-Histofix</td><td>P087.4</td><td></td></tr><tr><td>Accutase hücre ayırma çözeltisi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6964-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Amfoterisin</td><td>VWR</td><td>L0009-100</td><td></td></tr><tr><td>Takılabilir dijital C yuvalı kamera: Moticam 2</td><td>Motic</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Cıvata vidası M3 x 16 mm, paslanmaz çelik</td><td>RS PRO</td><td>1871235</td><td></td></tr><tr><td>Cıvata vidası M3 x 6 mm, paslanmaz çelik</td><td>RS PRO</td><td>1871207</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5670</td><td></td></tr><tr><td>CD146 antikoru: PE anti-fare</td><td>BioLegend</td><td>134703</td><td></td></tr><tr><td>CD206 antikoru: Alexa Fluor 488 anti-fare</td><td>BioLegend</td><td>141709</td><td></td></tr><tr><td>CD31 antikoru: Alexa Fluor 488 anti-fare</td><td>BioLegend</td><td>102413</td><td></td></tr><tr><td>CD86 antikoru: PE anti-fare</td><td>BioLegend</td><td>105007</td><td></td></tr><tr><td>Kollajenaz I</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17100017</td><td></td></tr><tr><td>Kollajenaz IV&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>17104-019</td><td></td></tr><tr><td>Diyalize Fetal Sığır Serumu (FBS)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>F0392-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Dimetil sülfoksit (DMSO)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>7000183</td><td></td></tr><tr><td>Dispase II</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4693-1G</td><td></td></tr><tr><td>DMEM / F12 &nbsp;</td><td>Sigma</td><td>7002211</td><td></td></tr><tr><td>Dübel Pimi, 3 mm x 16 mm, paslanmaz çelik</td><td>Accu</td><td>HDP-3-16-A1</td><td></td></tr><tr><td>Dragon Skin 10 Yavaş/1 silikon</td><td>KauPO</td><td>09301-004-000001</td><td></td></tr><tr><td>Endopan 3 Kit</td><td>Pan-Biotech</td><td>P04-0010K</td><td></td></tr><tr><td>Endotel hücre büyüme takviyesi&nbsp;</td><td>Lonza</td><td>CC-3162</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf güvenli kilitli plastik tüpler (1,5 mL)</td><td>Eppendorf</td><td>30121023</td><td></td></tr><tr><td>Ethidium homodimer, EthD-1, DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>46043-1MG-F</td><td></td></tr><tr><td>F4/80 antikorunda 2 mM stok: Apc/fire 750 anti-fare</td><td>BioLegend</td><td>123151</td><td></td></tr><tr><td>Falcon plastik tüp (15 mL)</td><td>Corning</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>Falcon plastik tüp (50 mL)</td><td>Corning</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Akış sitometresi: LSR II Fortessa</td><td>BD Bioscience</td><td>23-11617-02</td><td></td></tr><tr><td>Jelatin</td><td>Invitrogen</td><td>D12054</td><td></td></tr><tr><td>Hellmanex III alkali temizleme konsantresi</td><td>Sigma</td><td>Z805939-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3149-10KU</td><td></td></tr><tr><td>Hidroksiprolin testi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>MAK008</td><td></td></tr><tr><td>Görüntü analiz yazılımı: Motic Images Plus 3.0 ML</td><td>Motic</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>L-Askorbik Asit Fosfat Magnezyum Tuzu n-Hidrat</td><td>Wako Kimyasalları</td><td>013-19641</td><td></td></tr><tr><td>LSE Düşük Hızlı Orbital Çalkalayıcı</td><td>Corning</td><td>6780-FP</td><td></td></tr><tr><td>MEM esansiyel olmayan amino asitler</td><td>Sigma</td><td>7002231</td><td></td></tr><tr><td>Fare makrofaj uyarıcı faktör ( m-CSF)</td><td>PeproTech</td><td>315-02-50ug</td><td></td></tr><tr><td>MSD tahlili</td><td>Mesoscale Discovery</td><td>çeşitli</td><td></td></tr><tr><td>NucBlue</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R37605</td><td></td></tr><tr><td>Naylon örgü süzgeç kapağı, 100 & m</td><td>Corning</td><td>734-2761</td><td></td></tr><tr><td>Orijinal Prusa i3 MK3S 3D yazıcı</td><td>Prusa</td><td>i3 MK3S</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin-Streptomisin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>Fosfat tamponlu salin (PBS), ph 7.4, steril, 10 L</td><td>Gibco</td><td>10010001</td><td></td></tr><tr><td>Puromisin</td><td>Gibco</td><td>A1113803</td><td></td></tr><tr><td>RBC lizis tamponu</td><td>VWR</td><td>786-650</td><td></td></tr><tr><td>rekombinant m-CSF&nbsp;</td><td>PeproTech</td><td>315-02</td><td></td></tr><tr><td>RNA ekstraksiyon kiti: Rneasy plus Micro</td><td>Qiagen</td><td>74034</td><td></td></tr><tr><td>Dilimleme yazılımı: PrusaSlicer</td><td>Prusa</td><td>NA</td><td>Sürüm 2.6.0 veya daha yüksek</td></tr><tr><td>Steril Hücre Süzgeci 100 ve mikro; m</td><td>Fisherbrand</td><td>22363549</td><td></td></tr><tr><td>Cerrahi neşter bıçağı No. 21</td><td>Swann-Morton</td><td>307</td><td></td></tr><tr><td>Trizol reaktifi</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15596018</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin-EDTA (%0,5)</td> <td>Gibco</td><td>15400054</td><td></td></tr></tbody></table>

hastalık ve onarımda hücresel karışmayı araştırmak için mühendislik tendon toplulukları

Engineering Tendon Assembloids to Probe Cellular Crosstalk in Disease and Repair

Tendonlar, kas kuvvetlerini kemiklere aktararak hareketi sağlar. Kollajen lifleri ve stromal hücre popülasyonlarından oluşan sert bir tendon çekirdeğine güvenirler. Bu yük taşıyan çekirdek, dışsal tendon bölmesini içeren sinovyal benzeri bir doku tabakası tarafından kuşatılır, beslenir ve onarılır. Bu sofistike tasarıma rağmen, tendon yaralanmaları yaygındır ve klinik tedavi hala fizyoterapi ve cerrahiye dayanmaktadır. Mevcut deneysel model sistemlerinin sınırlamaları, yeni hastalık modifiye edici tedavilerin ve nüksü önleyici klinik rejimlerin geliştirilmesini yavaşlatmıştır. 
İn vivo insan çalışmaları, sağlıklı tendonları onarım cerrahisi sırasında örneklenen son dönem hastalıklı veya rüptüre dokularla karşılaştırmakla sınırlıdır ve altta yatan tendon hastalığının uzunlamasına çalışmasına izin vermez. İn vivo hayvan modelleri ayrıca opak fizyolojik karmaşıklık, hayvanlar üzerindeki etik yük ve kullanımlarıyla ilişkili büyük ekonomik maliyetler ile ilgili önemli sınırlar sunar. Ayrıca, in vivo hayvan modelleri, ilaçların ve çok hücreli, çok dokulu etkileşim yollarının sistematik olarak araştırılması için uygun değildir. Daha basit in vitro model sistemler de yetersiz kalmıştır. Bunun en önemli nedenlerinden biri, tendon hücrelerini ve işlevlerini anlamlı bir şekilde incelemek için gerekli olan üç boyutlu mekanik yüklemenin yeterince kopyalanamamasıdır. 
Burada sunulan yeni 3D model sistemi, murin kuyruğu tendon çekirdek eksplantlarından yararlanarak bu sorunların bazılarını hafifletir. Daha da önemlisi, bu eksplantlara tek bir fareden çok sayıda kolayca erişilebilir, hücresel düzeyde 3D yerinde yükleme modellerini korur ve in vivo benzeri bir hücre dışı matrise sahiptir. Bu protokolde, tendon çekirdeği eksplantlarının, kas kaynaklı endotel hücreleri, tendon kaynaklı fibroblastlar ve kemik iliği kaynaklı makrofajlarla yüklü kollajen hidrojeller ile nasıl artırılacağına dair adım adım talimatlar verilmiştir. Ortaya çıkan tendon topluluklarının, hastalık ve yaralanma sırasında ortaya çıkan çok hücreli karışmayı araştırmak için mekanik olarak veya tanımlanmış mikroçevresel uyaranlar yoluyla nasıl zorlanabileceği gösterilmiştir.

Bileşen izolasyonu (Şekil 1 ve Şekil 2) Topluluk ko-kültüründe çekirdek eksplantları ve hücre popülasyonlarını kullanmadan önce, bu bileşenler mikroskop altında kontrol edilmelidir (Şekil 1). Çekirdek eksplantları düzgün bir çapa (100-200 μm) sahip olmalı ve görünür bükülme veya kırışıklık olmamalıdır. Endotel hücreleri, diğer hücrelerle temas halinde uzun bir şekil sunmalıdır, ancak izolasyondan düşük bir başlangıç verimi nedeniyle çok düşük bir yoğunlukta tohumlandıklarında sunmazlar. Bu durumda, endotel hücreleri, hücre iskeleti uzantıları ile daha yuvarlak bir şekil alır ve belirgin şekilde daha yavaş çoğalır. 7-10 gün sonra 1:5 oranında bölün. Aşil tendonlarından izole edilen tendon fibroblastları, 1:6 bölündüklerinde 1-2 pasaj (her biri 10-14 gün) içinde insan muadillerine kıyasla daha yuvarlak bir morfoloji alırlar. Makrofajlar fibroblastlardan veya endotel hücrelerinden çok daha küçüktür ve izolasyondan sonra çoğalmazlar. Partiye bağlı olarak, şekilleri piramidalden yuvarlağa değişebilir.
Hücresel bileşenlerin fenotipleri akım sitometrisi ile doğrulandı. Endotel hücreleri için bir belirteç olarak konjuge bir CD31 antikoru kullanıldı (Şekil 2A <img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65987/65987fig01.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65987/65987fig01large.jpg" target="_blank"></a><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65987/65987fig02.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65987/65987fig02large.jpg" target="_blank"></a><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65987/65987fig03.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65987/65987fig03large.jpg" target="_blank"></a><img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65987/65987fig04.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65987/65987fig04large.jpg" target="_blank"></a><img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65987/65987fig05.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65987/65987fig05large.jpg" target="_blank"></a><img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65987/65987fig06.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65987/65987fig06large.jpg" target="_blank"></a><a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65987/Table%201.xlsx" target="_blank"></a><a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65987/Table%202.xlsx" target="_blank"></a><a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65987/SupplementalFile1_clampholder_mountingstation_siliconemold.3mf" target="_blank"></a><a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65987/SupplementalFile2_clamp_holder_right.PDF" target="_blank"></a><a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65987/SupplementalFile3_clamp_holder_left.PDF" target="_blank"></a><a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65987/SupplementalFile4_mounting_platform.PDF" target="_blank"></a><a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65987/SupplementalFile5_metalclamps.PDF" target="_blank"></a><a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65987/SupplementalFile6_CellfreeHydrogel_Shrinkage.pdf" target="_blank"></a><a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65987/SupplementalFile7_Assembloid_DevitalizedCore.pdf" target="_blank"></a>

Burada, yük taşıyan tendon çekirdek dokusu ile hastalık ve yaralanma ile aktive olan hücre popülasyonlarını içeren bir dışsal bölme arasındaki tendon hücresel karışmasını taklit etmek için bir asambloid model sistemi sunuyoruz. Önemli bir kullanım durumu olarak, sistemin dışsal endotel hücrelerinin hastalıkla ilgili aktivasyonunu araştırmak için nasıl konuşlandırılabileceğini gösteriyoruz.

Hastalık ve Onarımda Hücresel Karışmayı Araştırmak için Mühendislik Tendon Toplulukları

Tendons enable locomotion by transferring muscle forces to bones. They rely on a tough tendon core comprising collagen fibers and stromal cell ...

Tendonlar, kuvvetleri kastan kemiğe ileterek hareketi kolaylaştırır. Tendon yaralanması yaygın olmasına rağmen, bunların tedavisi oldukça zordur ve hastalar için sonuç genellikle kötüdür. Şu anda, tendon yaralanmasının tüm tedavileri bir tür fizyoterapi içermektedir ve bu, mekanik kuvvetlerin tendon biyolojisinde bu kadar merkezi bir rol oynadığı gerçeğini yansıtmaktadır.Tendon hasarı ve onarımını incelemek için iyi deneysel modeller gerçekten mevcut değil, bu yüzden laboratuvarım aktif olarak tendon fizyolojisi ve patofizyolojisinin önemli özelliklerini daha iyi yakalayabilecek yeni modeller geliştiriyor. Daha önceki çalışmalarda, tendonun yük taşıyan kısmını temsil eden tendon çekirdeğinin kendi başına çok sınırlı bir onarım kapasitesine sahip olduğunu gösterebilmiştik. Alandaki diğer araştırmalarla birleştiğinde, yaralı bir çekirdeğin iyileşmesine yardımcı olmak için dışsal tendon bölmesinden hücreler alacağını varsaydık.Doku mühendisliği tendon model sistemi, yüklenebilir bir 3D ortam sağlayabilir, ancak bir in vivo ekzoselüler matrisin karmaşıklıklarına uymaz. Eksplant model sistemleri bunu yapar, ancak genellikle canlı tutulmaları ve daha uzun süreler boyunca mekanik olarak yüklenmeleri zordur veya onarım işlemleri için merkezi olan dış bölmeden yoksundurlar. Benzersiz model sistemimiz, deniz kuyruğu tendonundan türetilen kor eksplantlarının avantajlarını 3D hidrojel baz sistemlerininkilerle birleştirir.Yapay bir dış bölmenin yanı sıra yüklenebilir, in vivo benzeri bir çekirdek matris sağlar. Bileşimi, araştırma hipotezine ve ikisi arasındaki biyomimetik çapraz bölmeli bariyere göre ayarlanabilir. Hibrit hidrojel eksplant topluluklarımız, ince ayarlanabilir bir mikro ortamda tendon çekirdek biyolojisini, matris yapısı fonksiyon etkileşimlerini ve belirli hücre popülasyonları arasındaki çapraz bölmeli etkileşimleri incelemek için birinci sınıf bir konumdadır.Bu sistemle yapılan çalışmalardan elde edilen keşifler, in vivo araştırma ve tedavi geliştirmeye rehberlik edecektir.

engineering-tendon-assembloids-to-probe-cellular-crosstalk-disease

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

el fleksör tendonlar sıklıkla bozulmuş el fonksiyonu yol yaralandı. Bununla birlikte, yara izi dokusunu iyileşme yanıtı iyi karakterize değildir. fleksör tendon iyileşmesi bir fare modeli burada gösterilmiştir. Bu model iyileşme sürecinin genel anlayış geliştirmek ve şifa iyileştirmek için tedavi yaklaşımları değerlendirmek.

Murin Flexor Tendon yaralanmaları ve onarım Cerrahisi

Bu makale, bir lentiviral vektör ve bir 2D biyoreaktör aracılığıyla tek eksenli germe kullanarak Skleraxis'in kombine aşırı ekspresyonu ile iPSC'den türetilmiş mezenkimal stromal hücreler üreterek iTenositler üretme prosedürünü açıklamaktadır.

Kombine skleraksi aşırı ekspresyonu ve 2D tek eksenli gerilim yoluyla indüklenmiş pluripotent kök hücre kaynaklı iTenositlerin üretilmesi

Basınç koşulları fizyolojik ve patolojik kalp kapakçığı dokusu tabi yapabilen bir siklik basınç biyoreaktör dizayn edilmiştir. LabVIEW programı, kullanıcıların basınç büyüklüğü, genlik ve frekans kontrol etmenizi sağlar. Bu cihaz, kalp kapakçığı dokusu veya izole hücrelerin mechanobiology incelemek için kullanılabilir.

Devirli Basınç Biyoreaktör Tasarım Ex vivo</emAort Kalp Vanalar> Eğitim

Bu makalede, hücresel öz-montaj hücre kökenli doku halkaları oluşturmak için çok yönlü bir yöntem özetlemektedir. Düz kas hücreleri içine numaralı seribaşı halka şeklinde agaroz kuyuları agrega ve 7 gün içinde sağlam bir üç boyutlu (3D) dokular oluşturmak için sözleşme. Milimetre ölçekli doku halkaları mekanik test için elverişli ve doku montaj için yapı taşları olarak hizmet.

Hücresel Self-Meclis Biyomekanik Analizi ve Doku Mühendisliği, Hücre-Türetilmiş Doku Yüzüklerin Üretiyor yönelik

Bu mikron çaplı daralması bir düzeni sekansından geçerken hücre için gereken süreden daha ölçmek için mikroflüidik bazlı analiz göstermektedir.

Mikroakışkan Tekniği Hücre deformabilitesi Probe

Bu protokolün amacı, doğal cilde benzeyen üç boyutlu tam kalınlıkta bir cilt eşdeğeri oluşturmaktır. Özel olarak yapılmış bir otomatik yaralama cihazı ile, sterilitenin korunması altında hassas ve tekrarlanabilir yaralar oluşturulabilir.

Üç-boyutlu Tam Kalınlığı Deri Üretimi Eşdeğer ve Otomatik Yaralama

Biz nerede bir ikincil hücre tipi bozukluklarına doku ve organoids oluşturmak için bu microfibrous yapının interstisyel uzaya daha fazla numaralı seribaşı bir microfibrous vasküler yatağın mühendislik bir mikrosıvısal bioprinting strateji temel alan genel bir protokol sağlar.

Mikrosıvısal Bioprinting mühendisliği için doku ve Organoids skarların

Bu iletişim kuralı bir dağınık şekilde detaylı Sonlu elemanlar modeli cardiomyocytes hücre içi mimarisinin elektron mikroskobu ve confocal mikroskobu görüntüler oluşturmak için yeni bir yöntem özetliyor. Bu dağınık şekilde detaylı model gücünü vaka çalışmaları kalsiyum sinyal ve bioenergetics kullanarak gösterilmiştir.

Cardiomyocyte sistemleri Biyoloji hücresel mimarisi rolü eğitim için bir Cardiomyocyte bir yapısal olarak gerçekçi Sonlu elemanlar geometrik Model oluşturma

Bu yazıda 1,5 cm'ye kadar tendon boşluğunun mühendislik kollajen grefti ile doldurularak onarılması için in vitro ve yerinde protokol sunulmuştur. Bu, greft konak dokuya olgunlaşana kadar mekanik yükü almak için modifiye edilmiş bir dikiş tekniği geliştirilerek gerçekleştirildi.

Büyük Tendon Kusurlarını Onarmak İçin Doku Mühendisliği Kollajen Greftli Yeni Bir Tenorhaphy Dikiş Tekniği

Biz 3D kültür ve hücreler ve çok hücreli organoids ile deney için cihazlar oluşturmak için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu cihaz, tanımlanan kemoçekici degradeler ile 3D mikro ortamlarda çözünür sinyallere hücresel tepkiler analizi sağlar. Organoids zayıf gürültülü girişleri tespiti tek hücrelerden daha iyidir.

Chemoattractant degradelere Multi-hücresel tepkiler 3D Analizi

Keşfedin, tendon hasarı ve onarım mekanizmalarını incelemek için geliştirilen hibrit hidrojel eksplant assembloid modelini. Bu yenilikçi sistem, fare kuyruk tendonundan elde edilen yük taşıyan çekirdek matrisi ve yapay ekstrensek kompartmanı birleştirerek hücresel etkileşimleri ve iyileşme süreçlerini detaylı şekilde analiz etme imkanı sunar.

Hastalık ve Onarımda Hücresel Karışmayı Araştırmak için Mühendislik Tendon Toplulukları

Daha fazla video keşfet