Mikroakışkan Tekniği Hücre deformabilitesi Probe
September 3rd, 2014
Bu mikron çaplı daralması bir düzeni sekansından geçerken hücre için gereken süreden daha ölçmek için mikroflüidik bazlı analiz göstermektedir.
Aşağıdaki deneyin genel amacı, basit bir mikroakışkan bazlı tahlil kullanarak farklı hücre tiplerinin deformasyon yeteneğini araştırmaktır. Bu, bir dizi mikron ölçekli Daraltma yoluyla hücre geçişinin zaman ölçeğini araştırmak için bir poli dimetil suoksan veya PDMS mikroakışkan cihazı imal edilerek elde edilir, basınçla çalışan akış daha sonra hücreleri mikroakışkan kanallarından geçirmek için kullanılır, bu da deformasyonun ve zamana bağlı gevşemenin test edilmesini sağlar. Ardından, videoları işlemek ve geçiş süresi verilerinin bir histogramını elde etmek için otomatik görüntü analiz programı çalıştırılır.
Sonuçlar, farklı hücre tiplerinin, bir dizi daralma yoluyla geçiş sürelerine bağlı olarak hücre deformasyon kabiliyetinde farklılıklar gösterdiğini göstermektedir. Bu tekniğin atomik kuvvet mikroskobu veya mikro pipet aspirasyonu gibi mevcut tekniklere göre en büyük avantajı, mikroakışkan cihazların yüksek verim kapasiteleriyle başarılı bir şekilde çalışabilmesidir. Diğer mikroakışkan cihazlar da hücre de şekillendirilebilirliğini test etmek için kullanılabilir.
Cihazımızı, hücrelerin pulmoner kılcal yatak gibi fizyolojik bağlamlarda yaygın olan bir geometri olan sıralı daralmalardan geçeceği şekilde tasarlıyoruz. Başlamak için, daralma dizisi kanallarının genişliğini ortalama hücre çapının yaklaşık% 30 ila 50'si ve kanal yüksekliğini hücre çapının en az% 50'si olacak şekilde seçerek mikroakışkan cihazı tasarlayın. Kalıntıları temizlemek ve hücre kümelerini ayırmak için giriş bağlantı noktalarına bir filtre ekleyin.
Deneye başlamadan önce, litografik mikro işleme için standart teknikleri kullanarak cihaz master'ını üretin. Bir profilometre kullanarak desen özelliklerinin yüksekliğini doğrulayın. Ardından, bir basınçlı hava tankı ve bir dizi hava regülatörü ve bağlantı parçası kullanarak basınca dayalı akış için hava kaynağını onarın.
İlk önce bir hava besleme tankı ve manuel regülatör kurun. Ardından, manuel regülatöre uygun olarak elektronik olarak kontrol edilen bir basınç regülatörü kurun. İstenen basıncı girmek için LabVIEW'de yazılan basit kodu kullanın.
Elektro pnömatik dönüştürücü, valf çıkış basıncını mikroakışkan cihaz boyunca belirtilen basınca uyacak şekilde ayarlamak için dahili bir geri besleme döngüsü kullanır. Standart bir akış sitometresi tüpünden bir hücre süspansiyon odası ve tüp üzerinde basınç geçirmez bir sızdırmazlık oluşturan işlenmiş bir kapak monte ederek hücre süspansiyonunun akışını sağlamak için basınçlı bir oda kurun. Basınç odası kapağı, basınçlı hava tankına bağlanan bir giriş ve hücrelerin basınçlı odadan cihaza aktığı bir çıkış olmak üzere iki delik içerir.
Ardından, saniyede en az 100 kare çekim hızına sahip bir kamera ile donatılmış ters çevrilmiş bir mikroskop kurun. Daralma dizisinden akan hücrelerin görüntülerini yakalamak için, daha sonra hücre ortamı çözeltisine az miktarda yüzey aktif madde eklemek, PDMS duvarlarına hücre yapışmasını en aza indirmeye yardımcı olacağından, fosfat tamponlu salin veya PBS içinde bir stok yüzey aktif madde çözeltisi hazırlayın. PDMS bloğunu mikroakışkan kanallarla imal etmek için, 10 gram PDMS bazına bir gram kürleme maddesi ekleyin ve iyice karıştırın.
Karışımı cihazın üzerine dökün. Degas'ı, sıkışan kabarcıklar kaybolana kadar veya yaklaşık 10 ila 20 dakika boyunca vakum uygulanmış bir çan kavanozunda ustalaşın. Bu süreden sonra, AIR PDMS arabiriminde hala kabarcıklar olabilir, bu normaldir.
Bunlar tipik olarak pişirme sırasında dağılacaktır. Ardından, cihaz soğuduktan sonra Degas cihazını 65 santigrat derecede dört saat pişirin. Mikroakışkan cihazları ana kalıptan çıkarın.
Cihazın bir köşesini yavaşça kaldırarak başlayın. Kaldırmanın aksine yavaş ve nazik soyma: PD DMS bloğu düz bir şekilde yukarı doğru hem PDMS hem de master üzerindeki baskıyı azaltır Tek tek mikroakışkan cihazları bir tıraş bıçağıyla PDMS bloğundan kesin ve cihazı master'dan çıkarın Boru ve mikro kanallar arasında erişim için bağlantı portları oluşturmak üzere PDMS cihazında delikler açın. Biyopsi zımbası kullanarak kanal tarafından cihazın dış tarafına doğru delikler açın.
Tozu temizlemek ve PDMS parçalarını yerleştirmek için PDMS cihazını izopropanol ile durulayın. Bir sıkma şişesinden deliklerden sabit bir saf izopropanol akışı yönlendirerek delinmiş deliklerin kalıntılardan arınmış olduğundan emin olun. Filtrelenmiş hava ile kurutun.
Cam alt tabakayı metanol ile durulayarak temizleyin. Daha sonra filtrelenmiş hava ile kurutun ve plazma işleminden önce camın tamamen temiz ve kuru olduğundan emin olmak için beş ila 10 dakika boyunca 200 santigrat derecelik bir sıcak plakaya yerleştirin. Metin protokolünde ayrıntılı olarak açıklandığı gibi, mikroakışkan cihazı mikroskop altında inceleyin.
Kanalların çökmediğinden veya kırılmadığından ve hem giriş hem de çıkış deliklerinin düşük güç hedefi kullanarak doğrudan cihaz kanallarına bağlandığından emin olun. Hücre süspansiyonunu bir akış sitometresi tüpüne yerleştirin ve boruyu mikroakışkan cihaza bağlamadan önce basınç kapağına bağlayın, basıncı yaklaşık 14 ila 21 kilopaskal olarak ayarlayın ve hücre süspansiyonu borunun ucundan çıkana kadar yıkayın. Ardından, hortumu cihaz girişine yerleştirmek için cihazı düz bir yüzeye yerleştirin.
PDMS cihazının alt tarafına yapıştırılan cam kapak kayma nedeniyle kırılgandır. Hücre süspansiyonunu içeren borunun ucunu cihaz girişine yerleştirin. Daha sonra çıkış portuna bir parça boru yerleştirin ve mikroskop tablasının yan tarafına bantlanmış boş bir Falcon tüpü gibi atık toplama için boş bir tüpe yönlendirin.
Basıncı yavaşça yaklaşık 28 kilopaskal'a veya hücreler kanallardan akana kadar artırın. Cihazı, birden fazla kanal görüş alanında olacak ve ekranın altına dik olacak şekilde konumlandırın. Veri analizine başlamak için ana komut dosyası m dosyasını açın ve programı çalıştırın.
Karşınıza çıkan Windows Gezgini penceresinden analiz edilecek ilk videoyu seçin. Seçilen video için kare hızını belirtin ve enter tuşuna basın. Kullanıcıdan dikdörtgen bir kırpma penceresi seçmesini isteyen bir şekil görünecektir.
İlk video için, soldan sağa tüm kanalları kapsayan ve kanal dizisinin ilk ampulünün hemen üzerindeki kanallarla kesişen bir pencere seçin. Üst ve alt kısımda, kırpılan görüntüden daralma bölgelerini seçin. Algoritma, her videonun ilk 50 karesi için hücrelerin segmentasyonunu görüntüler.
Algoritmanın hücreleri doğru bir şekilde bulup bulmadığını belirlemek için sol üstteki görüntüyü yakından izleyin. Birleştirilmiş bir görüntü, kaynak videonun üzerine bindirilir. Tanımlanan hücrelerin konumunu göstermek için, Windows Gezgini penceresinden işlenecek bir sonraki videoyu seçin.
Algoritma tekrar edecektir. Seçilen her video için iptal'i seçin. İstenen tüm videolar, video listesinin eksiksiz olduğunu bildirmek için Windows Gezgini penceresi aracılığıyla eklendikten sonra, HL 60 ve nötrofil tipi HL 60 hücrelerinin geçiş süresi için temsili sonuçlar, tek bir hücrenin bir dizi daralma geçişinden geçmesi için zaman ölçeğini gösterir.
Zaman, yedi daralma serisinde her yedi mikrometre daralmada tek tek hücrelerin bir popülasyonu için ölçülür. 28 Kilopaskal'lık bir sürüş basıncında, HL 60 hücreleri, sonraki daralmalar boyunca paketlenmeden önce ilk daralmayı ortalama 9.3 milisaniyelik bir süre boyunca geçici olarak tıkar. Buna karşılık, nötrofil tipi HL 60 hücreleri, paketlemeden önce ilk daralmayı sadece 4.3 milisaniye boyunca tıkar.
İlk daralmadan geçtikten sonra, hücreler kalan daralmalardan iki ila yedi arasında daha hızlı geçer, HL 60 hücreleri için medyan geçiş süresi 4.0 milisaniye ve nötrofil tipi hücreler için 3.3 milisaniyedir. Hücre popülasyonları arasındaki geçiş süresini karşılaştırarak, hücre deformabilitesindeki farklılıklar ortaya çıkarılabilir. Bu videoyu izledikten sonra, basit mikroakışkan tahlil kullanarak farklı hücre tiplerinin deformasyon kabiliyetini nasıl ölçeceğinizi iyi anlamış olmalısınız.
Burada, hücreleri mikroakışkan kanallardan geçirmek için basınçla çalışan akış kullanılır, bu da tek tek hücrelerin deformasyonunun ve gevşemesinin test edilmesini sağlar.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Genel Bakış
Bu çalışma, mikroakışkan temelli bir analiz kullanarak çeşitli hücre tiplerinin deformabilitesini araştırmaktadır. Analiz, hücrelerin mikron ölçeğindeki daralmalardan geçiş zaman ölçeğini ölçerek, basınçla tahrik edilen akış altında hücre davranışlarına ilişkin bilgiler sağlar.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Hücre biyolojisi
- Mikroakışkanlar
- Biyomekanik
Arka Plan
- Hücre deformabilitesi çeşitli fizyolojik süreçler için kritik öneme sahiptir.
- Hücre deformabilitesini ölçmek için mevcut tekniklerin verimliliğinde sınırlamalar vardır.
- Mikroakışkan cihazlar bu tür analizler için yüksek verimli bir alternatif sunar.
- Bu çalışma, ölçüm doğruluğunu artırmak için PDMS mikroakışkan cihazları kullanır.
Çalışmanın Amacı
- Farklı hücre tiplerinin deformabilitesini değerlendirmek.
- Hücrelerin daralmalardan geçiş sürelerini ölçmek.
- Mikroakışkan analizlerin performansını geleneksel yöntemlerle karşılaştırmak.
Kullanılan Yöntemler
- PDMS mikroakışkan cihazlarının üretimi.
- Hücreleri kanallardan geçirmek için basınçla tahrik edilen akış.
- Video verilerini işlemek için otomatik görüntü analizi.
- Geçiş süresi verilerinin histogram analizi.
Ana Sonuçlar
- Farklı hücre tipleri değişen düzeylerde deformabilite sergiler.
- Geçiş süreleri hücre tipi ve deformabilitesi ile ilişkilidir.
- Mikroakışkan analizi yüksek verimlilik kapasitelerini gösterir.
- Bu yöntem, atomik kuvvet mikroskobu gibi geleneksel tekniklerden daha iyi performans gösterir.
Sonuçlar
- Mikroakışkan temelli analiz, hücre deformabilitesini ölçmek için etkilidir.
- Sonuçlar, hücre tipine göre hücre davranışlarında önemli farklılıklar olduğunu gösterir.
- Bu yaklaşım, çeşitli bağlamlarda hücre mekaniğini anlamamızı geliştirebilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
This microfluidic technique enables high-throughput assessment of cell deformability, a key biophysical property linked to cell function and disease state. By quantifying transit times through micron-scale constrictions, it provides mechanistic insights into cytoskeletal dynamics and membrane mechanics. The method supports early discovery workflows by offering a scalable, quantitative readout for phenotypic screening and target validation in hematologic and immuno-oncology research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by linking cytoskeletal or molecular targets to functional deformability phenotypes.
- Operational Value: Supports biological de-risking through rapid, label-free screening of compound effects on cell mechanics.
- Predictive Value: Generates quantitative, reproducible data that inform target confidence and portfolio triage decisions.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces standardized, high-content datasets on single-cell mechanical responses under controlled flow conditions.
- Operational Value: Enables assay readiness with automated image analysis, reducing manual processing time and increasing throughput to ~100 cells per hour.
- Scalability: Facilitates platform reuse across cell lines and experimental conditions due to modular PDMS device design and pressure-driven flow control.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Connects molecular perturbations to functional biomechanical outputs, supporting translational biomarker discovery in leukemia and neutrophil differentiation models.
- Operational Value: Ensures continuity from discovery to preclinical validation by providing a consistent, quantitative readout of cell state changes.
- Risk Mitigation: Aids in identifying mechanistically distinct cell subpopulations that may influence drug response or resistance.
Pipeline & Workflow Integration
The technique fits within the discovery continuum from target engagement to phenotypic screening, particularly in mechanobiology-focused programs. It complements genomic and proteomic approaches by adding a functional, biomechanical layer to cell characterization.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by measuring how genetic or pharmacological perturbations alter cell transit dynamics through constrictions.
- Screening: Delivers assay-ready, quantitative transit time data that enable comparison across conditions and compound libraries.
- Analytics: Generates histogram-based readouts of transit times that allow statistical comparison of cell populations and detection of subphenotypes.
- Translational Research: Aligns with biomarker development efforts by correlating deformability shifts with differentiation states, as seen in HL-60 to neutrophil-like transitions.
- Enterprise Reuse: Functions as a modular, adaptable platform applicable to diverse cell types and research contexts without major reconfiguration.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing ambiguity in mechanistic links between molecular targets and cellular phenotypes.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization through automated analysis and controlled microfluidic environments.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision efficiency by providing early, functional readouts that reduce reliance on surrogate endpoints.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on their impact on biomechanical hallmarks of disease-relevant cell states.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfluidic device fabrication, PDMS handling, and pressure-driven flow systems.
- Depends on access to high-speed imaging systems (≥100 fps) and automated image analysis pipelines.
- Necessitates standardization of cell preparation, surfactant use, and pressure calibration across users and labs.
- Involves optimization of constriction dimensions relative to target cell size for accurate deformation profiling.
- Limited by the need for single-cell suspensions and compatibility with adherent or fragile cell types without prior adaptation.
