Mikroakışkan Tekniği Hücre deformabilitesi Probe

Aşağıdaki deneyin genel amacı, basit bir mikroakışkan tabanlı analiz kullanarak farklı hücre tiplerinin deforme olabilirliğini incelemektir. Bu, hücrelerin mikron ölçekli bir dizi daralmadan geçiş süresini araştırmak için bir polidimetilsiloksan veya PDMS mikroakışkan cihaz üretilerek gerçekleştirilir; ardından hücreleri mikroakışkan kanallar boyunca hareket ettirmek için basınç güdümlü akış kullanılır ve bu sayede tekil hücrelerin deformasyonu ve zamana bağlı gevşemesi analiz edilebilir. Sonrasında, videoları işlemek ve geçiş süresi verilerinin bir histogramını elde etmek için otomatik görüntü analiz programı çalıştırılır.

Sonuçlar, farklı hücre tiplerinin bir dizi daralmadan geçiş sürelerine bağlı olarak hücre deformabliliğinde farklılıklar gösterdiğini ortaya koymaktadır. Bu tekniğin, atomik kuvvet mikroskobu veya mikropipet aspirasyonu gibi mevcut tekniklere göre temel avantajı, mikroakışkan cihazların yüksek verimlilik kapasiteleriyle başarıyla çalışabilmesidir. Hücre deformabliliğini değerlendirmek için diğer mikroakışkan cihazlar da kullanılabilir.

Cihazımızı, hücrelerin akciğer kılcal damar yatağı gibi fizyolojik ortamlarda yaygın olan bir geometri olan ardışık daralmalar arasından geçeceği şekilde tasarlıyoruz. Başlangıç olarak, daralma dizisi kanallarının genişliğini ortalama hücre çapının yaklaşık %30 ila %50'si ve kanal yüksekliğini hücre çapının en az %50'si olacak şekilde seçerek mikroakışkan cihazı tasarlayın. Kalıntıları temizlemek ve hücre kümelerini ayrıştırmak için giriş portlarına bir filtre ekleyin.

Deneye başlamadan önce, litografik mikro işleme için standart teknikleri kullanarak cihaz kalıbını hazırlayın. Desen özelliklerinin yüksekliğini bir profilometre ile doğrulayın. Ardından, basınç güdümlü akış için sıkıştırılmış hava tankı ve bir dizi hava regülatörü ve bağlantı parçası kullanarak hava kaynağını kurun.

Öncelikle bir hava besleme tankı ve manuel regülatör kurun. Ardından, manuel regülatörle aynı hatta elektronik kontrollü bir basınç regülatörü kurun. İstenen basınç değerini girmek için LabVIEW ile yazılmış basit kodu kullanın.

Elektropnömatik dönüştürücü, valf çıkış basıncını mikroakışkan cihaz boyunca belirlenen basınçla eşitlemek için dahili bir geri besleme döngüsü kullanır. Standart bir akış sitometresi tüpü ve tüp üzerinde basınç sızdırmaz bir mühür oluşturan işlenmiş bir kapaktan hücre süspansiyon odası oluşturarak, hücre süspansiyonunun akışını sağlamak için basınçlandırılmış bir oda kurun. Basınç odası kapağı, basınçlı hava tankına bağlanan bir giriş ve hücrelerin basınçlandırılmış odadan cihaza doğru aktığı bir çıkış olmak üzere iki deliğe sahiptir.

Ardından, saniyede en az 100 kare görüntüleme hızına sahip bir kamera ile donatılmış ters bir mikroskobun kurulumunu yapın. Daralma dizisinden geçen hücrelerin görüntülerini yakalamak için, fosfat tamponlu saline veya PBS içinde bir stok sürfaktan çözeltisi hazırlayın; çünkü hücre ortamı çözeltisine küçük bir miktar sürfaktan eklemek, hücrelerin PDMS duvarlara yapışmasını minimize etmeye yardımcı olacaktır. Mikroakışkan kanallara sahip PDMS bloğu üretmek için, 10 gram PDMS bazına bir gram kürleme ajanı ekleyin ve iyice karıştırın.

Karışımı cihazın üzerine dökün. Hapsolmuş kabarcıklar kaybolana kadar veya yaklaşık 10 ila 20 dakika boyunca, vakum uygulanmış bir çan içinde Master Degas işlemine tabi tutun. Bu sürenin sonunda, HAVA PDMS arayüzünde hâlâ kabarcıklar olabilir; bu durum normaldir.

Bunlar tipik olarak pişirme sırasında yok olacaktır. Ardından, cihaz soğuduktan sonra Degas cihazını 65 °C'de dört saat boyunca pişirin. Mikroakışkan cihazları ana kalıptan çıkarın.

İşleme, cihazın bir köşesini nazikçe kaldırarak başlayın. PDMS bloğunu doğrudan yukarı doğru kaldırmak yerine, yavaş ve nazikçe soyma işlemi PDMS ve kalıp üzerindeki gerilmeyi azaltır. Bireysel mikroakışkan cihazları bir jilet yardımıyla PDMS bloğundan kesin ve cihazı kalıptan ayırın. Tüpler ile mikro kanallar arasında erişim sağlamak için bağlantı portları oluşturmak amacıyla PDMS cihaza delikler açın. Bir biyopsi punch'ı kullanarak, kanal tarafından cihazın dış tarafına doğru delikler oluşturun.

Tozları ve PDMS parçalarını temizlemek için PDMS düzeneğini izopropanol ile durulayın. Bir sıkma şişesi aracılığıyla deliklerden içeriye saf izopropanol akıtarak, delinmiş bölgelerin kalıntılardan temizlendiğinden emin olun. Filtre edilmiş hava ile kurutun.

Cam altlığı metanol ile durulayarak temizleyin. Ardından, plazma işlemi öncesinde camın tamamen temiz ve kuru olduğundan emin olmak için filtrelenmiş hava ile kurutun ve beş ila 10 dakika boyunca 200 degree Celsius sıcaklıktaki bir ısıtıcı tabla üzerinde bekletin. Metin protokolünde detaylandırıldığı üzere, mikroakışkan cihazı bir mikroskop altında inceleyin.

Düşük güçlü bir objektif kullanarak kanalların çökmediğinden veya kırılmadığından ve hem giriş hem de çıkış deliklerinin doğrudan cihaz kanallarına bağlandığından emin olun. Hücre süspansiyonunu bir akış sitometresi tüpüne yerleştirin ve tüpleri mikroakışkan cihaza bağlamadan önce basınç kapağına bağlayın, basıncı yaklaşık 14 ila 21 kilopascal değerine ayarlayın ve hücre süspansiyonu tüpün ucundan çıkana kadar yıkayın. Ardından, tüpleri cihaz girişine yerleştirmek için cihazı düz bir yüzeye koyun.

PDMS cihazının alt kısmına yapıştırılmış olan cam lamella kırılgan olduğu için, hücre süspansiyonunu içeren tüpün ucunu cihaz girişine yerleştirin. Ardından, çıkış portuna bir tüp parçası takın ve bunu, mikroskop tablasının yanına bantlanmış boş bir Falcon tüpü gibi atık toplama amaçlı boş bir tüpe yönlendirin.

Basıncı yavaşça yaklaşık 28 kilopascals değerine veya hücreler kanallar boyunca akana kadar artırın. Cihazı, birden fazla kanalın görüş alanında olduğu ve ekranın altına dik konumlandığı şekilde yerleştirin. Veri analizine başlamak için ana betik m dosyasını açın ve programı çalıştırın.

Açılan Windows Gezgini penceresinden analiz edilecek ilk videoyu seçin. Seçilen video için kare hızını belirtin ve enter tuşuna basın. Kullanıcıdan dikdörtgen bir kırpma penceresi seçmesini isteyen bir şekil görünecektir.

İlk video için, soldan sağa tüm kanalları kapsayan ve kanallarla, kanal dizisinin ilk ampulünün hemen üzerinde kesişen bir pencere seçin. Üst ve alt kısımlarda, kırpılmış görüntüden daralma bölgelerini seçin. Algoritma, her videonun ilk 50 karesi için hücrelerin segmentasyonunu görüntüler.

Algoritmanın hücreleri doğru şekilde konumlandırıp konumlandırmadığını belirlemek için sol üstteki görüntüyü yakından izleyin. İşlenmiş bir görüntü, kaynak videonun üzerine bindirilmiştir. Tanımlanan hücrelerin konumunu göstermek için, Windows Gezgini penceresinden işlenecek bir sonraki videoyu seçin.

Algoritma tekrarlanacaktır. Seçilen her video için iptale basın. Windows Gezgini penceresi aracılığıyla istenen tüm videolar eklendiğinde, video listesinin tamamlandığını belirterek fonksiyonu yönlendirin; HL 60 ve nötrofil tipi HL 60 hücrelerinin geçiş süresi için temsilci sonuçlar, tek bir hücrenin bir dizi daralmadan geçişi için zaman ölçeğini gösterir.

Yedi adet daralmadan oluşan bir seride, her yedi mikrometrelik daralma için tekil hücrelerden oluşan bir popülasyonun süresi ölçülür. 28 Kilopascal'lık bir itme basıncında HL 60 hücreleri, sonraki daralmalardan geçerek paketlenmeden önce ilk daralmayı ortalama 9,3 milisaniye boyunca geçici olarak tıkar. Buna karşılık, nötrofil tipi HL 60 hücreleri, paketlenmeden önce ilk daralmayı yalnızca 4,3 milisaniye boyunca tıkar.

Hücreler ilk daralmadan geçtikten sonra, iki ile yedi arasındaki geri kalan daralmalardan daha hızlı geçerler; medyan geçiş süresi HL 60 hücreleri için 4.0 milisaniye, nötrofil tipi hücreler için ise 3.3 milisaniyedir. Hücre popülasyonları arasındaki geçiş süreleri karşılaştırılarak, hücre deformabilitesindeki farklılıklar ortaya çıkarılabilir. Bu videoyu izledikten sonra, basit mikroakışkan analiz yöntemiyle farklı hücre tiplerinin deformabilitesinin nasıl ölçüleceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

Burada, hücrelerin mikroakışkan kanallar boyunca sürüklenmesi için basınçla yönlendirilmiş akış kullanılmış olup bu yöntem, tekil hücrelerin deformasyonunun ve gevşemesinin analiz edilmesine olanak tanır.