Tek kullanımlık Diagnostics mikroakışkan Uygulamaları

Benim adım Catherine CloudBridge ve Boston Üniversitesi'nde üretim, mühendislik ve biyomedikal mühendisliği profesörüyüm. Ve ben Biyomedikal Mikro Cihazlar ve Mikro Ortamlar Laboratuvarı'nın direktörüyüm. Öncelikle kaynak sınırlı ayarlardaki uygulamalar için tek kullanımlık tanılama yapmak için çalışıyoruz.

Bu yüzden bu cihazları yapmak için mikroakışkanlar kullanıyoruz. Aslında iki çalışma alanıyla ilgileniyoruz. Öncelikle, biyomoleküllerin ve hücrelerin plastik polimer yüzeylerle nasıl etkileşime girdiğine bakmakla ilgileniyoruz.

Bu bizim en büyük şemsiyemiz. Bu çalışma, tek kullanımlık teşhis için mikroakışkan uygulamalarda somutlaştırılmıştır. Laboratuvarda yaptığımız şey mikroakışkan cihazlar.

Kullanmadığımız termoplastik malzemelerde, tipik olarak, çoğu insanın laboratuvarda mikroakışkanlar yapmak için kullandığı kauçuksu malzeme olan PDMS'yi kullanın. Cihazlarımızı termoplastiklerden üretiyoruz. Bu termoplastik cihazları kullanarak mikro ölçekte moleküler biyoloji yapmakla ilgileniyoruz, öyle ki moleküler biyoloji merkezi bir laboratuvardan çok uzaktaki bir alanda yapılabilir.

Bu nasıl çalışıyor, laboratuvarda küçük plastik kartlar yapıyoruz ve bu küçük plastik kartların içinde katı faz ekstraksiyon kolonları veya hücre lizis kolonları veya karıştırma kolonları var. Ayrıca bir tespit tekniği olarak çip üzerinde polimeraz zincir reaksiyonu yapıyoruz. Tüm bunlar küçük bir cihaza entegre edilmiştir ve sonunda, araştırmanın uzun vadeli görünümü, elde taşınabilecek ve tüm ilgili merkez füzyonları ve ısıtma inkübatörleri vb. ile büyük ölçekli bir laboratuvarın bulunamayacağı ortamlarda veya sahada gerçekleştirilebilecek entegre bir cihaz

Bu nedenle, ideal olarak, örneğin mukus olacak olan kan idrar dışkısı veya nazofaringeal sürüntü gibi bir insan örneğiyle başlayabilmek istiyoruz. Ve sonra çipin çıkışında, evet ya da hayır olup olmadığına, birinin belirli bir mikroorganizma ile enfekte olup olmadığına dair bir cevabınız var. Ve bunu yapmanın yolu, hastanın örneğindeki belirli mikroorganizmanın mikroorganizmasına bağlı olarak, o belirli mikroorganizmanın DNA'sını veya RNA'sını aramaktır.

Bu nedenle, ortaya çıkan teknik zorluklar büyük ölçüde bu denklemin numune hazırlama tarafındadır. Bu nedenle, kan, dışkı veya idrarla başladığınızda, içinde çok fazla potansiyel partikül veya PCR veya diğer amplifikasyon tekniklerine inhibitörler bulunan dağınık bir insan örneğinizin olduğu bir durumdan çıkmanız gerekir. Ve sonu, daha sonra aradığınız bir mikroorganizmanın orada olup olmadığını size söyleyecek belirli bir DNA veya RNA'yı çoğaltmak veya aramak için kullanabileceğiniz çok temiz, atılmış bir nükleik asit örneğiyle bitirmek istiyorsunuz.

Yani bu örnekleri temizlemek için birkaç şey yapmanız gerekiyor. İlk olarak, numuneye bağlı olarak, numune çipe gitmeden önce rota filtrelemesi veya hızlı bir döndürme adımı içerebilen numuneyi filtrelemeniz gerekir. Bu yüzden her zaman klinisyenden gelen örneklerle başlamaya çalışıyoruz.

Bu yüzden idrar, dışkı ve nazofaringeal sürüntülerle amacımız, klinisyenin işini normalde yaptığı gibi yapmasını sağlamak ve numuneyi normalde olduğu gibi almasıdır. Ve sonra bu örneği alıyoruz ve cipslerin üzerine koyuyoruz. Dolayısıyla, bu adımda daha fazla filtreleme yapılması gerekiyorsa, bu filtreleme çipte gerçekleşecektir.

İkinci adım, moleküler tahliller yaptığımız için, bu numunedeki hücreleri ve mikroorganizmaları parçalamamız gerekiyor. Bu nedenle, genellikle numuneyi küçük bir gözenek boyutuna sahip bir filtreden geçirmeyi içeren bir lizis adımı gerçekleştiririz. Bazen bu filtrenin içinde karbon nanotüpler gibi nanopartiküller de bulunur, keskin kenarları olan, daha sağlam hücre duvarlarına sahip bazı organizmaları parçalamak için kullanılabilir, C difficile gibi, ki bu bizim üzerinde çalıştığımız gram pozitif bir bakteridir, ki bu çok zordur.

Bu yüzden daha sağlam lizis kolonlarına sahip olmalıyız. Ancak tipik olarak çipin içinde birleşik bir kimyasal ve mekanik parçalama yapıyoruz. Bundan sonra amacımız lizatı almak ve daha sonra saflaştırılmış nükleik asitleri çıkarmaktır.

Böylece lizisi geçiriyoruz, lizatı mikroakışkan çipte rezonansa giren katı bir faz ekstraksiyon kolonunun üzerinden geçiriyoruz. Ve bu katı faz ekstraksiyon kolonu plastikten yapılmış ve zaten üretildikten sonra mikroakışkan kanalın içinde foto ile başlatılan kimya kullanılarak yapılmıştır. Ve ayrıca genellikle silika parçacıkları ile emprenye edilir çünkü nükleik asitleri bağlamak ve serbest bırakmak istiyoruz.

Bazı durumlarda, örneğin mRNA'yı spesifik olarak bağlamak ve serbest bırakmak istiyorsak oligo DT boncuklarını veya belirli proteinleri bağlamak ve serbest bırakmak istiyorsak, üzerlerinde belirli antikorları olan boncukları dahil ettik. Ve tüm bunları yapan çıkarma sütunları yapabiliriz. Ama bugün size silika boncuklarla sase ekstraksiyon kolonunu nasıl yapacağınızı göstereceğiz.

Bunu yaptıktan sonra, lizatı silika kolonunun üzerinden geçirin, tıpkı bir kyogen kitinin makro ölçekli laboratuvarda çalışacağı gibi çalışır. Daha sonra istemediğimiz diğer tüm şeylerden, hücre lizatındaki tüm karbonhidratlardan, lipitlerden ve diğer şeylerden ve insan örneğinin geri kalanında istemediğimiz şeylerden kurtulmak için yıkarız. Ve en sonda, su ile ima ediyoruz.

Ve bu mikro ölçekli katı faz ekstraksiyon kolonları hakkında güzel olan şey, genellikle bir ila beş mikrolitre mertebesinde, çok az miktarda su ile elüte edebilmemizdir. Ve koyduğumuz nükleik asitlerin neredeyse tamamını geri alıyoruz. Yaklaşık %70 ila 90'lık bir verimlilik oranımız var ve bu kanaldan geri aldığımız ilk 10 mikrolitre.

Yani iki ila 10 mikrolitre ile iki kez yıkarsak, oraya koyduğumuz neredeyse tüm nükleik asitleri geri alırız. Bu nedenle, yalnızca PCR özellikli temiz bir numune değil, aynı zamanda standart bir tezgah üstü kit ile elde edebileceğinizden çok daha yüksek konsantrasyonlu bir numunedir. Dolayısıyla, tüm bu numune hazırlama tekniklerinin nihai amacı, insanların yaptığı diğer bazı işlerle uyumlu şeyler yapmaktır.

Bir çip üzerinde PCR amplifikasyonu yapabileceğinizi gösteren sahada çok güzel bir çalışma. Bir RNA virüsü ile uğraşıyorsanız veya bir gen ekspresyon deneyi yapmak istiyorsanız, bir çip üzerinde ters transkriptaz reaksiyonu yapabilirsiniz. Numune hazırlama tekniklerimiz bir çip üzerinde PCR ile doğrudan birleştirilebilir, böylece bu temizleme ve numune hazırlama işlemlerinin hiçbirini tezgahta yapmak zorunda kalmazsınız.

Ve, ve ayrıca küçük bir çip üzerinde çoğullanmış PCR yapmak için gerekli olan küçük hacimleri elde etmek için yapmanız gereken konsantrasyon adımı. Bugün size göstereceğimiz deneyler, PDMS'den değil termoplastikten yapılmış mikroakışkan çipi nasıl bir araya getirdiğimizi gösteriyor. Bu nedenle, bu çiplerin nasıl mühürlendiği, tipik olarak kullanılandan biraz farklı bir üretim süreci gerektirir.

Ve sonra, hem hücre lizisi hem de katı faz ekstraksiyonu için kullanılan polimer monolitleri yapmak için çipin içindeki ışıkla başlatılan kimyayı nasıl yapıyoruz. Ve bu sürecin sonunda, ki bunlar şu anda laboratuvarda modüler süreçlerdir, ancak entegre edilebilirler ve entegre edilmişlerdir, sonunda size suda yüksek konsantrasyonlu bir nükleik asit, RNA ve DNA örneği verir, bu daha sonra bir PCR modülüne veya bir mikroorganizmanın veya bir enfeksiyonun tanımlanmasının meydana gelebileceği başka bir amplifikasyon modülüne aşağı akışa gidebilir. Aslında şu anda üzerinde çalıştığımız bir hibemiz var, Boston Tıp Merkezi'nden İnfluenza ile enfekte olmuş veya olmamış hastalardan insan örnekleri toplamaya başlıyoruz A.So grip mevsimi olduğu için topladığımız örnekler bunlar.

Ve sonra laboratuvarda, birinin Influenza A ile enfekte olup olmadığına bakmak için altın standart tahlilleri yapıyoruz, bu temelde bir kültür tahlili, gerçekleştirilmesi birkaç gün sürüyor. Ve bununla yan yana, bu örnekleri şu anda çipimizin modüllerinden geçiriyoruz. Bu yüzden onları lizis kolonundan geçirdik, katı faz ekstraksiyon kolonundan geçirdik ve ardından altın standart yöntemlerle karşılaştırıldığında ne kadar iyi yaptığımızı görmek için PCR'yi gerçekleştirdik.

İşte şu anda bulunduğumuz aşama bu. Eğer bu deneyler başarılı olursa, sanırım önümüzdeki dört ila altı yıl içinde, belki de entegre bir çipe ve influenza A için tam bir teste sahip olduğumuz bir durumda olacağız ve ayrıca clostridium difficile ve dışkı örnekleri üzerinde çalışıyoruz. Ve biz, biz, sadece cihazın değil, aynı zamanda tahlilin de entegre edilmesine çok yakınız.

Bu nedenle hem tahlil geliştirme hem de çip tasarımı el ele gerçekleşmelidir. Yani belirli bir uygulama için, başucuna ulaşmak, bu, gerçekten hedef odaklı bir süreçtir. Çipi başucu kullanımı için optimize etmek için başladığınız numuneyi ve aradığınız mikroorganizmayı bilmek zorundasınız.

Bu yüzden, bunu prototip bir şekilde gerçekleştirmekten o kadar da uzak olduğumuzu düşünmüyorum. Bunlar bizim nihai hedeflerimiz, bu yüzden umarım oraya ulaşırız.