Tek kullanımlık Diagnostics mikroakışkan Uygulamaları

Benim adım Catherine CloudBridge; Boston Üniversitesi'nde imalat, mühendislik ve biyomedikal mühendisliği profesörüyüm. Ayrıca Biyomedikal Mikro Cihazlar ve Mikroortamlar Laboratuvarı'nın direktörüyüm. Temel olarak, kaynakların kısıtlı olduğu ortamlardaki uygulamalar için tek kullanımlık tanı araçları geliştirmek üzerine çalışıyoruz.

Bu cihazları üretmek için mikroakışkanlar kullanıyoruz. Aslında iki çalışma alanı ile ilgileniyoruz. Öncelikli olarak, biyomoleküllerin ve hücrelerin plastik polimer yüzeylerle nasıl etkileşime girdiğini incelemekle ilgileniyoruz.

Bu bizim ana çerçevemiz. Bu çalışma, tek kullanımlık tanı kitleri için mikroakışkan uygulamalarda vücut bulmaktadır. Dolayısıyla laboratuvarda yaptığımız şey mikroakışkan cihazlardır.

Termoplastik malzemelerde, laboratuvarda mikroakışkanlar üretmek için çoğu kişinin kullandığı kauçuksu bir malzeme olan PDMS'i genellikle kullanmayız. Cihazlarımızı termoplastiklerden üretiriz. Bu termoplastik cihazları, moleküler biyolojinin merkezi bir laboratuvardan uzakta, sahada gerçekleştirilebileceği şekilde mikro ölçekte moleküler biyoloji yapmak için kullanmakla ilgileniyoruz.

Laboratuvarda bu süreç şu şekilde işlemektedir: Küçük plastik kartlar üretiyoruz ve bu küçük plastik kartların içerisinde katı faz ekstraksiyon kolonları veya hücre lizis kolonları ya da karıştırma kolonları yer alıyor. Ayrıca bir deteksiyon tekniği olarak çip üzerinde polimeraz zincir reaksiyonu gerçekleştiriyoruz. Tüm bu bileşenler küçük bir cihaza entegre edilmiştir; araştırmanın uzun vadeli perspektifinde bu çalışma, nihayetinde el tipi olarak taşınabilen ve büyük ölçekli bir laboratuvarın sunduğu tüm santrifüjler, ısıtmalı inkübatörler ve benzeri imkanların bulunmadığı saha ortamlarına veya merkezlere götürülebilecek entegre bir cihaz haline gelecektir.

İdeal olarak, örneğin kan, idrar, dışkı veya mukus içeren bir nazofaringeal sürüntü gibi bir insan örneği ile başlamak ve ardından çipin çıkışında, bir kişinin belirli bir mikroorganizma ile enfekte olup olmadığına dair evet veya hayır şeklinde bir yanıt almak istiyoruz. Bunu, hastanın örneğinde, mikroorganizmaya bağlı olarak, söz konusu mikroorganizmanın DNA'sını veya RNA'sını arayarak gerçekleştiriyoruz.

Dolayısıyla, ortaya çıkan teknik zorluklar büyük ölçüde denklemdeki numune hazırlama tarafında gerçekleşmektedir. Kan, dışkı veya idrarla başladığınızda, içinde çok sayıda potansiyel partikül veya PCR ile diğer amplifikasyon teknikleri için inhibitörler bulunan karmaşık bir insan numunesinden başlamanız gerekir. Ve sürecin sonunda, aradığınız bir mikroorganizmanın orada olup olmadığını size söyleyecek belirli bir DNA veya RNA'yı amplifiye etmek veya aramak için kullanabileceğiniz, çok temiz bir elüe nükleik asit numunesine ulaşmak istersiniz.

Bu nedenle, bu örnekleri temizlemek için birkaç işlem yapmanız gerekir. İlk olarak, örneği filtrelemeniz gerekir; bu işlem, örneğe bağlı olarak, örnek çipe aktarılmadan önce kaba filtrasyon veya hızlı bir santrifüj adımını içerebilir. Bu yüzden, her zaman klinisyenlerden geldiği haliyle örneklere başlamaya çalışırız.

Böylece idrar, dışkı ve nazofaringeal sürüntülerde amacımız, klinisyenin işini her zamanki gibi yapması ve örneği her zamanki şekilde almasıdır. Ardından bu örneği alıp çiplere yerleştiriyoruz. Bu durumda, eğer bu aşamada herhangi bir filtrasyon yapılması gerekiyorsa, bu filtrasyon çip içerisinde gerçekleşecektir.

İkinci adım, moleküler analizler yaptığımız için örnekteki hücrelerin ve mikroorganizmaların liz edilmesi aşamasını içerir. Bu nedenle, genellikle örneğin küçük gözenek boyutuna sahip bir filtreden zorlanarak geçirilmesini kapsayan bir liz adımı gerçekleştiririz. Bazen bu filtre, üzerinde karbon nanotüpler gibi keskin kenarlı nanopartiküller barındırır; bunlar, üzerinde çalıştığımız ve liz edilmesi oldukça zor olan gram-pozitif bir bakteri olan C difficile gibi daha dayanıklı hücre duvarlarına sahip bazı organizmaları parçalamak için kullanılabilir.

Bu nedenle daha dayanıklı lizis kolonlarına sahip olmamız gerekiyor. Ancak genellikle çip içerisinde kombine bir kimyasal ve mekanik lizis gerçekleştiriyoruz. Bundan sonraki hedefimiz, lizatı alıp ardından saflaştırılmış nükleik asitleri ekstrakte etmektir.

Ardından lizatı, mikroakışkan çip içerisinde yer alan bir katı faz ekstraksiyon kolonundan geçiriyoruz. Bu katı faz ekstraksiyon kolonu plastikten yapılmıştır ve mikroakışkan kanal imal edildikten sonra, kanal içerisinde foto-başlatmalı kimya kullanılarak oluşturulmuştur. Ayrıca nükleik asitleri bağlamak ve serbest bırakmak istediğimiz için genellikle silika partikülleri ile emdirilmiştir.

Bazı durumlarda, örneğin spesifik olarak mRNA bağlamak ve serbest bırakmak istiyorsak oligo DT boncukları veya belirli proteinleri bağlayıp serbest bırakmak istiyorsak üzerlerinde özel antikorlar bulunan boncuklar kullandık. Tüm bu işlemleri gerçekleştiren ekstraksiyon kolonları da hazırlayabiliriz. Ancak bugün, silika boncuklar ile sase ekstraksiyon kolonunun nasıl hazırlanacağını göstereceğiz.

Bunu yaptıktan sonra, lizatı silika kolonundan geçirin; bu işlem, makro ölçekli laboratuvarlarda kullanılan bir kyogen kitinin çalışma prensibiyle aynıdır. Ardından, istemediğimiz tüm diğer maddelerden, yani hücre lizatındaki ve insan örneğinin geri kalanındaki tüm karbonhidratlardan, lipitlerden ve diğer kalıntılardan kurtulmak için yıkama işlemi gerçekleştiriyoruz. Ve en sonunda, su ile elüsyon yapıyoruz.

Bu mikro ölçekli katı faz ekstraksiyon kolonlarının güzel yanı, genellikle bir ila beş mikrolitre mertebesinde çok küçük bir miktar su ile elüsyon yapabilmemizdir. Eklediğimiz nükleik asitlerin neredeyse tamamını geri kazanıyoruz. O kanaldan geri aldığımız ilk 10 µL'de yaklaşık %70 ila %90 oranında bir verimlilik elde ediyoruz.

Böylece, 2 ila 10 µL ile iki kez yıkama yaptığımızda, oraya eklediğimiz nükleik asitlerin neredeyse tamamını geri kazanırız. Dolayısıyla bu, sadece PCR'a uygun temiz bir örnek değil, aynı zamanda standart bir masaüstü kit ile elde edebileceğinizden çok daha yüksek konsantrasyonlu bir örnektir. Tüm bu örnek hazırlama tekniklerinin nihai amacı, insanların yaptığı diğer çalışmalarla uyumlu sonuçlar elde etmektir.

Çip üzerinde PCR amplifikasyonu yapılabileceğini gösteren, alanında oldukça başarılı bir çalışma. Eğer bir RNA virüsü ile çalışıyorsanız veya bir gen ekspresyon deneyi yapmak istiyorsanız, ters transkriptaz reaksiyonunu da çip üzerinde gerçekleştirebilirsiniz. Numune hazırlama tekniklerimiz, çip üzerindeki PCR ile doğrudan birleştirilebildiği için, tüm temizleme ve numune hazırlama işlemlerini tezgahta yapmanıza gerek kalmaz.

Ve ayrıca, küçük bir çip üzerinde multipleks PCR gerçekleştirmek için gereken çok küçük hacimleri elde etmek amacıyla yapmanız gereken konsantrasyon adımını da göreceğiz. Dolayısıyla bugün size göstereceğimiz deneyler, PDMS yerine termoplastikten yapılmış mikroakışkan çipin nasıl birleştirildiğini, bu nedenle tipik olarak kullanılanlardan biraz daha farklı bir fabrikasyon sürecinin nasıl uygulandığını ve bu çiplerin nasıl mühürlendiğini göstermektedir.

Ardından, hem hücre lizi hem de katı faz ekstraksiyonu için kullanılan polimer monolitleri oluşturmak amacıyla çip içerisinde ışıkla başlatılan kimyasal işlemleri nasıl gerçekleştirdiğimizi göreceğiz. Laboratuvar ortamında şu an modüler süreçler olan ancak entegre edilebilen ve edilmiş olan bu sürecin sonunda; nükleik asitlerin (RNA ve DNA) su içerisinde yüksek konsantrasyonlu bir örneği elde edilir ve bu örnekle, bir mikroorganizmanın veya enfeksiyonun tanımlanabileceği bir PCR modülüne veya başka bir amplifikasyon modülüne geçilebilir. Aslında şu an üzerinde çalıştığımız bir hibe projemiz var; burada Boston Tıp Merkezi'nden Influenza A ile enfekte olmuş veya olmamış olabilecek hastalardan insan örnekleri toplamaya başlıyoruz. Grip sezonu olduğu için şu an bu örnekleri topluyoruz.

Ardından laboratuvarda, bir kişinin Influenza A ile enfekte olup olmadığını belirlemek için temel olarak birkaç gün süren bir kültür testi olan altın standart analizleri gerçekleştiriyoruz. Bununla eş zamanlı olarak, bu örnekleri şu anki çip modüllerimizden geçiriyoruz. Örnekleri lizis kolonundan ve katı faz ekstraksiyon kolonundan geçiriyor, ardından altın standart yöntemlerle karşılaştırmalı olarak ne kadar başarılı olduğumuzu görmek için PCR uyguluyoruz.

Şu anki aşamamız bu şekilde. Eğer bu deneyler başarıyla sonuçlanırsa, önümüzdeki dört ila altı yıl içinde influenza A için entegre bir çipe ve eksiksiz bir analize sahip olduğumuz bir durumda olabileceğimizi düşünüyorum; ayrıca clostridium difficile ve dışkı örnekleri üzerinde de çalışıyoruz. Sadece cihazın değil, aynı zamanda analizinin de entegre hale getirilmesine çok yakınız.

Dolayısıyla, hem analiz geliştirme hem de çip tasarımı el ele yürütülmelidir. Belirli bir uygulama için, yani hasta başına uygulamaya ulaşmak için, bu gerçekten hedefe yönelik bir süreçtir. Çipi hasta başında kullanıma uygun şekilde optimize etmek için başlangıç örneğini ve aradığınız mikroorganizmayı bilmeniz gerekir.

Bu nedenle, bunu bir prototip düzeyinde gerçekleştirme aşamasına çok uzak olmadığımızı düşünüyorum. Nihai hedeflerimiz bunlar, bu yüzden oraya ulaşmayı umuyorum.