Parçacıkların Mekansal Takip için Çoklanmış Elektronik Algılama ile mikroakışkan Platformu

Bu prosedürün genel amacı, birden fazla mikroakışkan kanaldaki partiküllerin tespitini ve boyutlandırılmasını çoklamak için dirençli darbe algılamayı kod bölmeli çoklu erişim ile birleştiren bir mikroakışkan platformu göstermektir. Mikroakışkan CODES olarak adlandırılan bu teknoloji, kaynakların sınırlı olduğu ortamlarda biyolojik örneklerin hasta başı testleri için oldukça uygun olan, tam entegre ve gerçekten taşınabilir laboratuvar çipli cihazların gerçekleştirilmesine yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, mikroakışkan çip üzerindeki partiküllerin mekânsal ve zamansal manipülasyonunu elektronik olarak takip edebilmesi ve böylece mikroskop gibi harici bir cihaz ihtiyacını ortadan kaldırmasıdır.

Teknolojimiz yumuşak litografi ile uyumludur ve parçacıkların, Coulter sayaca benzer şekilde doğrudan elektronik bir okuma sağlamak amacıyla fraksiyone edildiği mikro fotik bir cihaza kolayca entegre edilebilir. Mikroakışkan cihazın yapımına başlamak için dört adet, yedi bitlik altın kod seti oluşturun. Ardından, AutoCAD gibi bir bilgisayar destekli tasarım (CAD) yazılımı kullanarak altın kodlara dayalı dört benzersiz elektrot düzeni tasarlayın.

Son olarak, tasarlanmış elektrot düzenine sahip fotomaskeyi bir fotomaske tedarikçisine imal ettirin. Ardından, dört inçlik bir borosilikat cam gofretini 120 °C'de 20 dakika boyunca beşe bir oranında piranha çözeltisinde bekletin. Temizleme işleminden sonra, kalıntı suların buharlaşması için gofretini bir sıcak tablada 200 °C'de 20 dakika boyunca ısıtın.

Temiz ve kuru gofret spin kaplayıcıya yerleştirin. Gofrete 2 mililitre negatif fotoğraf direnci çözeltisi uygulayın ve 40 saniye boyunca dakikada 3000 devir hızda döndürerek kaplayın. Spin kaplama yapılmış gofreti bir sıcak plaka üzerinde 150 derece Celsius'ta bir dakika boyunca kurutun.

Wafer, istenen elektrot deseninde bir krom maske ile kaplanır. Maskelenmiş fotoresist yüzeyi, 225 mJ/cm² değerine ulaşana kadar 365 nm UV ışığına maruz bırakılır. Pozlanmış fotoresist, bir sıcak plakada 100 °C'de bir dakika boyunca pişirilir.

Wafer'ı 15 saniye boyunca fotoresist geliştiriciye daldırın, ardından desenli wafer'ı nazik bir deiyonize su spreyi ile yıkayın ve wafer'ı bir nitrojen gazı akımı altında kurutun. Sonrasında, desenli wafer'ı bir elektron demeti metal buharlaştırıcısına yerleştirin. Saniyede bir Angstrom hızında, wafer üzerine 20 nanometre kalınlığında bir krom tabakası ve 80 nanometre kalınlığında bir altın tabakası çöktürün.

Ardından, metal kaplı gofretin aseton içerisinde 30 dakika boyunca, 40 kilohertz ve %100 genlikte ultrasonik ısıtma işlemi uygulanarak alttaki fotoresist aşındırılır. Gofreti gerektiği şekilde daha küçük parçalara bölmek için bir dicing saw kullanın. Mikroakışkan kanal kalıbının imalatına başlamak için, dört inçlik bir silikon gofreti daha önce açıklanan borosilikat gofret ile aynı şekilde temizleyin ve kurulayın.

Silikon gofret spin coater cihazına yerleştirin ve dört mililitre negatif fotoresist çözeltisi uygulayın. Gofreti önce 15 saniye boyunca 500 rpm'de, ardından 15 saniye boyunca 1.000 rpm'de ve son olarak 60 saniye boyunca 3.000 rpm'de döndürerek kaplayın. Gofretin arkasındaki ve kenarlarındaki kalıntı fotoresistleri temizlemek için gofreti, asetonla ıslatılmış temiz oda mendili üzerine yüzü yukarı bakacak şekilde yerleştirin.

Gofreti 65 °C'de bir dakika ve ardından 95 °C'de iki dakika boyunca pişirin. Mikroakışkan kanallar için kullanılan krom maske desenini kuru gofret üzerine yerleştirin. Fotorezisti, santimetrekare başına 180 milijoule değerinde 365 nanometre UV ışığına maruz bırakın ve ardından gofreti sırasıyla 65 ve 95 °C'de bir ve iki dakika boyunca tekrar pişirin.

Desenli wafer, bir fotoğraf direnci geliştirici kabına yerleştirilir ve kap üç dakika boyunca hafifçe sallanır. Geliştirilmiş wafer izopropanol ile durulanır ve azot gazı akışı altında kurutulur. Wafer 200 °C'de 30 dakika boyunca pişirilir, ardından desenli fotoğraf direncinin wafer boyunca tekdüze bir kalınlığa sahip olduğunu doğrulamak için bir profilometre kullanılır.

Waferi, kapağı açık bir Petri kabındaki 200 µL triklorosilan ile birlikte bir vakum desikatörüne yerleştirin. Wafer yüzeyini silanize etmek için waferın triklorosilan ile birlikte desikatörde sekiz saat beklemesini sağlayın. Cihazı monte etmeye başlamak için, silikon wafer kalıbını 150 mm çapındaki bir Petri kabına sabitlemek amacıyla genel amaçlı temiz oda bandı kullanın.

Petri kabına 10'a bir oranında hazırlanmış 50 gram polidimetilsiloksan prepolimer karışımı ekleyin ve karışımı bir vakumlu desikatörde bir saat boyunca gazdan arındırın. Gazdan arındırılmış karışımı 65 °C'de en az dört saat boyunca kürleyin. Kürlenmiş PDMS tabakasını kesip çıkarmak için bir skalpel kullanın ve ardından kürlenmiş tabakayı bir cımbız yardımıyla kalıptan soyun.

PDMS'yi küçük parçalar halinde kesin. Giriş ve çıkış mikroakışkan kanal deliklerini bir biyopsi puncher'ı ile açın. Mikroişleme tabi tutulmuş yüzeyi temizlemek için PDMS tabakasını, desen yüzeyi aşağı gelecek şekilde şeffaf oda bandı üzerine yerleştirin.

Daha önce hazırlanmış olan elektrot taşıyıcılı cam substratı aseton, izopropanol ve deiyonize su ile durulayın. Substratı bir nitrojen gazı akımı altında kurutun. PDMS katmanını ve substratı, mikroişleme yüzeyleri yukarı bakacak şekilde, 100 milivat değerine ayarlanmış bir RF plazma jeneratörüne yerleştirin.

Mikromakine yüzeylerini 30 saniye boyunca oksijen plazmasında aktive edin. Ardından, desenli PDMS tabakasını yüzey elektrotlarıyla hizalamak için bir optik mikroskop kullanın. Hizalama tamamlandığında, PDMS tabakasını cam altlığa mühürlemek için yüzeylerin fiziksel temasa geçmesini sağlayın.

Cam altlık üzerindeki kaplama elektrot deseninin PDMS mikroakışkan kanallarla düzgün bir şekilde hizalanması kritik önem taşır. Doğru şekilde hizalandığında, partiküllerin yüzey elektroduyla etkileşimi, çoklama için istenen kod dalga formunu oluşturacaktır. Montajı tamamlanmış cihazı, cam tarafı aşağı bakacak şekilde 70 °C'de beş dakika boyunca fırınlayın.

Cihaz montajını tamamlamak için telleri elektrot temas pedlerine lehimleyin. Deneye başlamak için mikroakışkan cihazı bir optik mikroskop tablasına yerleştirin. Cihazın referans elektrodunu bir lock-in amplifikatörün sinyal çıkış portuna bağlayın ve 400 kilohertz sinüs dalgası uygulayın.

Pozitif ve negatif sensör elektrotlarını iki bağımsız transempedans amplifikatörüne bağlayın. Her iki transempedans amplifikatörünü, pozitif sensör sinyalinin negatif sensör sinyalinden çıkarılacağı şekilde, lock-in amplifikatörün diferansiyel voltaj girişlerine bağlayın. Lock-in amplifikatörünün demodülatör çıkışını bir veri toplama ünitesine bağlayın.

Veri toplama yazılımında, lock-in amplifikatör çıkışı için örnekleme hızını 1 Megahertz olarak ayarlayın. Cihazın mikroskop altında görülen çalışmasını optik olarak kaydetmek için yüksek hızlı bir kamera kurun. Hazırlanmış hücre süspansiyonunu bir şırıngaya çekin.

Numune şırıngasını bir şırınga pompasına sabitleyin ve şırıngayı giriş kanalına bağlayın. Çıkış kanalını bir atık kabına yönlendirin. Empedans modülasyon sinyalini kaydederken, hücre süspansiyonunu sabit bir akış hızında cihazdan geçirmek için şırınga pompasını kullanın.

Deney tamamlandıktan sonra, elektriksel verileri analiz yazılımı ile işleyin. Hücre boyutu için bir kalibrasyon eğrisi oluşturmak amacıyla, işlenmiş elektriksel sinyali yüksek hızlı kameradan alınan görüntülerle karşılaştırın. Hücre süspansiyonu, ortogonal sensör kodlarından türetilmiş dört benzersiz elektrot desenine sahip bir mikroakışkan sensör cihazından geçirilmiştir.

Dört sensör sinyalinin tamamı tek bir elektriksel çıkıştan kaydedilmiştir. Kaydedilen her bir sinyalle ilişkili olan münferit sensör, kaydedilen sensör sinyallerinin, belirgin şekilde ayırt edilebilen otokorelasyon tepeleri oluşturan tüm olası kodlarla korelasyonu yapılarak tanımlanmıştır. Dört kanalın tamamında hücrelerin eş zamanlı tespitiyle oluşan girişim sinyallerinin ürettiği dalga formları, iteratif bir algoritma ile çözümlenmiştir.

Kaydedilen bir dalga formu tüm olası kodlarla ilişkilendirilmiş ve en büyük otokorelasyon piki belirlenmiştir. Buna karşılık gelen bireysel sensör sinyali yeniden yapılandırılmış ve giriş dalga formundan çıkarılmıştır. Artık sinyal, bir sonraki yinelemeye giriş olarak aktarılmış ve işlem, artık sinyal hiçbir otokorelasyon piki üretmeyene kadar devam etmiştir.

Tahmin edilen sinyaller, en küçük kareler yaklaşımını kullanarak yeniden yapılandırılan ve orijinal kaydedilen dalga formları arasındaki en iyi uyumu arayan bir optimizasyon algoritmasına dayanarak rafine edilmiştir. Hücre konumu, boyutu ve sensörü geçme süresi; ardından tahmin edilen sensör sinyallerinin kanal numarasından, genliğinden, süresinden ve bağıl zamanlamasından belirlenmiştir. Prosedür, elektriksel sinyallerin yüksek hızlı kameradan elde edilen optik ölçümlerle karşılaştırılmasıyla doğrulanmıştır.

Bu teknik bir kez kavrandığında uygulanması oldukça kolaydır, çünkü donanım açısından çok basittir. Çip üzerinde herhangi bir aktif bileşen bulunmaz. Yumuşak litografi ile doğrudan uyumludur ve sinyal işleme basit bir hesaplama algoritmasına dayanır.

Bu protokolü takip ederek, kod tabanlı çoklu elektriksel sensörlere sahip mikroakışkan çipler üretebilir ve biyoanalitik ölçümler için elektriksel sinyalleri çözebilirsiniz. Çok yönlü ve ölçeklenebilir olan bu elektronik algılama teknolojisi, parçacıkların çip üzerinde işlenirken mekansal ve zamansal olarak takip edilmesi yoluyla kantitatif analizler gerçekleştirmek için çeşitli mikroakışkan cihazlara kolayca entegre edilebilir. Bu videoyu izledikten sonra, bir mikroakışkan CODES teknolojisinin nasıl tasarlanacağı, üretileceği ve uygulanacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.