Typha latifolia'nın (Kedi Kuyruğu) Yetiştirilmesi ve Mikrobiyal Biyoaugmentasyonu için Optimize Edilmiş Yöntem

Çalışmalarımız, tohumdan kedi kuyruğu yetiştirme protokollerinin eksikliğini ele almaktadır. Gelecekteki bitki mikrob araştırmalarını desteklemek için tohum çimlenmesi, erken büyüme ve mikrobiyal biyolojik artırma için tekrarlanabilir yöntemler geliştirdik. Tohumdan kedi kuyruğu yetiştiren veya olgunlaşmaya kadar takip eden çok az çalışma vardır, ancak kısır kuyruğu sulak alan iyileştirme araştırmalarında yaygın olarak kullanılır.

Çoğu kıvrım kuyruğu araştırması, laboratuvar çalışmalarında kızılkuyruğun çoğaltılması için rizom satın almayı içerir. Çok az çalışma tohumdan kedi kuyruğu yetiştirmekte ve standart yöntemler bırakılmamaktadır. Getirilen mikropların tutarlı çimlenmesi ve kalıcı kolonizasyonu sağlamak büyük bir zorluk olmuştur.

Tohum çimlenmesi ve mikrobiyal biyo-artırma için tekrarlanabilir yöntemler geliştirdik; erken aşılamanın uzun vadeli kolonizasyonu desteklemeye nasıl yardımcı olduğunu gösterdik. Başlamak için, bahçe makası kullanarak Typha latifolia bitkisinin sapını çiçek tabanından yaklaşık iki santimetre uzaklıkta kesin. Tohumları çiçekten ayırın, tohumu laboratuvar blenderına aktarın, blender yaklaşık 1/4 dolduğunda yaklaşık 250 mililitre sıkıştırılmamış tohum anlamına gelir.

Şimdi blenderi 500 mililitre musluk suyu ile doldurun, böylece 10 santimetre boşluk korunur. Karışımı orta düşük hızda 20 saniye karıştırın ve viskoz içeriği hemen bir litrelik bir beğene aktarın. Yaklaşık 100 mililitre tohum suyu karışımını tekrar blendera aktarın.

Sonra 400 ila 600 mililitre taze musluk suyu ekleyip orta yüksek hızda 20 saniye karıştırın. İçindekileri taze bir litrelik bir beakere dök. Şimdi beaker'i 800 mililitreye kadar musluk suyla doldurun.

60 saniye beklettikten sonra, yüzeydeki yüzen çamuru alt yüzeye yerleşmiş tohumları rahatsız etmeden alıp kalan suyu yavaşça dökün ve tohumları 100 mililitrelik bir beaker'e aktarın. Kalan tohum suyu çamuru için karıştırma işlemini tekrarlayın. Sonra, ayrılmış tohumları içeren beakeri bir karıştırma tabağına yerleştirin.

Karıştırdıktan sonra, yüzen bitki malzemesini beakerin yüzeyinden alıp alın. Tohumları bir Buchner hunisine, filtre kağıdını vakuma bağlı ve gece boyunca kurumasına bırakın. Kurutulmuş tohumları 20 derece Celsius'ta 50 mililitrelik konik polipropilen tüplerde sakla.

Yarı güçlü Murashige ve Skoog media plakalarını %1 fito agar ile hazırlayın. Kurutulmuş tohumlardan yaklaşık bir miligramı 15 mililitrelik konik polipropilen tüplere aktarın. Sonra tüpe 10 mililitre steril, çift damıtılmış su ekleyin.

Tüpü orta yüksek hızda yörünge sallayıcısına 10 dakika boyunca yerleştirin. Şimdi tüpten suyu çıkarın ve steril çift damıtılmış suda hazırlanmış beş mililitre %0,1 polisorbat 20 çözeltisi ekleyin. Tüpü orta yüksek hızda 10 dakika boyunca sallayın.

Polisorbat 20 çözeltisini çıkarın. Tüm sonraki adımları alev veya laminar akış başlığının önünde yapın. Çözeltiyi beş mililitre %30 ticari çamaşır suyu ve %0,025 polisorbat 20 çözeltisi ile steril çift damıtılmış suda hazırlanmış olarak değiştirin.

Üst yüzeyi steril çift damıtılmış su ile değiştirin. Sonra tüpü orta yüksek hızda beş dakika boyunca sallayın. Üçüncü durulamadan sonra, tüpü düşük hızda 24 saat boyunca döndürerek çimlenmeyi teşvik edin.

Ertesi gün, fazla suyu çıkarın ve tüpte üç mililitre sıvı kaldığından emin olun. Şimdi aseptik olarak, 1000 mikrolitrelik plastik pipet ucunun ucunu kesin. Kesilmiş pipet ucunu kullanarak tohumları güçlü bir şekilde pipet yapın ve ucu içinde askıya alın.

Tohumları ve sıvıyı yarı güçte Murashige ve Skoog agar tabaklarına yerleştirin. Tabağı nazikçe çevirerek tohumların eşit şekilde dağıtılmasını sağlar. Plakaları laboratuvar sızdırmazlık filmiyle sarın, ardından 23 derece Celsius ve %70 nemde 16 saat ışık ve 8 saatlik karanlık döngüyle bir büyüme odasına yerleştirin.

Cattail tohumlarını aşılamak için, tohumları gösterildiği gibi polissorbat 20 çamaşır suyu ve çift damıtılmış su ile sterilize edin. Luteimonas izolatının gece boyunca kültüründeki optik yoğunluğunu 600 nanometrede ölçün. Kültürü 1.0 emilim değerine normalleştirin, kültür ortamında seyreltirin.

Şimdi kültürün bir mililitresini 9, 300 G ile iki dakika boyunca santrifüj yapın. Süpernatantı çıkarın ve pelleti bir mililitre PBS ile yeniden süsleyin. Santrifüj edilip süpernatantı tekrar çıkardıktan sonra, bakteriyel pelleti bir mililitre steril çift damıtılmış suya yeniden süzülür.

Sterilize edilmiş tohumlar kullanın, ardından aşıyı aynı tüpte %0,025 organosilikon yüzeyaktif madde ile 1-10 seyreltme ile seyreltin. Tohum çimlenmeden önce süspansiyonu düşük hızda 24 saat boyunca sallayın. Steril bitki büyüme odasını, musluk suyla önceden ıslatılmış seçilmiş bir toprakla doldurarak başlayın.

Luer kilit ucunu alüminyum folyo ile kaplayın ve üniteyi sıvı döngüde 20 dakika boyunca otoklavlayın. Sonrasında, steril koşullarda, büyüme odasındaki Luer kilit konnektörüne 0,2 mikrometrelik bir filtre ünitesi bağlanır. Hazneyi açın ve toprağa 1%20x20 x 20 x 20 boyutlarında sterilize edilmiş 500 mikrolitre filtre gübre ekleyin.

Toprağı steril bir spatula ile karıştırın ve aynı anda steril çift damıtılmış su ekleyin; böylece toprak aşırı doygunlaşmadan hidratlanmayı koruyun. Şimdi, steril bir jilet bıçağıyla Murashige ve Skoog agar'ı zayıf bir eski fidan içeren plakalardan dörde parçalara ayırın. Steril bir spatulayla, bir agar kesitini fidanla birlikte hazırlanmış toprak üzerine büyüme odasına aktarın.

Büyüme odası ünitesini, 23 derece Celsius ve %70 nemde 16 saatlik ışık ve 8 saatlik karanlık döngüye ayarlanmış bir bitki büyüme kuluçka makinesine aktarın. Typha tohumlarının tam skarifikasyonu, tohum bileşenlerinin gözle görülür şekilde ayrılmasına yol açarken, eksik skarifikasyon gagayı tutturdu ve skarifiye olunmamış tohumlar sağlam kaldı. Steril hidroponik sistemin, burada Juncus olarak imimlendirilen cattail ve Juncus türlerinin büyümesini desteklediği gösterilmiştir; bu türler steril sistemde bir yıla kadar korunmuştur.

En yüksek tohum çimlenme oranı olan %20,8, %30 çamaşır suyu ve polissorbat 20 yöntemiyle gözlemlenmiştir; bu, tam tohum sterilizasyonu sağlayamayan 1 saatlik klor gazı yöntemi hariç diğer tüm sterilizasyon tedavilerinden önemli ölçüde daha yüksekti. Skarifasyondan yedi gün sonra, çimlenen Typha fideleri steril olmayan Petri plaka ortamında görünür radikaller ve sürgün dokusu geliştirmiştir. Toprağa nakilin ardından, Typha'nın fidelerinin bir alt kümesi başarılı şekilde yerleşti ve bir ila iki hafta içinde yeni sürgün dokusu üretti.

DsRed plazmidi taşıyan Luteimonas türleriyle aşılamanın ardından, aşılamadan 16 gün sonra Typha fidanı köklerinde kırmızı floresan bakteriyel kolonizasyon gözlemlenmiştir.