Penium margaritaceum için Deneysel Tarama Protokolleri, İmmünositokimya ve Mikroskopi Tabanlı Görüntüleme Teknikleri

Araştırmamız, hücre duvarının hücre şeklini korumadaki ve dış strese yanıt vermedeki rolüne odaklanmaktadır. Canlı hücrelerde hücre duvarı yapısını görüntülemek için bir dizi ışık mikroskobu ve konfokal lazer tarama mikroskobu teknikleri ve hücre duvarlarının yüksek çözünürlüklü görüntülenmesi için elektron mikroskobu kullanıyoruz.

Hücre duvarı dinamiklerini vurgulamak için spesifik hücre altı proteinleri eksprese eden streptofit algleri için dönüştürülmüş hücre hatlarının mevcut eksikliği eksiktir. Bu daha sonra çalışma için antikorların ve diğer floresan probların kullanılmasını gerektirir. Penium'un hücre duvarı, çeşitli abiyotik ve biyotik stres biçimlerine yanıt verir ve bu fenotipik plastisiteye yol açar. Hücre duvarı pektinlerinin bu sürecin önemli bir parçası olduğunu bulduk. Tek hücreli fenotip ve Penium ile canlı hücre etiketleme yapma yeteneği, bitki biyologlarına hücre duvarının yapısını ve gelişimini inceleme fırsatı sunar.

[Öğretim Görevlisi] Başlamak için, Penium margaritaceum'un aktif olarak büyüyen sıvı hücre kültürlerinin beş mililitresini çıkarın. 15 mililitrelik bir plastik santrifüj tüpüne aktarın, ardından santrifüjleyin. Süpernatanı döktükten sonra, peleti beş mililitre taze WHM'de tekrar süspanse edin. Tüp kapağını sıkıca ve kuvvetlice sabitleyin, peleti yeniden süspanse etmek ve hücre duvarı yüzeyinden herhangi bir hücre dışı polimerik maddeyi çıkarmak için tüpü 10 saniye boyunca sallayın. Son yıkamadan sonra, peleti bir mililitre taze WHM içinde yeniden süspanse edin, ardından hücre süspansiyonunun 200 mikrolitrelik alikotunu 1.5 mililitre mikrosantrifüj tüplerine aktarın. Kapak tüplerini mikrosantrifüjde 1000 G'de bir dakika santrifüjleyin, ardından süpernatanı aspire edin ve peleti 400 mikrolitre taze WHM'de yeniden süspanse edin. Daha sonra, hücre süspansiyonuna 20 mikrolitre seyreltilmiş monoklonal antikor ekleyin ve iyice girdaplayın. Ardından, tüpü alüminyum folyoya sarın ve 90 dakika boyunca bir laboratuvar döndürücü üzerinde inkübe edin. Süspansiyonu santrifüjleyin, süpernatanı aspire edin ve 10 saniye girdaplamadan önce peleti 500 mikrolitre taze WHM içinde yeniden süspanse edin. Son santrifüjlemeden sonra, peleti 400 mikrolitre WHM içinde yeniden süspanse edin ve sekiz mikrolitre keçi sıçan önleyici TRITC veya FITC ekleyin. Son olarak, peleti 100 mikrolitre büyüme ortamında yeniden süspanse edin. Tüpü kapatın ve görüntülemeye hazır olana kadar alüminyum folyoya sarın. JIM5 antikoru ile etiketlenmiş hücreleri WHM'de on kat seyreltin. Bir kapak fişi üzerine 50 mikrolitrelik seyreltilmiş hücre süspansiyonu damlası ekleyin. Hücre yapışmasını sağlamak için hücreleri karanlıkta iki dakika inkübe edin, ardından yapışmamış hücreleri durulamak için bir mililitre WHM'yi damla damla dikkatlice pipetleyin. Bağlı hücrelerin üzerine 30 mikrolitre WHM ekleyin. Damlacığı WHM'de 30 mikrolitre ılık% 4 agaroz ile kaplayın ve katılaşmasına izin verin. Bir Petri kabındaki numuneler için, agaroza gömülü hücreleri tamamen kaplayacak kadar WHM ekleyin. Bir kapak fişindeki hücreler için, kapak fişini ters çevirin ve yavaşça WHM ile doldurulmuş bir çöküntü slaytının üzerine yerleştirin. Hazırlanan hücreleri bir floresan mikroskobu üzerine monte edin. Hücre büyümesini ve hareketini desteklemek için harici bir lamba kurun veya mikroskobun yerleşik aydınlatmasını kullanın. Hücre duvarı genişlemesini izlemek için TRITC filtre setini kullanarak her 10 ila 30 dakikada bir görüntü yakalayın. Beş mililitre yıkanmış 10 ila 14 günlük hücre kültürleri içeren bir tüp hazırlayın. Daha sonra, 1,5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne yaklaşık 100 mikrolitre 0,75 mikrometre floresan boncuk ekleyin. Tüpe bir mililitre WHM pipetleyin ve boncukları yeniden süspanse etmek için kuvvetlice çalkalayın. Tüpü 10.000 G'de üç dakika santrifüjleyin. Son peleti 500 mikrolitre WHM'de yeniden süspanse edin. Daha sonra, 12 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna bir mililitre WHM ortamı pipetleyin. İstenilen konsantrasyonu elde etmek için inhibitörler veya büyüme düzenleyiciler ekleyin ve plakayı hafifçe döndürün. 10 mikrolitre boncuk çözeltisi ekleyin ve karıştırmak için tekrar hafifçe döndürün, ardından karıştırmadan önce her bir oyuğa 10 mikrolitre yıkanmış hücre ekleyin. Plakayı ışıkta 24 saat inkübe edin. Plakayı bozmadan, bir FITC filtresi ile donatılmış ters çevrilmiş bir floresan mikroskobu üzerine yerleştirin. Bir mililitre hücre süspansiyonunu 1.5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne pipetleyin. Tüpü bir dakika boyunca 4.000 G'de santrifüjleyin. Süpernatanı attıktan sonra, peleti içeren tüpü sıvı nitrojene daldırın veya eksi 80 santigrat derecede dondurun. Çözülmüş peleti 20 mikrolitre WHM'de yeniden süspanse edin. Yoğun hücre süspansiyonundan bir damla 45 x 50 milimetre ölçülerinde bir kapak kızağı üzerine yerleştirin. Bir sandviç oluşturmak için damlanın üzerine ikinci bir kapak fişi yerleştirin. Hücreleri yırtmak için sandviçin üzerine 30 saniye boyunca sürekli olarak bastırın. Kapak fişlerini dikkatlice ayırın. Yırtılmış hücreleri 15 mililitrelik bir santrifüj tüpüne ve santrifüje yıkamak için kapak kızaklarının üzerine WHM ekleyin. Süpernatanı attıktan sonra beyaz veya hafif yeşil peleti inceleyin. Hücre duvarlarını içeren peleti deiyonize suda yeniden süspanse edin. Hücre yırtılması ve santrifüjlenmeden sonra, peleti 1.5 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarmadan önce 100 mikrolitre deiyonize su içinde yeniden süspanse edin. Ardından, bir Cambridge saplamasının yüzeyine karbon bant yapıştırın. Yeniden askıya alınmış hücre duvarı süspansiyonunun beş mikrolitrelik damlasını karbon bant üzerine pipetleyin. Gece boyunca kurumaya bıraktıktan sonra saplamayı 50 saniye boyunca püskürtmek için paladyum hedefini kullanın. Hücreleri, ikincil elektron dedektöründen 10 santimetre uzağa yerleştirilmiş uygun bir nokta boyutu ile beş kilovoltta gözlemleyin. P. margaritaceum'un hücre duvarının anti-pektin monoklonal antikorlarla etiketlenmesi, düzensiz kafes deseni oluşturan kalsiyum kompleksli liflerden oluşan bir ağı ortaya çıkardı. Pektin, hücre merkezinde veya kıstakta birikti ve eski pektini kutuplara doğru itti. JIM7 etiketlemesi, yüksek metil-esterlenmiş pektinin başlangıçta kıstakta dar bir bantta salgılandığını gösterdi. Arabinogalaktan proteini gibi hücre duvarındaki diğer polimerler, monoklonal antikor JIM13 ile tespit edildi. Hücre duvarının dışına büyük miktarlarda hücre dışı polimerik maddeler salgılandı, bu da kayma ve hücre agregasyonunu sağladı. Etiketleme teknikleri, gelişimsel görüntüleme yaklaşımlarını entegre ederek kantitatif hücre duvarı ve genişleme çalışmalarına izin verdi. İlişkili yapısal çalışmalar, tipik pektin kafesinin, farklı çıkıntılarda dışarıdan sonlanan bir lif ağından oluştuğunu ortaya koydu. Yüksek konsantrasyonlarda kalsiyum ile tedavi, JIM5 etiketli hücrelerde gözlemlendiği gibi pektin kafesini düzensiz tortulara dönüştürdü. Kalsiyum ile muamele edilmiş hücre duvarları taramalı elektron mikroskobu altında incelendiğinde, düzensiz pektin yapısı ayrıntılı olarak gözlendi.