İmmünohistokimya ve elektron mikroskobu Ön gömme için İnsan Olmayan Primat Beyin Dokusu Hazırlanması

Bu deneyin genel amacı, elektron mikroskobisi için primat dışı beyin dokusunun güvenilir gömme öncesi immün boyamasını gerçekleştirmektir. Bu yöntem, belirli bir beyin yapısındaki belirli bir innervasyonun sinaptik insidansı gibi nöroanatomi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, elektron mikroskobisine uygun spesifik innervasyonları etiketlemek için kolay ve düşük maliyetli bir yöntem olmasıdır.

İlgili bölgeyi içeren, akrolein ile tespit edilmiş insan dışı primat beyninin 50 mikron kalınlığındaki kesitlerini PBS içeren 12 kuyucuklu bir plakaya aktararak başlayın. Serbest yüzen kesitleri oda sıcaklığında beş dakika boyunca üç kez PBS ile yıkayın, ardından kesitleri oda sıcaklığında 30 dakika boyunca taze hazırlanmış sodyum borohidrür çözeltisinde inkübe edin. Kapaksız bir şekilde hafifçe sallayın.

30 dakika geçtikten sonra, sodyum borohidrürle aspire edin ve her kuyucuğa PBS ekleyin. Plakayı bir sallayıcıya yerleştirin ve 10 dakika boyunca kuvvetlice sallayın. Yıkama işlemini iki kez daha veya reaksiyon gazı kalmayana kadar tekrarlayın.

Kesişimleri, PBS içinde seyreltilmiş %2 normal serum ve %0,5 soğuk balık jelatininden oluşan bir çözeltide, oda sıcaklığında bir saat boyunca hafifçe sallayarak inkübe ederek bloke edin. İnkübasyon süresi dolduğunda, kesişimleri primer antikor çözeltisinde oda sıcaklığında, gece boyunca hafifçe sallayarak inkübe edin. Ertesi gün, kesişimleri daha önce yapıldığı gibi yıkadıktan sonra, ikincil antikor çözeltisinde oda sıcaklığında bir buçuk saat boyunca hafifçe sallayarak inkübe edin.

Kesitler daha önce yapıldığı gibi yıkandıktan sonra, avidin-biotin-peroksidaz veya ABC çözeltisi içinde bir saat boyunca sallanarak inkübe edin. Ardından, TBS içinde seyreltilmiş 0,005% hidrojen peroksit içeren taze 0,05% 3, 3'Diaminobenzidin çözeltisi hazırlayın. Yıkama işleminden sonra, kesitleri DAB çözeltisi içinde üç ila yedi dakika boyunca hafifçe sallayarak inkübe edin.

Kahverengi çökelek istenen renge ulaştığında, önce soğuk TBS ile iki kez hızlıca yıkayarak, ardından zamanlanmış bir dizi TBS ve PB yıkamasıyla reaksiyonu durdurun. DAB ile boyanmış kesitleri içeren plakayı havalandırma davlumbazına aktarın. Kesitleri PB ile doldurulmuş altı kuyucuklu bir plakaya aktarın ve PB'yi plakadan dikkatlice pipetleyerek çekerek kesitleri tamamen düzleştirin, ardından düzleştirilmiş kesitleri bozmamak için osmiyum tetroksit çözeltisini damla damla ekleyin.

Kesitleri ışıktan korumak için plakayı alüminyum folyo ile örtün ve oda sıcaklığında, çalkalamadan 30 dakika boyunca inkübe edin. Ozmifikasyon sırasında, epoksi reçine karışımının her bir bileşeninden uygun miktarları büyük bir plastik bardağa ekleyerek su itici epoksi reçine hazırlayın. Homojen bir kahverengi renk elde edilene kadar tahta bir çubuk veya plastik pipet ile karıştırın, ardından eşit miktardaki reçineyi işlenecek kesit sayısına uygun boyuttaki alüminyum kaplara aktarın ve dinlenmeye bırakın.

Osifikasyon süresi dolduğunda, kesitleri düşük hızda sallama eşliğinde 10 dakika boyunca PB ile üç kez yıkayın. Yıkamadan sonra, kesitleri aşağıdaki dereceli etanol serisinde her birinde iki dakika boyuncay dehidre edin. Ardından, kesitleri propilen oksit dolu cam şişelere aktarın ve dehidrasyon işlemini tamamlamak için propilen oksitte ikişer dakikalık üç inkübasyon gerçekleştirin.

Ardından kesitleri, hava ile teması mümkün olduğunca önleyerek, dikkatlice tek tek alüminyum kaplara aktarın. Kesitleri daha önce karıştırılmış su itici epoksi reçine ile düz bir şekilde gömün ve bunları havalandırma davlumbazı altında, oda sıcaklığında gece boyunca inkübe edin. Ertesi gün, lam ve plastik lamel olduğunu mineral yağ ile kaplayın, ardından alüminyum kapları 60 °C'de en fazla 12 ila 15 dakika inkübe ederek reçineyi yumuşatın.

Kesitleri cam lamelin yağlı tarafına dikkatlice yayın. Yağlı lameli yerleştirin ve kalan havayı dikkatlice dışarı itin. Lamelleri 60 °C'de 48 saat boyunca inkübe edin.

48 saat sonra, kesit reçine içinde kalacak şekilde plastik kapatma lamelini çıkarın. Önce binoküler kullanarak ilgi bölgesini belirleyin ve ardından bir skalpel yardımıyla yaklaşık bir milimetrekare boyutunda küçük, dörtgen bir doku parçası kesin. Daha sonra, bir reçine bloğunun ucunu törpüleyin ve dörtgen doku parçasını buraya yapıştırın.

Kurutma işleminden sonra, reçine bloğu ultramikrotom tablasına dikey konumda yerleştirin ve reçine bloğunun her yanını, düz kenarlı bir yamuk oluşturacak şekilde kademeli olarak kesmek için keskin bir jilet kullanın. Ardından, tablayı yatay konuma getirin ve yamuğun en uzun kenarı aşağı bakana kadar bloğu döndürün. Ayrılmış alana bir elmas düzeltme aracı veya cam bıçak yerleştirin.

Ultramikrotomu, saniyede bir milimetre hızla 300 mikron kalınlığında kesitler alacak şekilde ayarlayın. Bıçağı, dörtgen parçaya dikey olarak paralel olacak ve yaklaşık bir derecelik çok küçük bir yatay açı oluşturacak şekilde ayarlayın ve doku görünmeye başlayana kadar dörtgen parçanın yüzeyini tıraşlayın. Şimdi, 80 mikron kalınlığında kesitler almak için distile su dolu bir tekne ile donatılmış 45 derecelik ultra elmas bıçağa geçiş yapın.

Suyun yüzeyine dokunmadan, ksilenle ıslatılmış bir emici kağıt parçasıyla üzerinden geçerek kesitleri düzeltin ve seri kesitleri çıplak 150 mesh bakır ızgaralar üzerinde toplayın. Izgaraları bir ızgara saklama kutusuna yerleştirin, ardından kurşun sitrat stok çözeltisi ve distile su ile bire bir oranında bir çözelti hazırlayıp 0,2 mikronluk bir şırınga filtresinden süzün. Işıktan korumak için flakonu alüminyum folyo ile kaplayın.

Her bir ızgarayı, solüsyonla temas eden kesit kısmı aşağı bakacak şekilde, seyreltilmiş kurşun sitrat solüsyonu damlasının üzerine yerleştirin. Ardından, ızgarayı tutmak için küçük bir pens kullanın ve ızgarayı distile su içeren iki ayrı bekerde iyice durulayın. Fazla suyu emici kağıtla nazikçe alın ve ızgaraları bir ızgara kutusuna yerleştirin. 30 dakika sonra, kesitler transmisyon elektron mikroskobu ile incelenebilir.

Sincap maymununun internal globus pallidusuna ait bu elektron mikrografı, immunoperoksidaz diaminobenzidin tekniğinde akrolein-PFA transkardiyak perfüzyon sonrası iyi korunmuş materyalleri göstermektedir. Burada görüldüğü üzere, prosedür, ok ucuyla belirtilen büyük bir aksonun miyelin kılıfının görülmesine olanak tanır. External globus pallidusun bu elektron mikrografı; d harfiyle belirtilen dendritik profillerin, a ile belirtilen küçük miyelinsiz aksonların ve av olarak etiketlenen akson varisositelerinin kolayca tanımlanabildiğini kanıtlamaktadır.

Oklar, dendritik profile ile simetrik bir sinaptik temas kuran bir akson varisitesine örneği göstermektedir. İmmünolabelenmiş elementler, elektron yoğunluğundaki DAB çökeleği ile dolu sitoplazmaları veya aksoplazmaları sayesinde kolayca tanımlanabilir. Burada, GPi'de kolin asetiltransferaz için immünboyanmış bir dendrit, işaretlenmemiş bir akson varisitesinden sinaptik bir temas almaktadır.

Bu elektron mikrografı, aksoplazması tirozin hidroksilaz için immünlekelenmiş, nispeten sağlam bir miyelin kılıfına sahip GPe'deki miyelinizasyonlu bir aksonu göstermektedir. Bu örnek, bir dendrit ile simetrik bir sinaptik temas kuran, serotonin taşıyıcısı için immünlekelenmiş GPi'deki bir akson varisitesini göstermektedir. Bu örnekte, DAB çökeleği plazma membranını ve organellerin dış yüzeyini kaplamaktadır.

Burada gösterilen akson varikositesi GPe'de gözlemlenmiş ve tirozin hidroksilaz için immünlekelenmiştir. Bu, sinaptik veziküllerin görünür olduğu ancak sınırlarının belirlenmesinin daha zor olduğu, DAB çökeleğinin aksoplazmayı tamamen doldurduğu bir örneği temsil etmektedir. Bu prosedürün ardından, proteinlerin veya reseptörlerin sinaptik düzeydeki kolokalizasyonları gibi ek soruları yanıtlamak için gömme öncesi çift immünohistokimya gibi diğer yöntemler uygulanabilir.

Bu videoyu izledikten sonra, primat olmayan beyin dokusunda gömme öncesi immünohistokimya hazırlığının nasıl yapılacağı, epoksi reçineye gömme işlemine nasıl geçileceği ve ilgi duyulan bölgenin elektron mikroskobuna uygun 80 µm kalınlığında kesitlere nasıl ayrılacağı konusunda iyi bir anlayış kazanmış olmalısınız.