İmmünohistokimya ve elektron mikroskobu Ön gömme için İnsan Olmayan Primat Beyin Dokusu Hazırlanması

Bu deneyin genel amacı, elektron mikroskobu için primat olmayan beyin dokusunun güvenilir bir şekilde önceden gömülmüş immün boyamasını elde etmektir. Bu yöntem, belirli bir beyin yapısındaki belirli bir innervasyonun sinaptik insidansı gibi nöroanatomi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin ana avantajı, elektron mikroskobu için uygun spesifik innervasyonları etiketlemek için kolay ve düşük maliyetli bir yöntem olmasıdır.

İlgilenilen bölgeyi içeren 50 mikron kalınlığındaki akrolein sabit insan olmayan primat beyninin bölümlerini PBS içeren 12 oyuklu bir plakaya aktararak başlayın. Serbest yüzen bölümleri oda sıcaklığında beş dakika boyunca PBS'de üç kez yıkayın, ardından bölümleri oda sıcaklığında 30 dakika boyunca taze hazırlanmış sodyum borhidrür çözeltisinde inkübe edin. Kapaksız nazikçe sallayın.

30 dakika geçtikten sonra, sodyum borhidrürü aspire edin ve her bir oyuğa PBS ekleyin. Plakayı bir külbütörün üzerine yerleştirin ve 10 dakika kuvvetlice çalkalayın. Yıkamayı iki kez daha veya reaksiyon gazının hiçbiri kalmayana kadar tekrarlayın.

PBS içinde seyreltilmiş% 2 normal serum ve% 0.5 soğuk balık jelatini çözeltisi içinde oda sıcaklığında bir saat boyunca hafifçe sallanarak bölümleri bloke edin. İnkübasyon süresi geçtikten sonra, bölümleri oda sıcaklığında gece boyunca hafifçe sallayarak birincil antikor çözeltisi içinde inkübe edin. Ertesi gün, bölümleri daha önce olduğu gibi yıkadıktan sonra, bölümleri ikincil antikor çözeltisi içinde oda sıcaklığında bir buçuk saat boyunca hafifçe sallayarak inkübe edin.

Bölümleri daha önce olduğu gibi yıkadıktan sonra, avidin-biotin-peroksidaz veya ABC çözeltisinde bir saat sallanarak inkübe edin. Daha sonra, TBS'de seyreltilmiş% 0.05 hidrojen peroksit ile% 0.05 3, 3'Diaminobenzidin içeren taze bir çözelti hazırlayın. Yıkadıktan sonra, DAB çözeltisindeki bölümleri hafifçe sallayarak üç ila yedi dakika inkübe edin.

Kahverengi çökelti istenen renge dönüştüğünde, soğuk TBS'de iki kez hızlı bir şekilde yıkayarak, ardından bir dizi zamanlanmış TBS ve PB yıkaması yaparak reaksiyonu durdurun. DAB lekeli bölümleri içeren plakayı havalandırma davlumbazına aktarın. Bölümleri PB ile doldurulmuş altı oyuklu bir plakaya aktarın ve PB'yi plakadan dikkatlice pipetleyerek bölümleri tamamen düzleştirin, ardından düzleştirilmiş bölümleri rahatsız etmemek için osmiyum tetroksit çözeltisini damla damla ekleyin.

Bölümleri ışıktan korumak için plakayı alüminyum folyo ile örtün ve çalkalama olmadan oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. Osmifikasyon sırasında, epoksi reçine karışımının her bir bileşeninden uygun miktarlarda büyük bir plastik kaba ekleyerek su itici epoksi reçine hazırlayın. Tahta bir çubuk veya plastik pipet ile homojen bir kahverengi renk elde edilinceye kadar karıştırın, ardından işlenecek bölüm sayısına uygun büyüklükteki alüminyum kaplara eşit miktarda reçine aktarın ve dinlenmeye bırakın.

Osmifikasyon süresi geçtikten sonra, bölümleri PB'de 10 dakika boyunca düşük hızda sallayarak üç kez yıkayın. Yıkadıktan sonra, aşağıdaki kademeli etanol serisindeki bölümleri her biri iki dakika boyunca kurutun. Daha sonra, bölümleri propilen oksit ile doldurulmuş cam şişelere aktarın ve dehidrasyon işlemini tamamlamak için propilen oksit içinde her biri iki dakika boyunca üç kez inkübe edin.

Daha sonra bölümleri dikkatlice tek tek alüminyum kaplara aktarın ve mümkün olduğunca hava ile temasından kaçının. Bölümleri önceden karıştırılmış su itici epoksi reçineye düz bir şekilde gömün ve gece boyunca oda sıcaklığında havalandırma davlumbazının altında inkübe edin. Ertesi gün, cam slaytları ve plastik kapak fişlerini mineral yağ ile kaplayın, ardından alüminyum kapları 60 derecede en fazla 12 ila 15 dakika inkübe ederek reçineyi yumuşatın.

Cam sürgünün yağlanmış tarafındaki bölümleri dikkatlice düzleştirin. Yağlanmış kapak sürgüsünü yerleştirin ve kalan havayı dikkatlice dışarı itin. Slaytları 48 saat boyunca 60 santigrat derecede inkübe edin.

48 saat sonra, plastik kapak sürgüsünü çıkarın ve bölümü reçine ile kaplanmış halde bırakın. İlgilenilen bölgeyi bulmak için dürbün kullanarak başlayın ve ardından yaklaşık bir mililitre karelik küçük bir dörtgen doku parçasını kesmek için bir neşter kullanın. Ardından, bir reçine bloğunun ucunu törpüleyin ve ardından dörtgen doku parçasını üzerine yapıştırın.

Kuruduktan sonra, reçine bloğunu ultramikrotom güvertesine dikey konumda yerleştirin ve reçine bloğunun her iki tarafını da düz kenarlı bir yamuk oluşturmak üzere kademeli olarak kesmek için keskin bir tıraş bıçağı kullanın. Ardından, güverteyi yatay konumuna getirin ve yamuğun en uzun kenarı aşağı bakacak şekilde bloğu döndürün. Özel bir alana bir elmas düzeltme aleti veya bir cam bıçak yerleştirin.

Ultramikrotomu saniyede bir milimetre hızında 300 mikronluk kesitler kesecek şekilde ayarlayın. Bıçağı dörtgen parçaya dikey olarak paralel olacak ve yaklaşık bir derecelik çok küçük bir yatay açı gösterecek şekilde ayarlayın ve doku görünmeye başlayana kadar dörtgen parçanın yüzeyini düzeltin. Şimdi, 80 mikron kalınlığındaki bölümleri kesmek için damıtılmış suyla doldurulmuş bir tekne ile donatılmış ultra 45 derecelik bir elmas bıçağa geçin.

Su yüzeyine dokunmadan ksilen uçlu bir parça emici kağıt ile üzerlerinden geçerek bölümleri düzeltin ve çıplak 150 gözenekli bakır ızgaralar üzerinde seri bölümleri toplayın. Izgaraları bir ızgara saklama kutusuna yerleştirin, ardından bire bir kurşun sitrat stok çözeltisi ve damıtılmış su çözeltisi hazırlayın ve 0,2 mikronluk bir şırınga filtresinden süzün. Işıktan korumak için şişeyi alüminyum folyo ile örtün.

Her bir ızgarayı, çözelti ile temas eden bölüm olacak şekilde seyreltilmiş kurşun sitrat çözeltisinin bir damlasına yerleştirin Daha sonra ızgarayı tutmak için küçük cımbız kullanın ve damıtılmış su içeren iki beherde iyice durulayın. Fazla suyu emici kağıtla nazikçe çıkarın ve ızgaraları bir ızgara kutusuna yerleştirin. 30 dakika sonra, kesitler transmisyon elektron mikroskobu ile incelenebilir.

Sincap maymunu internal globus pallidusun bu elektron mikrografı, immünoperoksidaz diaminobenzidin tekniğinde akrolein-PFA transkardiyak perfüzyonundan sonra iyi korunmuş materyali göstermektedir. Orada görüldüğü gibi, prosedür, ok ucu ile gösterilen büyük bir aksonun miyelin kılıfının görülmesini sağlar. Dış globus pallidusun bu elektron mikrografı, d harfi ile gösterilen dendritik profilleri, a ile gösterilen küçük miyelinsiz aksonları ve av etiketli akson varislerini kolayca tanımlayabilir.

Oklar, dendritik profil ile simetrik bir sinaptik temas kuran bir akson varisitesi örneğini göstermektedir. İmmün etiketli elementler, elektron yoğun DAB çökeltisi ile doldurulmuş sitoplazmaları veya aksoplazmaları ile kolayca tanımlanabilir. Burada, GPi'deki kolin asetiltransferaz için immün olarak boyanmış bir dendrit, etiketlenmemiş bir akson varikozluğundan sinaptik bir temas alır.

Bu elektron mikrografı, GPe'de, aksoplazması tirozin hidroksilaz için immün olarak işaretlenmiş nispeten sağlam bir miyelin kılıfına sahip miyelinli bir aksonu gösterir. Bu örnek, bir dendrit ile simetrik bir sinaptik temas kuran serotonin taşıyıcısı için immün olarak işaretlenmiş GPi'de bir akson varikozluğunu göstermektedir. Bu örnekte, DAB çökeltisi plazma zarını ve organellerin dış yüzeyini kaplar.

Burada gösterilen akson varikozisi GPe'de gözlendi ve tirozin hidroksilaz için immün etiketli hale getirildi. Bu, aksoplazmayı tamamen dolduran DAB çökeltisinin bir örneğini temsil eder, sinaptik veziküller görünürdür ancak tanımlanması daha zordur. Bu prosedürü takiben, proteinlerin veya reseptörlerin sinaptik düzeyde kolokalizasyonları gibi ek soruları yanıtlamak için önceden gömme çift immünohistokimya gibi başka yöntemler de gerçekleştirilebilir.

Bu videoyu izledikten sonra, primat olmayan beyin dokusunun gömme öncesi immünohistokimyasının nasıl hazırlanacağını, epoksi reçineye gömülmeye nasıl devam edileceğini ve ilgilenilen bölgeyi elektron mikroskobu için uygun 80 mikrometre kalınlığında kesitlere nasıl ultrakeseceğini iyi anlamış olmalısınız.