Kuruluş ve Eğitim için bir Yüksek Verimli Kur Optimizasyonu Staphylococcus epidermidis Ve Mycobacterium marinum Enfeksiyon İlaç Keşif için bir model olarak

Bu prosedürün genel amacı, ilaç keşfini mümkün kılmak için yüksek verimli bileşik testi için çok sayıda enfekte zebra balığı embriyosu üretmektir. Bu, ilk olarak tek bir olayda çok sayıda senkron zebra balığı yumurtası elde etmek için büyük bir üreme kabı kullanılarak gerçekleştirilir. Daha sonra, yumurtalar bir aros ızgarasına hizalanır ve otomatik bir mikro enjektör kullanılarak yumurta sarısındaki bakterilerle enfekte edilir.

Enfeksiyon embriyolar yoluyla yayıldığında, ilaçlarla tedavi edilmeden önce büyük partikül akış sitometrisi ile önceden sıralanırlar. Son olarak, enfekte embriyolardaki bakteri yükü seviyeleri bileşik tedaviden sonra analiz edilir. Sonuçta, konfokal mikroskopi omuru ile yüksek çözünürlüklü analiz.

Bileşiklerin enfeksiyon üzerindeki etkilerini daha ayrıntılı olarak göstermek için otomatik tarama ve büyük partikül örneklemesi kullanılır. Bu yöntemin manuel enjeksiyonlar veya PIX tarama analizi gibi mevcut tekniklere göre en büyük avantajı, bununla yüksek verimli bir şekilde analiz edebileceğimiz büyük miktarda homojen olarak etkilenmiş embriyo üretebilmemizdir. S epiderm inokulumunu hazırlamak için, A PW VW 180 9'dan türetilmiş M kiraz ekspresyon vektörü içeren bir S epiderm suşu plakası O 47'den birkaç ayrı koloniyi izole edin ve aşılayın.

Mililitre başına 10 mikrogram ile desteklenmiş 25 mililitre LB. Kloramfenikol, ertesi gün orta kilit aşamasına kadar 37 santigrat derecede gece boyunca inkübe edilir, kültürün bir mililitresini 12.000 GS'de bir dakika boyunca santrifüjleyin ve peleti üç kez yıkamak için hacim başına% 0.3 hacim ile 80 mililitre steril PBS kullanın. OD 600'deki optik yoğunluğu ölçün ve bakteriyel süspansiyonu mililitre başına sekiz CFU'ya eşit 0.3 veya bir kez 10 ila 10'a eşit bir OD 600'e seyreltmek için PBS'de hacim başına% 2 ağırlık, polivinil peron 40 veya PVP 40 kullanın.

Aminum inoculum hazırlamak için, M Meum suşundan M veya E 11'den birkaç ayrı koloniyi izole edin, PS MT 3M kiraz vektörünü bir Middlebrook yedi H 10 havalandırdıktan sonra kararlı bir şekilde ifade edin ve hacim başına% 10 hacim içeren 10 mililitre Middlebrook yedi H dokuz et suyu aşılayın. Middlebrook: Mililitre başına 50 mikrogram higromisin ile desteklenmiş bir DC zenginleştirmesi, ertesi gün gece boyunca 28 santigrat derecede inkübe edilir. Kültürün bir mililitresini 12.000 GS'de bir dakika boyunca santrifüjleyin ve peleti üç kez yıkamak için hacim başına% 0.3 hacim ile 80 arasında bir mililitre steril PBS kullanın.

Bakteriyel süspansiyonun OD 600'ünü ve hacim başına %2 ağırlıkla ölçün. PBS'deki PVP 40, toplamadan önceki gece zebra balığı yumurtaları elde etmek için mililitrede 10 ila sekiz CFU'nun 0,3 veya 0,3 katı OD 600'e seyreltilir, büyük bir üreme kabının alt haznesine en fazla 50 dişi zebra balığı ve geminin üst kısmına 70 erkek yerleştirin. Ertesi sabah, ayırıcıyı kaptan çıkarın Üreme kabının altındaki yumurta toplayıcıdan yaklaşık bir saat sonra, yumurtaları yumurta suyu ile doldurulmuş 50 mililitrelik bir tüpe toplayın.

Enjeksiyon plakalarını hazırladıktan sonra, otomatik mikro enjektör çalıştırma yazılımı üzerindeki metin protokolüne göre kalibre et'e tıklayın, ardından 10 24'e tıklayın. Kuyu ızgarası ve aros plakasını mikro enjektöre yerleştirin, kuyunun orta konumundaki ekrana tıklayarak plakayı kalibre edin. Ardından iğne menüsüne gidin ve iğne tutucuyu kalibre et'e tıklayın.

Bir mikro yükleyici ucu kullanarak, 10 mikron çapında bir uç enjeksiyon iğnesini, nanolitre S epiderm başına 100 CFU, nanolitre erum başına 30 CFU veya sahte enjeksiyonlar için tek başına PVP 40 içeren 10 mikrolitre PVP 40 ile doldurun, iğneyi otomatik mikro enjektöre yerleştirin ve iğneyi indirerek veya yukarı hareket ettirerek ve iğnenin konumundaki ekrana tıklayarak XY konumunu kalibre edin. Ardından, iğnenin ucunun konumundaki ekrana tıklayarak iğnenin Z konumunu kalibre edin. Ardından, yumurtaları aros ızgarasına dağıtmak için plastik bir transfer pipeti kullanın ve fazla yumurta suyunu çıkarın.

Ardından, yumurtalarla doldurulmuş agros ızgarasını enjeksiyon menüsündeki otomatik mikro enjektöre yerleştirin, enjeksiyon basıncı ayarını 200 hektar paskal'a, enjeksiyon süresini 0,2 saniyeye ve dengeleme basıncını 15 Hektor Paskal'a ayarlayın, bu da Femto jet ayarları menüsünde bir nanolitre ile ilişkilidir. Hepsini enjekte et'e tıklayın ve enjeksiyondan sonra tüm embriyo plakasını enjekte edin. Yumurtaları bir Petri kabında yıkayarak toplayın ve 28 santigrat derecede inkübe edin.

Büyük partikül akış sitometresi kurulduktan sonra, PMT menüsüne girin ve kırmızı kanalı 650 volta ve yeşil ve sarı kanalları sıfır volta ayarlayın. Ardından eşikler menüsünde, optik yoğunluk eşik sinyalini 50 milivolta karşılık gelen 975'ye ve minimum uçuş süresini 800'e karşılık gelen 320 mikrosaniyeye ayarlayın. Enkazın etkisini azaltmak için, embriyoları numune kabına yerleştirin ve 70 girerek sıralanacak plaka başına maksimum 70 embriyoyu bulmak için sıralama menüsüne yerleştirin.

Sıralayıcının altına boş bir Petri kabı yerleştirin ve manuel sıralamaya tıklayın. Petri kabı dolduğunda, mağazaya tıklayarak verileri kaydedin. Yüksek çözünürlüklü analiz veya görüntüleme gerekiyorsa, embriyolar 96 oyuklu bir plakanın kuyucuklarına ayrı ayrı sıralanabilir.

Embriyoları numune kabına yerleştirin ve sıralanacak oyuk başına en fazla bir embriyo tanımlayın. Ardından boş bir 96 kuyulu plakayı sol plaka tutucusuna yerleştirin ve doldurma plakasına tıklayın. Plaka doldurulduğunda, erum ile enjeksiyondan üç gün sonra ilaçla tedavi edilen embriyoları analiz etmek için mağazaya tıklayarak verileri kaydedin.

Bir grup embriyoyu çözücü içinde ilgilenilen bir bileşik ile ve ikinci bir grubu tek başına çözücü ile tedavi edin. Tedavi edilen embriyoları döllenmeden dört ve beş gün sonra akış sitometresindeki numune kabına yerleştirin ve trica'daki embriyoları uyuşturduktan ve omurgalı otomatik tarama sistemini ve büyük partikül örnekleyiciyi kurduktan sonra sıralamayı plaka başına 70 embriyoya ayarlayın. Görüntüleme nesnesi algılama kurulum menüsündeki metin protokolüne göre, görüntüleme otomatik kaydetme görüntüleri menüsünde embriyoların yaşına karşılık gelen referans görüntüleri seçin, oluşturulacak resim sayısını ve kullanılacak yönü seçin.

Embriyolarla dolu 96 oyuklu bir plakayı, büyük parçacık örnekleyicinin sol plaka tutucusuna yerleştirin ve çalıştırma plakasına tıklayın. Bir embriyo doğru bir şekilde yerleştirildiğinde, 10 x düz kuru objektif kullanın ve baş ve kuyruğu ayrı ayrı görüntüleyin. Ardından, yumurta sarısı enfeksiyonu için hangi gelişim aşamasının en iyi olduğunu değerlendirmek üzere görüntüleri bir araya getirmek için görüntü işleme yazılımını kullanın.

Dermit ve marum enjeksiyonları, bir ve 512 hücre aşaması arasındaki tüm farklı aşamalarda gerçekleştirildi. Burada görüldüğü gibi, 16 ila 128 hücre evresi arasında gerçekleştirilen 100 CFU dermit enjeksiyonları en iyi enfeksiyon paternini sağlamıştır. Bakteriler yumurta sarısı içinde üç gün boyunca çoğaldı ve enfeksiyondan üç gün sonra vücuda yayıldı.

Bakteri yükünün yüksek verimli nicelleştirilmesi, büyük partikül akış sitometresi kullanılarak floresan yoğunluk analizi ile gerçekleştirildi. Burada gösterildiği gibi, embriyo içinde bulunan canlı bakteri miktarı, ölçülen floresan sinyaline çok iyi karşılık gelir. Bu şekil, 30 CFU'luk aminum enjeksiyonu için optimal gelişim aşamasının, E 11 suşu için 16 ila 128 hücre aşaması arasında ve 16 ila 64 hücre aşaması arasında olduğunu göstermektedir.

Daha öldürücü EM suşu ile bu aşamalarda enjekte edilen embriyolar, meşe içinde bakteri üremesini ve bakterilerin embriyo boyunca yayılmasını gösterdi. Emerin ile enfekte embriyoların farklı rifampisin konsantrasyonları ile tedavisinden sonra, mikobakteriyel enfeksiyonun doza bağlı bir şekilde azaldığını gösterdi. İlacın 200 mikromolar dozda kullanılması, M mein E 11'in bakteriyel ilerlemesini, geliştirilmesinden 24 saat sonra ve tedaviden sonra etkili bir şekilde durdurduğunu göstermiştir.

Bu teknikler, tüberküloz veya biyomateryal ilişkili enfeksiyonlar gibi enfeksiyon hastalıkları için yeni tedaviler arayan bileşik test ve ilaç geliştirme alanındaki araştırmacıların yolunu açtı.