Name: Dendritik Dikenlerin Çalışması için Seri Blok-Yüz Tarama Elektron Mikroskopisi (SBEM) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-02T14:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 16 s
Description: Öğrenin, SBEM ile fare hipokampusundaki dendritik dikenlerin yüksek çözünürlüklü görüntülenmesini. Bu yöntem, sinaptik plastisite ve öğrenme bellek süreçlerini anlamak için nöronal ağların bağlantısını detaylı şekilde ortaya koyar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Nencki Deneysel Biyoloji Enstitüsü'nde görüntüleme çekirdeği tesisi olarak hizmet veren Görüntüleme Doku ve fonksiyon laboratuvarının ekipmanlarının kullanımı ile SBEM görüntüleme, ışık mikroskopi görüntüleme ve elektron mikroskopi numunesi hazırlama yapıldı.
Şekil 1'in hazırlanması için bir farenin (Souris_02) görüntüsü ve https://smart.servier.com/ bir şişe kullanılmıştır.
Bu çalışma, KR'ye verilen Ulusal Bilim Merkezi (Polonya) Grant Opus (UMO-2018/31/B/NZ4/01603) tarafından desteklendi.

Araştırma, Nencki Enstitüsü yönergelerine ve Yerel Etik Komitesi'nin iznine uygun olarak gerçekleştirildi. Çalışmalar, 24 Kasım 1986 (86/609/EEC) avrupa topluluklar konseyi direktifi, Polonya Hayvanları Koruma Yasası uyarınca yürütülmüş ve Varşova'daki ilk Yerel Etik Komitesi tarafından onaylanmıştır. Kullanılan hayvan sayısını ve acılarını en aza indirmek için tüm çabalar sarf edildi.
DİkKAT: Aşağıda açıklanan tüm prosedürler laboratuvar dumanı davlumbazında yapılmalıdır. Kullanılan reaktiflerin tehlikeli doğası nedeniyle. Eldiven, laboratuvar önlüğü, güvenlik gözlüğü ve yüz maskesi gibi kişisel güvenlik önlemleri gereklidir.
1. Perfüzyon için fiksatif hazırlanması (0.1 M fosfat tamponunda (PB), pH 7.4'te perfüzyon (%2 wt/vol paraformaldehit (PFA) ve %0.5 vol/vol glutaraldehit (GA)
NOT: Fiksatif çözeltiyi kullanılacağı gün hazırlayın ve 3 saatten daha uzun süre saklamayın. Zaman sıkıntısı durumunda, bir gün önce 0,1 M PB'de% 2 PFA hazırlayın, 4 ° C'de saklayın ve perfüzyondan kısa bir süre önce taze GA ekleyin.
<ol><li>400 mL steril çift damıtılmış su (ddH2O) alın ve karıştırmalı bir sıcak plaka kullanarak 60 °C'ye ısıtın. Ardından 20 g PFA ekleyin. PFA tamamen çözünene kadar 1 M NaOH damlaları ekleyin ve karışımın soğumasını bekleyin.</li>
	<li>500 mL 0,2 M PB (pH 7,4) ekleyin.</li>
	<li>Herhangi bir tortuyu çıkarmak için çözeltiyi filtreleyin ve 4 °C'ye soğutun.</li>
	<li>Perfüzyondan hemen önce, çözeltiye% 25 GA'nın 20 mL'sini ekleyin ve ardından hacmi ddH 2 O ile1L'ye yükseltin.</li>
</ol>2. SBEM için postperfüzyon fiksatifinin hazırlanması (0,1 M PB, pH 7,4'te % 2 wt/vol PFA ve % 2,5 vol/vol GA)
<ol><li>Perfüzyon için 50 mL fiksatif alın (0,1 M PB'de %2 PFA ve %0,5 GA).</li>
	<li>%25 GA'nın 5 mL'sini ekleyin.</li>
</ol>3. IF boyama için postperfüzyon fiksatifinin hazırlanması (fosfat tamponlu salinde (PBS) %4 PFA)
<ol><li>1x PBS (pH 7.4) tableti üretici talimatlarına göre arıtılmış ve deiyonize bir suda (H2O) çözün.</li>
	<li>Çözeltiyi 60 °C'ye ısıtmak ve 40 g PFA eklemek için karıştırmalı bir sıcak plaka kullanın.</li>
	<li>PFA tamamen çözünene kadar 1 M NaOH damlaları ekleyin ve karışımın soğumasını bekleyin.</li>
	<li>Çözeltinin pH'ını 1 M HCl ile 7,5'e ayarlayın, ardından H 2 O ile1L'ye kadar ses seviyesini ayarlayın.</li>
	<li>Tortuları kaldırmak için çözeltiyi filtreleyin.</li>
</ol>4. Hayvanların transkardiyal perfüzyonu
NOT: Tüm PFA ve GA atıkları yerel yönetmeliklere göre toplanmalı ve bertaraf edilmek üzere saklanmalıdır. Anestezi ve perfüzyon yerel yönetmeliklere uygun olmalıdır. Açıklanan protokolde yetişkin 3 aylık ve 20±1 aylık dişi Thy1-GFP(M) fareler (Thy1-GFP +/-)12 adet seyrek dağılmış glutamaterjik nöron popülasyonunda yeşil floresan proteini (GFP) ifade eden ancak diğerleri de kullanılabilir. Hayvanlar, Nencki Deneysel Biyoloji Enstitüsü Hayvan Evi'nde C57BL/6J arka planına sahip heterozygotlar olarak yetiştirildi.
<ol><li>Perfüzyondan önce bir fareyi ketamin/ksilazin karışımı (90 mg/kg vücut ağırlığı ketamin ve 10 mg/kg vücut ağırlığı kslazine kadar) intraperitoneal enjeksiyon (27-gauge iğne) ile kullanarak uyuşturun.<ol>
<li>Ağrı uyaranlarına (sıkışma) ve kornea refleksine (şaşılık) karşı refleksi kontrol ederek anestezi derinliğinin yeterli olup olmadığını değerlendirin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>20 dakika sonra sodyum pentobarbital (50 mg/kg vücut ağırlığı) intraperitoneal enjeksiyon (27-gauge iğne) yapın.</li>
	<li>Bir fareyi Gage ve ark.13 tarafından açıklanan perfüzyon cerrahisi protokolüne göre perfüzyon edin (bkz. nokta 4; Şekil 5-6). Perfüzyon pompası kullanarak 0,1 M fosfat tamponu, 3 dakika boyunca pH 7,4 (30 mL) ile başlayın ve 0,1 M PB'de %2 PFA ve %0,5 GA ile devam edin, 6 dakika (80 mL) için pH 7,4.<ol>
<li>Beyni kafatasından hafifçe ayırın ve ikiye bölün (bkz. Gage ve ark., 201213).'deŞekil 9-10). Bir parçayı SBEM için fiksatif içeren bir şişeye, ikinci parçayı ise IF boyama için% 4 PFA / PBS ile şişeye yerleştirin.</li>
		<li>Yarımküreleri bir gecede 4 °C'de sabitleyicide tutun.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Elektron mikroskopisi için beyin dilimleri hazırlığı
<ol><li>Vibratom ayarlarını seçin (bıçak hareket hızı: 0,075 mm/s, kesme frekansı: 80 Hz).</li>
	<li>Dilim haznesini tutucuya yerleştirin, vibratoğa takın ve buzla çevreleyin. Daha sonra vibratom bıçağı tutucusuna bir jilet yerleştirin.</li>
	<li>Bir kaşık veya benzer bir nesne kullanın ve soğutulmuş beyni (sırt yüzeyi yukarı) sert bir kesme yüzeyi (örneğin, cam bir Petri kabı kapağı) üzerine yerleştirin. Hipokampüsün koronal bir dilimini hazırlamak için serebral yarımküre ile beyincik arasında jilet veya neşterle dik bir kesim yapın, böylece beyincik çıkarılır. Koku ampulü de çıkarılabilir.</li>
	<li>Vibratomin kuru platformuna siyanoakrilat tutkal uygulayın.</li>
	<li>Beyni toparlayıp filtre kağıdına dikkatlice kurulayın.</li>
	<li>Yarımküreyi, rostral uç yukarı doğru kesme bıçağına yakın platforma yapıştırın. Platformu tutucuya takın ve hemen buz gibi 0,1 M PB, pH 7,4 ile doldurun. Dik kesim düzgün yapılırsa, yarımküre hipokampus içeren simetrik bir koronal kesim yapmak için gereken 90 ° açıyı sağlayarak düz durur. Beynin PB ile kaplı olduğundan emin olun.</li>
	<li>Vibratom bıçağını yarımkürenin önüne yerleştirin ve yarımkürenin koronal tarafına küs. Bıçağı kaudal yönde 400 μm daha aşağı 400 μm'ye küçümseyin ve dilimlemeye başlayın. İlk iki dilim doku bloğundan tamamen ayrılana kadar dilimlenmeye devam edin.</li>
	<li>Bıçağı geri çek ve 100 μm daha indir, sonra tekrar dilimle.</li>
	<li>Hipokampus görünür hale geldiğinde (fare beyin atlası Paxinos ve Franklin, 200414kullanın) dilimleri küçük boya fırçası veya genişlemiş plastik Pasteur pipet ile toplayın.</li>
	<li>Dilimleri soğuk 0,1 M PB, pH 7,4 ile doldurulmuş 12 kuyulu bir tabağa aktarın.</li>
	<li>Hipokampusu jilet veya neşter kullanarak 0,1 M PB, pH 7,4 ile doldurulmuş cam bir Petri kabında parçalara ayırın ve aynı fosfat tamponuna sahip cam şişelere koyun. NOT: Dilimlerin uzun süreli depolanmasının %0,05 sodyum azit (NaN3)ile 0,1 M PB eklenmiş olması.</li>
</ol>6. İmmünasyon için beyin örneği hazırlığı
<ol><li>Duman kaputunda% 4 PFA / PBS çözeltisinde gece sabitlemeden sonra, beyin dokusunu kriyoprezervasyon çözeltisine koyun (% 0.05 NaN 3 ile PBS'de%30sakkaroz) ve 2 gün boyunca (batana kadar) 4 ° C'de tutun.</li>
	<li>Bir antifriz çözeltisi hazırlayın (%15 sakkaroz/%30 etilen glikol/%0,05 NaN3/PBS).</li>
	<li>Kriyostatın dolap sıcaklığını -19 °C olarak ayarlayın ve daha fazla ilerlemeden önce sıcaklığa ulaşıldığından emin olun. Kesit sırasında, kabin sıcaklığının -18 °C ile -20 °C arasında kaldığından emin olun.</li>
	<li>Bir kaşık veya benzer bir nesne kullanın ve soğutulmuş beyni (sırt yüzeyi yukarı) sert bir kesme yüzeyi (örneğin, cam bir Petri kabı kapağı) üzerine yerleştirin. Hipokampüsün koronal bir dilimini hazırlamak için serebral yarımküre ile beyincik arasında jilet veya neşterle dik bir kesim yapın, böylece beyincik çıkarılır.</li>
	<li>Önceden soğutulmuş bir numune diski seçin, bir serbest rafta donmak için bir ortamla örtün ve forseps kullanarak yarımküreyi diske rostral bir uçla yukarı doğru sabitlayın ve numune tamamen donana kadar bekleyin. Numune diskini bir numune kafasına yerleştirin.</li>
	<li>Kriyo haznesinin içindeki bir bıçak tutucuya bir bıçak takın ve 40 μm kalınlığında dilimler kesin.</li>
	<li>Küçük bir boya fırçası ile dilimleri soğuk anti-freeze çözeltisi ile doldurulmuş 96 kuyu plakasına aktarın ve bölümleri hafifçe açın (dilim odasında kaybolmalarını önlemek için her dilimleme turundan sonra bir dilim toplayın). NOT: Beyinler veya bölümler -20 °C'de bir antifriz çözeltisinde uzun süre saklanabilir.</li>
</ol>7. Beyin dilimlerinin immünostaining
NOT: Tüm boyama adımları bir platform çalkalayıcıda 24 kuyulu bir plakada gerçekleştirildi.
<ol><li>Dilimleri PBS ile her seferinde 6 dakika boyunca üç kez yıkayın.</li>
	<li>Dilimleri 300 μL blokaj çözeltisinde (%5 normal eşek serumu (NDS)/%0,3 Triton X-100) bir rotatör üzerinde hafifçe sallanarak 1 saat boyunca kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>4 °C'de bir gecede %5 NDS/%0,3 Triton X-100/PBS (kuyu başına 300 μL) ile 1:500 seyreltilmiş PSD-95'e karşı birincil antikor ile dilimleri kuluçkaya yatırın. Birincil antikorun son konsantrasyonu 2 μg/mL'dir.</li>
	<li>Dilimleri oda sıcaklığında (RT) %0,3 Triton X-100/PBS ile her seferinde 6 dakika boyunca üç kez yıkayın.</li>
	<li>İkincil antikor ile dilimleri 90 dakika boyunca % 0,3 Triton X-100 / PBS'nin 300 μL'sinde 1:500 seyreltin. İkincil antikorun son konsantrasyonu 4 μg /mL'dir.</li>
	<li>Dilimleri PBS ile her seferinde 6 dakika boyunca üç kez yıkayın.</li>
	<li>Dilimleri bir montaj ortamı kullanarak slaytlara monte edin ve sonra bir kapak slaydı ile kapatın.</li>
	<li>Konfokal mikroskop kullanarak numuneleri inceleyin (63 × yağ hedefi, NA 1.4, piksel boyutu 0.13 μm × 0.13 μm). NOT: Uzun süreli depolama için: numuneleri 4 °C'de tutun, ışıktan koruyun.</li>
</ol>8. SBEM numune hazırlama
DİkKAT: Kullanılan reaktiflerin tehlikeli yapısı nedeniyle aşağıda açıklanan tüm prosedürler laboratuvar duman kaputunda yapılmalıdır. Bu kimyasalları kullanmadan önce, üreticiler tarafından sağlanan Malzeme Güvenliği Veri Sayfalarını dikkatlice okuyun ve güvenli kullanım ve atık bertarafını sağlamak için güvenlik görevlisine yerel kuralları sorun.
<ol><li>Örnek karşıtlığı NOT: Dilim yıkama ve oda sıcaklığı inkübasyonu hafif sallama ile yapılmalıdır (örneğin, bir platform çalkalayıcıda). Otoklav gazdan arındırılmış su kullanılmıştır.<ol>
<li>Dilimleri her seferinde 3 dakika boyunca soğuk 0,1 M PB, pH 7,4 ile beş kez yıkayın.</li>
		<li>%4 sulu osmiyum tetroksit ve %3 potasyum ferrosiyanit karışımı hazırlayın (vol tarafından 1:1). Son ürün kahverengiye dönecektir. Örnekleri bu karışıma daldırin, buza yerleştirin ve bu aşamadan itibaren onları ışıktan korumak önemlidir. Onları 1 saat boyunca hafifçe sallayarak kuluçkaya yatırın.</li>
		<li>Bu arada bir tiyokarbohidrazid (TCH) çözeltisi hazırlayın. 10 mL çift damıtılmış H2O (ddH2O) ve 0,1 g TCH karıştırın ve 1 saat boyunca 60 °C'de ayarlanmış bir fırına yerleştirin. Çözeltiyi zaman zaman döndürmek önemlidir (örneğin, her 10 dakikada bir). Hazır olduğunuzda oda sıcaklığına soğutin.</li>
		<li>Dilimleri her seferinde 3 dakika boyunca beş kez ddH2O ile yıkayın.</li>
		<li>TCH çözümünü 0,22 μm şırındıcı filtre kullanarak filtreleyin ve numuneyi filtrelenmiş çözeltiye daldırın. Dilimler siyaha dönecek. Oda sıcaklığında 20 dakika kuluçkaya yatır.</li>
		<li>Numuneleri her seferinde 3 dakika boyunca beş kez ddH2O ile yıkayın.</li>
		<li>Numuneleri oda sıcaklığında 30 dakika boyunca% 2 sulu OsO4 çözeltisi ile kuluçkaya yatırın.</li>
		<li>Numuneleri her seferinde 3 dakika boyunca beş kez ddH2O ile yıkayın.</li>
		<li>Numuneleri filtrelenmiş % 1 sulu uranil asetat içine yerleştirin ve bir gecede 4 ° C'de kuluçkaya bırakın. Filtrasyon için 0,22 μm şırınna filtresi kullanın.</li>
		<li>0,4 g L-aspartik asit ve 80 mL ddH2O karıştırarak L-aspartik asit çözeltisini hazırlayın, daha kolay çözünmesi için pH'ı 3,8'e ayarlayın ve ardından 100 mL'ye kadar suyla toplayın.</li>
		<li>Ertesi gün, Walton'ın15 hazırlıkla başla. 0.066 g kurşun nitratı 10 mL L-aspartik asit çözeltisi (nokta 8.1.10) ile 60 °C'ye önceden ısıtılmış olarak karıştırın ve pH'ı 1 M NaOH ile 5.5'e (60 °C'de ölçülür) ayarlayın. Şişeyi kurşun aspartat ile kapatın ve bir su banyosunda 30 dakika boyunca 60 °C'de bırakın. Çözüm açık olmalı. Bulutlu hale gelirse, atılmalıdır ve yeni bir tane hazırlanmalıdır.</li>
		<li>Bu arada, numuneleri gazsız ddH ile2O ile her seferinde 3 dakika boyunca beş kez yıkayın. Daha sonra 60 °C'de ayarlanmış fırında 30 dakika bekletin.</li>
		<li>Numuneleri taze hazırlanmış kurşun aspartat çözeltisine daldırin ve 60 °C'de 20 dakika boyunca fırına inkübte edin.</li>
		<li>Numuneleri gazsız ddH ile2O ile her seferinde 3 dakika boyunca beş kez yıkayın.</li>
	</ol></li>
	<li>Dehidrasyon ve reçine gömme<ol>
<li>Epoksi reçinesi hazırlayın. 16 damla hızlandırıcı DMP 30 eklemeden önce malzemeleri (33,3 g bileşen A/M, 33,3 g bileşen B ve 1 g bileşen D) tartın ve reçineyi iyice karıştırın (örneğin, 15 mL'lik bir tüpte döner çalkalayıcı üzerinde çalkalayın). 10 dakika daha karıştırın. NOT: Duman kaputunun altındaki malzemeleri tartın. Bu miktarda bileşen, numuneli 15 şişe için yeterli olan yaklaşık 60 mL reçine verir. Reçinenin geri kalanını daha az hazırlayabilir veya 4 °C'de bir şırınnada saklayabilir ve ertesi gün kullanabilirsiniz. Şırındağının ucunu mühürlemeyi unutma.</li>
		<li>Etanol dereceli seyreltmeler ile şişeler hazırlayın (%30, %50, %70, %90, %100, suda %100 etanol ve %100 moleküler elek üzerinde kurutulmuş).</li>
		<li>%50 reçine elde etmek için reçineyi 1:1 oranında %100 etanol ile karıştırın. İyice karıştırın.</li>
		<li>Numuneleri% 30'dan başlayarak ve moleküler elek üzerinde kurutulan% 100 susuz etanol ile biten her etanol seyreltmesinde 5 dakika susuz bırakın. Unutmayın, numuneler asla tamamen kurumamalıdır.</li>
		<li>Örneklere ilk olarak 30 dakika boyunca %50 reçine, bir saat boyunca %100 reçine ve bir gecede tekrar %100 reçine ile sızın. Tüm sızma adımlarını sürekli yavaş sallanarak gerçekleştirin.</li>
		<li>Ertesi gün, örnekleri bir saat boyunca taze% 100 reçineye yerleştirin ve daha sonra floropolimer gömme levhaları arasına gömün. Etanol ile gömme levha parçalarını yağdan arındırın ve destek olarak iki cam slayt kullanarak numuneleri iki katmanın arasına düz bir şekilde gömün. Numunenin üzerinde veya yakınında reçinede hava kabarcıklarından kaçınmaya çalışın.</li>
		<li>Numuneleri 70 °C'de fırında en az 48 saat boyunca iyileştirin.</li>
	</ol></li>
	<li>Kırpma ve montaj<ol>
<li>Gömme levhalarını ayırın ve gömülü numunenin bir parçasını (yaklaşık 1 mm x 1 mm) jiletle kesin. Parafilme aktarın. Bu, elektrostatik nedeniyle numuneyi kaybetme tehlikesini en aza indirecektir.</li>
		<li>Etanol ile yağdan arındırılmış bir alüminyum pim alın. İltifatlı bir epoksiyi iyice karıştırın ve numuneyi pime monte etmek için biraz kullanın. 70 °C'de iletken epoksiyi 10 dakika boyunca tedavi edin.</li>
		<li>Örnek bloğun her iki tarafını elmas bıçakla kesin ve doku açığa olana kadar bloğun yüzünü parlatın. NOT: Bu adımda, bazı bölümleri toplayarak ve toluidin mavisi boyama16 gerçekleştirerek veya elektron mikroskobu altında kontrol ederek ilgi çekici bir bölgenin varlığını onaylayın.</li>
		<li>Numunenin boyutunu mümkün olduğunca azaltın. Daha sonra numuneyi iletken boya ile pime topraklayın ve tedavi etmenin (oda sıcaklığında 24 saat veya 65 °C'de fırında 40 dakika).</li>
		<li>Şarj yapıtlarını en aza indirmek için, numuneleri ince bir altın veya altın/paladyum tabakasıyla kaplayın.</li>
	</ol></li>
</ol>9. SBEM görüntüleme
<ol><li>Bir örnekle pimi seri blok yüz tarama elektron mikroskobu odasına yerleştirin. Örneği bıçağa hizalayın. Bölmeyi kapatın ve parametreleri ayarlayın.</li>
	<li>İstediğiniz büyütme, piksel boyutu, dilim kalınlığı, hızlandırılmış voltaj (EHT), diyafram, basınç vb. NOT: Parametreler örneğe ve denemenin amacına bağlıdır. Örnek ilk görüntüleme ayarları malzeme tablosuna dahildir.</li>
</ol>10.3D yeniden yapılanmalar
NOT: Aşağıda belirtilen adımlar için FijiJ17 (ImageJ sürüm 1.49b), Mikroskopi Görüntü Tarayıcısı (MIB)18 ve Reconstruct19 gibi açık erişimli yazılımlar kullanıyoruz, ancak çeşitli başka yazılımlar kullanılabilir.
<ol><li>Dijital mikrograf (dm) dosyalarını TIFF formatına dönüştürün. Önce görüntü sırasını içe aktarın (FijiJ' de: Dosya > > Görüntü sırasını içe aktarın > 8 Bit Biçimi Seçin)ve ardından TIFF olarak kaydedin (FijiJ: Dosya > > Görüntü Sırası Olarak Kaydet > Tiff'i Seçin).</li>
	<li>Görüntü yığınının parlaklığını ve kontrastını ayarlayın (FijiJ: Görüntü > > Parlaklığını / Kontrastını Ayarlayın)ve gerekirse denoise (FijJ20 için DenoisEM eklentisini kullanın: Eklentiler > DenoiseEM > Denoise).</li>
	<li>Yığını hizalayın (FijiJ' de: StagReg veya MIB> eklentiler: Veri Kümesi > Hizalama Araçları).</li>
	<li>Segment dendritik dikenler ve sinapslar (MIB veya Reconstruct yazılımında kapsamlı öğreticiler mevcuttur (ayrıntılar için Malzeme Tablosu'ne bakın).</li>
</ol>

<ol><li>Bosch, M., Hayashi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+plasticity+dendritic+spines%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Structural plasticity dendritic spines.</a> Current Opinion in Neurobiology. 22 (3), 383-388 (2012).</li>
<li>Borczyk, M., Radwanska, K., Giese, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+importance+of+ultrastructural+analysis+of+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research+Bulletin%22%5BJournal%5D)">The importance of ultrastructural analysis of memory.</a> Brain Research Bulletin. 173, 28-36 (2021).</li>
<li>Wanner, A. A., Kirschmann, M. A., Genoud, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Challenges+of+microtome-based+serial+block-face+scanning+electron+microscopy+in+neuroscience%3A+challenges+of+SBEM+in+neuroscience%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Challenges of microtome-based serial block-face scanning electron microscopy in neuroscience: challenges of SBEM in neuroscience.</a> Journal of Microscopy. 259 (2), 137-142 (2015).</li>
<li>Śliwińska, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+Memory+Upscales+Volume+of+Postsynaptic+Densities+in+the+Process+that+Requires+Autophosphorylation+of+%CE%B1CaMKII%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebral+Cortex%22%5BJournal%5D)">Long-term Memory Upscales Volume of Postsynaptic Densities in the Process that Requires Autophosphorylation of αCaMKII.</a> Cerebral Cortex. 30 (4), 2573-2585 (2020).</li>
<li>Borczyk, M., Śliwińska, M. A., Caly, A., Bernas, T., Radwanska, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+plasticity+affects+correlation+between+the+size+of+dendritic+spine+and+its+postsynaptic+density%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Neuronal plasticity affects correlation between the size of dendritic spine and its postsynaptic density.</a> Scientific Reports. 9 (1), 1693(2019).</li>
<li>Leighton, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SEM+images+of+block+faces%2C+cut+by+a+miniature+microtome+within+the+SEM+-+a+technical+note%5BTitle%5D)+AND+%22Scanning+Electron+Microscopy%22%5BJournal%5D)">SEM images of block faces, cut by a miniature microtome within the SEM - a technical note.</a> Scanning Electron Microscopy. , Pt 2 73-76 (1981).</li>
<li>Denk, W., Horstmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+Block-Face+Scanning+Electron+Microscopy+to+Reconstruct+Three-Dimensional+Tissue+Nanostructure%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy to Reconstruct Three-Dimensional Tissue Nanostructure.</a> PLoS Biology. 2 (11), 329(2004).</li>
<li>Smith, D., Starborg, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+block+face+scanning+electron+microscopy+in+cell+biology%3A+Applications+and+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+and+Cell%22%5BJournal%5D)">Serial block face scanning electron microscopy in cell biology: Applications and technology.</a> Tissue and Cell. 57, 111-122 (2019).</li>
<li>Titze, B., Genoud, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Volume+scanning+electron+microscopy+for+imaging+biological+ultrastructure%3A+Volume+scanning+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Volume scanning electron microscopy for imaging biological ultrastructure: Volume scanning electron microscopy.</a> Biology of the Cell. 108 (11), 307-323 (2016).</li>
<li>Deerinck, T. J., Bushong, E. A., Thor, A., Ellisman, M. H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDeerinck%2C+TJ+%22NCMIR+methods+for+3D+EM%3A+A+new+protocol+for+preparation+of+biological+specimens+for+serial+block+face+scanning+electron+microscopy%22">NCMIR methods for 3D EM: A new protocol for preparation of biological specimens for serial block face scanning electron microscopy</a>. , 6-8 (2010).</li>
<li>Willingham, M. C., Rutherford, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+osmium-thiocarbohydrazide-osmium+%28OTO%29+and+ferrocyanide-reduced+osmium+methods+to+enhance+membrane+contrast+and+preservation+in+cultured+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+%26+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">The use of osmium-thiocarbohydrazide-osmium (OTO) and ferrocyanide-reduced osmium methods to enhance membrane contrast and preservation in cultured cells.</a> Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 32 (4), 455-460 (1984).</li>
<li>Feng, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+Neuronal+Subsets+in+Transgenic+Mice+Expressing+Multiple+Spectral+Variants+of+GFP%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Imaging Neuronal Subsets in Transgenic Mice Expressing Multiple Spectral Variants of GFP.</a> Neuron. 28 (1), 41-51 (2000).</li>
<li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+Animal+Perfusion+Fixation+for+Rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), e3564(2012).</li>
<li>Paxinos, G., Franklin, K. B. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPaxinos%2C+G+%22The+mouse+brain+in+stereotaxic+coordinates%22">The mouse brain in stereotaxic coordinates</a>. , Acad. Press. San Diego, Calif. (2004).</li>
<li>Walton, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lead+aspartate%2C+an+en+bloc+contrast+stain+particularly+useful+for+ultrastructural+enzymology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+%26+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Lead aspartate, an en bloc contrast stain particularly useful for ultrastructural enzymology.</a> Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 27 (10), 1337-1342 (1979).</li>
<li>Mercer, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+scheme+for+section+staining+in+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Royal+Microscopical+Society%22%5BJournal%5D)">a scheme for section staining in electron microscopy.</a> Journal of the Royal Microscopical Society. 81 (3-4), 179-186 (1963).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Belevich, I., Joensuu, M., Kumar, D., Vihinen, H., Jokitalo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microscopy+Image+Browser%3A+A+Platform+for+Segmentation+and+Analysis+of+Multidimensional+Datasets%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Biology%22%5BJournal%5D)">Microscopy Image Browser: A Platform for Segmentation and Analysis of Multidimensional Datasets.</a> PLOS Biology. 14 (1), 1002340(2016).</li>
<li>Fiala, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstruct%3A+a+free+editor+for+serial+section+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Reconstruct: a free editor for serial section microscopy.</a> Journal of Microscopy. 218 (1), 52-61 (2005).</li>
<li>Roels, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+interactive+ImageJ+plugin+for+semi-automated+image+denoising+in+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">An interactive ImageJ plugin for semi-automated image denoising in electron microscopy.</a> Nature Communications. 11 (1), 771(2020).</li>
<li>Radwanska, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+for+long-term+memory+formation+when+synaptic+strengthening+is+impaired%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Mechanism for long-term memory formation when synaptic strengthening is impaired.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (45), 18471-18475 (2011).</li>
<li>Kittelmann, M., Hawes, C., Hughes, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+block+face+scanning+electron+microscopy+and+the+reconstruction+of+plant+cell+membrane+systems%3A+SBFSEM+Methods+for+Plant+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Serial block face scanning electron microscopy and the reconstruction of plant cell membrane systems: SBFSEM Methods for Plant Cells.</a> Journal of Microscopy. 263 (2), 200-211 (2016).</li>
<li>Fendrych, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programmed+Cell+Death+Controlled+by+ANAC033%2FSOMBRERO+Determines+Root+Cap+Organ+Size+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Programmed Cell Death Controlled by ANAC033/SOMBRERO Determines Root Cap Organ Size in Arabidopsis.</a> Current Biology. 24 (9), 931-940 (2014).</li>
<li>Russell, M. R. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+correlative+light+and+electron+microscopy+of+cultured+cells+using+serial+blockface+scanning+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">3D correlative light and electron microscopy of cultured cells using serial blockface scanning electron microscopy.</a> Journal of Cell Science. 130 (1), 278-291 (2017).</li>
<li>Płachno, B. J., Świątek, P., Jobson, R. W., Małota, K., Brutkowski, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+block+face+SEM+visualization+of+unusual+plant+nuclear+tubular+extensions+in+a+carnivorous+plant+%28Utricularia%2C+Lentibulariaceae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Botany%22%5BJournal%5D)">Serial block face SEM visualization of unusual plant nuclear tubular extensions in a carnivorous plant (Utricularia, Lentibulariaceae).</a> Annals of Botany. 120 (5), 673-680 (2017).</li>
<li>Genoud, C., Titze, B., Graff-Meyer, A., Friedrich, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+Homogeneous+En+Bloc+Staining+of+Large+Tissue+Samples+for+Volume+Electron+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroanatomy%22%5BJournal%5D)">Fast Homogeneous En Bloc Staining of Large Tissue Samples for Volume Electron Microscopy.</a> Frontiers in Neuroanatomy. 12, (2018).</li>
<li>Puhka, M., Joensuu, M., Vihinen, H., Belevich, I., Jokitalo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progressive+sheet-to-tubule+transformation+is+a+general+mechanism+for+endoplasmic+reticulum+partitioning+in+dividing+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Progressive sheet-to-tubule transformation is a general mechanism for endoplasmic reticulum partitioning in dividing mammalian cells.</a> Molecular Biology of the Cell. 23 (13), 2424-2432 (2012).</li>
<li>Gluenz, E., Wheeler, R. J., Hughes, L., Vaughan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scanning+and+three-dimensional+electron+microscopy+methods+for+the+study+of+Trypanosoma+brucei+and+Leishmania+mexicana+flagella%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Scanning and three-dimensional electron microscopy methods for the study of Trypanosoma brucei and Leishmania mexicana flagella.</a> Methods in Cell Biology. 127, 509-542 (2015).</li>
<li>Starborg, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+transmission+electron+microscopy+and+3View+to+determine+collagen+fibril+size+and+three-dimensional+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Using transmission electron microscopy and 3View to determine collagen fibril size and three-dimensional organization.</a> Nature Protocols. 8 (7), 1433-1448 (2013).</li>
<li>Hughes, L., Borrett, S., Towers, K., Starborg, T., Vaughan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterns+of+organelle+ontogeny+through+a+cell+cycle+revealed+by+whole-cell+reconstructions+using+3D+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Patterns of organelle ontogeny through a cell cycle revealed by whole-cell reconstructions using 3D electron microscopy.</a> Journal of Cell Science. 130 (3), 637-647 (2017).</li>
<li>Bojko, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+Autophagic+Flux+in+Escapers+from+Doxorubicin-Induced+Senescence%2FPolyploidy+of+Breast+Cancer+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Improved Autophagic Flux in Escapers from Doxorubicin-Induced Senescence/Polyploidy of Breast Cancer Cells.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (17), 6084(2020).</li>
<li>Knott, G. W., Holtmaat, A., Trachtenberg, J. T., Svoboda, K., Welker, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protocol+for+preparing+GFP-labeled+neurons+previously+imaged+in+vivo+and+in+slice+preparations+for+light+and+electron+microscopic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">A protocol for preparing GFP-labeled neurons previously imaged in vivo and in slice preparations for light and electron microscopic analysis.</a> Nature Protocols. 4 (8), 1145-1156 (2009).</li>
<li>Glauert, A. M., Lewis, P. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGlauert%2C+AM+%22Biological+specimen+preparation+for+transmission+electron+microscopy%22">Biological specimen preparation for transmission electron microscopy</a>. , Princeton University Press. Princeton. (2014).</li>
<li>Genoud, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+Synapse+Formation+in+the+Adult+Somatosensory+Cortex+of+Brain-Derived+Neurotrophic+Factor+Heterozygote+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Altered Synapse Formation in the Adult Somatosensory Cortex of Brain-Derived Neurotrophic Factor Heterozygote Mice.</a> Journal of Neuroscience. 24 (10), 2394-2400 (2004).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Deerinck tarafından 2010 yılında açıklanan birincil NCMIR yönteminin birçok varyasyonu vardır10. Temel ilkeler aynı kalır, ancak çalışılan malzemenin türüne bağlı olarak hafif değişiklikler uygulanır. Daha önce, SBEM için numuneleri gömmek için farklı reçinelerin kullanılabileceği ve örneğin bitkiler söz konusu olduğunda, Spurr's hücre duvarlarından daha iyi sızmaya izin veren düşük viskozitesi nedeniyle tercih edilen reçinedir22,23. Ayrıc...

Merkezi sinir sistemindeki uyarıcı sinapsların çoğu dendritik dikenler üzerinde bulunur - bir nöronal zarın küçük çıkıntıları. Bu çıkıntılar hücre içi sinyal transdüksiyonu kontrol eden sınırlı biyokimyasal bölmeler oluşturur. Dendritik dikenlerin ve sinapsların yapısal plastisitesi, öğrenme ve hafıza gibi önemli süreçlerin altında yatan sinaptik etkinlikteki fonksiyonel değişikliklerle yakından ilgilidir1,2. Elektron mikroskopisinin (EM) dendritik bir omurganın presynaptik bir girişi olup olmadığını belirlemeye izin veren tek teknik olduğunu belirtmek önemlidir. EM çözünürlüğü, bir sinapsın postynaptik bir kısmını temsil eden postsinaptik yoğunluğun (PSD) şekli veya dendritik bir omurganın boyutlarının yanı sıra bir aksonal boutonun boyutu ve şekli gibi ultrayapısal ayrıntıları incelemek için de gereklidir. Ek olarak, EM ile sinapsları ve çevrelerini görselleştirmek mümkündür.
Görüntüleme ve bilgi işlem teknolojilerindeki gelişmeler sayesinde tüm sinir devrelerini yeniden oluşturmak mümkündür. Nöronal devre rekonstrüksiyonlarında seri kesit iletim elektron mikroskopisi (ssTEM), seri blok yüz taramalı elektron mikroskopisi (SBEM) ve odaklanmış iyon ışını tarama elektron mikroskopisi (FIB-SEM) gibi hacimli elektron mikroskopi teknikleri yaygın olarak kullanılmaktadır3.
Çalışmalarımızda, fare hipokampus ve organotipik beyin dilimleri örneklerinde dendritik dikenlerin ve PSD'lerin yapısal plastisitesini araştırmak için SBEM yöntemibaşarıyla4 ,5. SBEM, taramalı elektron mikroskop odası 6 ,7,8,9'uniçine minyatür bir ultramikrotomkurulumunadayanmaktadır. Örnek bloğun üst kısmı görüntülenir ve daha sonra numune ultramikrotom tarafından belirtilen derinlikte kesilir, tekrar görüntülenen ve daha sonra işlem tekrarlanan yeni bir blok yüzü ortaya çıkar8. Sonuç olarak, kesilen dilim enkaz olarak kaybolurken yalnızca bir blok yüzünün görüntüsü bırakılır. Bu nedenle SBEM yıkıcı bir teknik olarak adlandırılır, yani aynı yeri tekrar imgelemek mümkün değildir. Bununla birlikte, yıkıcı blok üzerindeki yöntemlerin avantajı, veri kalitesini ve veri analizini önemli ölçüde etkileyebilecek çarpıtma sorunlarından ve kesit kaybından muzdarip olmamasıdır3. Ayrıca, SBEM yüksek çözünürlükte nispeten geniş bir görüş alanı (&gt; 0,5 mm × 0,5 mm) görüntüleme imkanı verir3.
SBEM'i çalıştırmak için, numunelerin görüntü almak için kullanılan arkadan saçılmış elektron dedektörü nedeniyle özel, son derece zıt bir protokole göre hazırlanması gerekir. 1980'lerde geliştirilen azaltılmış osmium-tiyokarbohidrazür-osmiyum (rOTO) lekeleri kullanılarak Deerinck 10 (Ulusal Mikroskopi ve Görüntüleme Araştırmaları Merkezi (NCMIR) yöntemi ile geliştirilen bir prosedüre dayanan protokole göre numune hazırlamanın nasıl gerçekleştirildiğini burada gösteriyoruz. Buna ek olarak, hafif fiksasyon perfüzyonu ile hem hafif mikroskopi hem de SBEM ile immünofluoresans çalışmaları için aynı beyni kullanmaya izin veren iki aşamalı bir fiksasyon yaklaşımı sunuyoruz.
Protokolde bir fare beyni öncelikle hafif bir fiksatif ile sabitlenir ve daha sonra yarıya indirilir ve bir yarımküre, em çalışmaları için iken, bir yarımküre postfixed ve immünofluoresans (IF) için hazırlanır (Şekil 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62712/62712fig01.jpg"> Şekil 1. SBEM ile analiz için dendritik diken hazırlığı için iş akışının şematik gösterimi. Fareler kurban edildi ve hafif bir birincil fiksatif ile perfüzyon yapıldı. Beyin yarıya indirildi ve bir yarımküreye immünofluoresans (IF)- adanmış fiksatif, kriyoproteksk, kriyostat kullanılarak dilimlenmiş ve IF çalışmaları için işlenmiş, diğer yarımküre ise EM fiksatif ile yapıştırılmış, vibratom ile dilimlenmiş ve EM çalışmaları için hazırlanmıştır. SBEM çalışmaları için beyin dilimleri kontrast oluşturmuş, reçineye gömülü düz, daha sonra hipokampüsün bir CA1 bölgesi pime monte edilmiş ve SBEM ile görüntülenmiştir (Şekil 1). Protokolün sarı bir kutuda vurgulanan kısmı videoda yer aldı. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62712/62712fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

<table><tbody><tr><td>&lt; güçlü &gt; Anestezik: &lt; / güçlü &gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Ketamin / ksilazin karışımı (Ketamin / Sedazin)</td> <td>Biowet Pulawy, Pulawy, Polonya</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sodyum pentobarbital (Morbital)</td> <td>Biowet Pulawy, Pulawy, Polonya</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>&lt; güçlü &gt; Fiksatifler: &lt; / güçlü &gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Glutaraldehit (GA)</td> <td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MI, ABD</td><td>G5882</td><td>Sınıf I, H2O'da %, elektron mikroskobu fikstürü fiksatif olarak kullanılmak üzere özel olarak saflaştırılmış</td></tr><tr><td>Hidroklorik asit (HCl)</td><td>POCH, Gliwice, Polonya</td><td>575283115</td><td>saf pa</td></tr><tr><td>Paraformaldehit (PFA)</td><td>Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, ABD</td><td>441244</td><td>prilled,% 95</td></tr> <tr><td>Fosfat tamponlu salin (PBS), pH 7.4</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MI, ABD</td><td>P4417-50TAB</td><td>tabletleri</td></tr><tr><td>Sodyum hidroksit (NaOH)</td> <td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MI, ABD</td><td>S5881</td><td>reaktif sınıfı, <img alt="Denklem" src="/files/ftp_upload/62712/62712symbol.png">98%, peletler ( susuz)</td></tr><tr><td>Sodyum fosfat dibazik (Na2HPO4)</td><td>Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, ABD</td><td>S3264</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum fosfat monobazik (NaH2PO4)</td><td>Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, ABD</td><td>S3139</td><td></td></tr><tr><td><g>Perfüzyon: &lt; / güçlü&gt;</g></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Büyük künt / künt kavisli makas (~14,5 cm)</td><td>Fine Science Tools, Foster City, CA, ABD</td><td>14519-14</td><td></td></tr><tr><td>Mikro spatula (çift 2" düz uçlu, biri yuvarlak, biri 1/8" olarak sivrilmiş)</td><td>Fine Science Tools, Foster City, CA, ABD</td><td>10091-12</td><td></td></tr><tr><td>İğne ucu, 15 GA, künt (perfüzyon iğnesi)</td><td>KD Medical GmbH Hastane Ürünleri, Berlin, Almanya</td><td>KD-FINE 900413</td><td>1.80 x 40 mm</td></tr><tr><td>İnce (Graefe) cımbız</td><td>Güzel Bilim Araçları, Foster City, CA, ABD</td><td>11050-10</td><td></td></tr><tr><td>Perfüzyon pompası</td><td>Kurşun Sıvısı</td><td>BQ80S</td><td></td></tr><tr><td>Plastik şişeler</td><td>Profilab, Varşova, Polonya</td><td>534.02</td> kağıt <td>mendil saklama için mavi kapaklı plastik şişeler, 20 ml, 31 x 48 mm</td></tr><tr><td>Düz iris makası (~9 cm)</td><td>Fine Science Tools, Foster City, CA, ABD</td><td>14058-11</td><td></td></tr><tr><td>EM için beyin dilimleri hazırlama: güçlü&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>12 kuyulu plaka</td><td>NEST, Rahway, NJ, ABD</td><td>712001</td><td></td></tr><tr><td>Siyanoakrilik yapıştırıcı</td><td>Fenedur, Montevideo, Uruguay</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cam şişeler</td><td>Elektron Mikroskobu Bilimleri, Hatfield, PA, ABD</td><td>72632</td><td>20 ml Sintilasyon Şişesi, 100'lük bir paket</td></tr><tr><td>Pasteur pipeti</td><td>VWR, Radnor, PA, ABD</td><td>612-4545</td><td>LDPE, tek kullanımlık, 7,5 ml</td></tr><tr><td>Tıraş bıçağı</td><td>Wilkinson Sword, Londra, Birleşik Krallık</td><td></td><td>Klasik çift kenarlı güvenlik tıraş bıçağı</td></tr><tr><td>Neşter bıçağı</td><td>Swann-Morton, Sheffield, Birleşik Krallık</td><td>No. 20</td><td></td></tr><tr><td>Vibratom</td><td>Leica Microsystems, Viyana, Avusturya</td><td>Leica VT1000 S</td><td></td></tr><tr><td>Beyin dilimleri IF:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>96 kuyulu plaka</td><td>için hazırlık NEST, Rahway, NJ, ABD</td><td>701101</td><td></td></tr><tr><td>Criostat</td><td>Leica Microsystems, Viyana, Avusturya</td><td>Leica CM 1950</td><td></td></tr><tr><td>Etilen glikol</td><td>Bioshop, Burlington, Kanada</td><td>ETH001</td><td></td></tr><tr><td>Düşük profilli tek kullanımlık bıçak 819</td><td>Leica Biosystems Inc., ABD</td><td>14035838925</td><td></td></tr><tr><td>Neşter bıçağı</td><td>Swann-Morton, Sheffield, Birleşik Krallık</td><td>No. 20</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum azit (NaN3)</td><td>POCH, Gliwice, Polonya</td><td>792770426</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>POCH, Gliwice, Polonya</td><td>772090110</td><td></td></tr><tr><td>Kriyoseksiyon için doku dondurma ortamı, OCT-Bileşik</td><td>Leica Biosystems, İsviçre</td><td>14020108926</td><td></td></tr><tr><td><g>İmmün boyama: &lt; / güçlü&gt;</g></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>24 oyuklu plaka</td><td>NEST, Rahway, NJ, ABD</td><td>702001</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Post Sinaptik Yoğunluk Proteini 95 Antikor</td><td>Merck-Millipore, Burlington, MA, ABD</td><td>MAB1598</td><td></td></tr><tr><td>Konfokal mikroskop</td><td>Zeiss, Gö ttingen, Almanya</td><td></td><td>Zeiss İplik Diski mikroskobu (63 ve kez; yağ objektifi, NA 1.4, piksel boyutu 0.13 ve mikro; m &amp; zamanlar; 0.13 ve mikro; m)</td></tr> <tr><td>Kapak sürgüsü</td><td>Menzel Glaser, Braunschweig, Almanya</td><td>B-1231</td><td>24 x 60 mm</td></tr><tr><td>Eşek anti-Fare IgG (H + L) Yüksek Çapraz Adsorbe Edilmiş İkincil Antikor, Alexa Fluor 555</td><td>Invitrogen, Carlsbad, CA, ABD</td><td>A31570</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount-G Montaj Ortamı, DAPI</td><td>Invitrogen, Carlsbad, CA, ABD</td><td>00-4959-52</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop lamı</td><td>Thermo Scientific, Waltham, MA, ABD</td><td>AGAA00008</td><td>SuperFrost</td></tr><tr><td>Normal eşek serumu (NDS)</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA, ABD</td><td>017-000-121</td><td></td></tr><tr><td>Shaker</td><td>JWElectronic, Varşova, Polonya</td><td>KL-942</td><td></td></tr><tr><td>TritonT X-100 Reaktif Sınıfı</td><td>Bioshop, Burlington, Kanada</td><td>TRX506</td><td></td></tr><tr><td><g>Elektron mikroskobu numune hazırlama</g></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Potasyum hekzasiyanoferrat(II) trihidrat</td><td>POCH, Gliwice, Polonya</td><td>746980113</td><td></td></tr><tr><td>Aclar 33C Film</td><td>Elektron Mikroskobu Bilimleri, Hatfield, PA, ABD</td><td>50425</td><td>Floropolimer Film gömme levhası</td></tr><tr><td>DMP-30, 2,4,6-Tris(dimetilaminometil)fenol</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MI, ABD</td><td>T58203</td><td>Epoksi gömme ortam hızlandırıcı</td></tr><tr><td>Durcupan ACM tek bileşenli A, M</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MI, ABD</td><td>44611</td><td>Durcupan ACM tek bileşenli A, M epoksi reçine</td></tr><tr><td>Durcupan ACM tek bileşenli B</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MI, ABD</td><td>44612</td><td>Durcupan ACM tek bileşenli B, sertleştirici 964</td></tr><tr><td>Durcupan ACM tek bileşenli D</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MI, ABD</td><td>44614</td><td>Durcupan ACM tek bileşenli D, plastikleştirici</td></tr><tr><td>Etil alkol mutlak</td><td>POCH, Gliwice, Polonya</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td><img alt="Denklem" src="/files/ftp_upload/62712/62712symbol.png"></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td><img alt="Denklem" src="/files/ftp_upload/62712/62712symbol.png"></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>ó&amp;OACUTE</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td><img alt="Denklem" src="/files/ftp_upload/62712/62712symbol.png"></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>&amp;</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td><img alt="Denklem" src="/files/ftp_upload/62712/62712symbol.png"></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> &amp;zamanlar&amp;nbk</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>® </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>°</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> ±   </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

dendritik dikenlerin Çalışması için seri blok-yüz tarama elektron mikroskopisi (sbem)

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy (SBEM) for the Study of Dendritic Spines

Üç boyutlu elektron mikroskopisi (3D EM), dendritik dikenlerin morfolojik parametrelerini nano ölçekli çözünürlükle analiz etme imkanı sunar. Ek olarak, dendritik dikenlerin hacmi ve sinaptik yoğunluk sonrası (PSD) (sinapsın post-sinaptik kısmını temsil eden), presynaptik terminalin varlığı ve PSD'nin pürüzsüz endoplazmik retikülum veya atipik formu (örneğin, çok içli omurgalar) gibi bazı özellikleri sadece 3D EM ile gözlemlenebilir. Seri blok yüz taramalı elektron mikroskopisi (SBEM) kullanarak, 3D EM verilerini geleneksel seri kesitleme yaparken olduğundan daha kolay ve tekrarlanabilir bir şekilde elde etmek mümkündür. Burada fare hipokampal örneklerinin SBEM analizi için nasıl hazırlanacağını ve bu protokolün dendritik dikenlerin immünofluoresans çalışması ile nasıl birleştirilebileceğini gösteriyoruz. Hafif fiksasyon perfüzyonu beynin bir yarısına hafif mikroskopi ile immünofluoresans çalışmaları yapmamızı sağlarken, diğer yarısı SBEM için hazırlanmıştır. Bu yaklaşım, çalışma için kullanılacak hayvan sayısını azaltır.

Yüksek kontrastın üzerinde açıklanan yöntem kullanılarak fare beyin dokusunun iyi çözünürlüklü görüntüleri elde edilebilir. SBEM tekniği tarafından sağlanan geniş bir görüş alanı, ilgi çekici bölgenin hassas bir şekilde seçilmesini kolaylaştırır. Hipokampüsün CA1 bölgesinin büyük görüntüsü stratum radiatum (SR) uzunluğunu ölçmek (Şekil 2A) ve görüntülemeyi tam olarak merkezde ayarlamak için alınmıştır (Şekil 2B). Daha sonra, görüntü yığını elde edildi v...

Murine hipokampustaki dendritik dikenleri görüntülemek ve analiz etmek için Seri Blok-Yüz Tarama Elektron Mikroskopisi (SBEM) uygulanır.

Dendritik Dikenlerin Çalışması için Seri Blok-Yüz Tarama Elektron Mikroskopisi (SBEM)

Three-dimensional electron microscopy (3D EM) gives a possibility to analyze morphological parameters of dendritic spines with nanoscale resolution. In ...

Beyindeki her nöron diğer nöron hücreleriyle yaklaşık 7.000 sinapsla bağlanır. Memeli beynindeki sinapsların esas olarak dendritik diken adı verilen zarın küçük çıkıntılarında bulunması dışında. Sinapsların ve dendritik dikenlerin ve benzeri önemli beyin fonksiyonlarının plastisitesi öğrenme ve hafıza süreçleri gibi.Sadece elektron mikroskopisi, dendritik bir omurganın postiniptik bir girdiye sahip olup olmadığı hakkında tam bir fikir verdiğini belirtmek önemlidir. Dendritik diken görüntüleme ile ilgili çeşitli teknikler mevcuttur. Bununla birlikte, seri blok yüz taramalı elektron mikroskopisi, yüksek çözünürlüklü büyük hacimli dokuyu görüntülemesi için benzersiz bir olasılık sağlar.Seri blok bazlı taramalı elektron mikroskopi tekniği, ağır metallerle güçlü kontrast içeren özel bir numune hazırlama protokolü gerektirir. Perfüzyon sırasındaki birincil fiksasyonum, hafifletilmiş elektron mikroskopisi için aynı beyinleri kullanmamızı sağladı. Fareler kurban edildi ve hafif bir birincil fiksatif ile perfüzyon yapıldı.Beyin yarıya indirildi ve bir yarımküre immünofluoresansa adanmış fiksatif, kriyoprotektif ile sabitlendi, kriyostat kullanılarak dilimlendi ve immünofluoresans çalışmaları için işlendi. Diğer yarımkürenin elektron mikroskopisi fiksatifi ile sabitlendiği, vibratomla dilimlendiği ve elektron mikroskopi çalışmaları için hazırlandığı yer. Seri blok bazlı taramalı elektron mikroskopi çalışmaları için beyin dilimleri kontrast oluşturdu, reçineye düz bir şekilde gömüldü, daha sonra hipokampüsün bir CA1 bölgesi pime monte edildi ve seri blok tabanlı tarama elektron mikroskobu ile görüntülendi.Protokolün sarı bir kutuda vurgulanan kısmı videoda yer aldı. Sabitlenmiş ve 100 mikrobiyotik dilim halinde kesilmiş dokuyu alın ve her biri üç dakika boyunca beş kez soğuk fosfat tamponu ile yıkayın. %4 osmiyum tetroksit ve %3 potasyum ferrosiyanid karışımı hazırlayın.Son ürün kahverengiye dönecektir. Örnekleri bu karışıma daldırin. Sonra örnekleri buza yerleştirin.Ve bu aşamadan itibaren onları ışıktan korumak önemlidir. Onları bir saat boyunca hafifçe sallayarak kuluçkaya yatırın. Bu arada, TCH çözümünü hazırlayın.10 mililitre çift damıtılmış su ve 0,1 gram TCH karıştırın. Bir saat boyunca 60 Santigrat derece fırından fırına yerleştirin. Çözeltiyi zaman zaman swill önemlidir.Hazır olduğunuzda oda sıcaklığına soğutun. Şimdi numuneleri her biri üç dakika boyunca beş kez çift damıtılmış suyla yıkayın ve ardından filtrelenmiş TCH çözeltisine daldırin. Dilimler siyaha dönecek.Oda sıcaklığında 20 dakika kuluçkaya yatır. Numuneleri her biri üç dakika boyunca beş kez çift damıtılmış suyla yıkayın ve bu kez oda sıcaklığında 30 dakika boyunca% 2 osmiyum tetroksit ile kuluçkaya yatırın. Yine, numuneleri her biri üç dakika boyunca beş kez çift damıtılmış su ile yıkayın ve filtrelenmiş% 1 veya amil asetat içine yerleştirin.Onları bir gecede 4 santigrat derecede kuluçkaya yatır. Ertesi gün, D-aspartat hazırlığı ile başlayın. Kurşun nitratı 60 santigrat dereceye kadar önceden ısıtılmış aspartik asit çözeltisi ile karıştırın.Karışımı 60 santigrat dereceye ayarlanmış bir su banyosuna yerleştirin ve pH'ı bir azı dişi sodyum hidroksit ile 5,5'e ayarlayın. Şişeyi kurşun aspartat ile kapatın ve 60 santigrat derecede 30 dakika bekletin. Çözüm açık olmalı.Bulutlu hale gelirse atılmalıdır ve yeni bir tane hazırlanmalıdır. Bu arada, numuneleri gazlı çift damıtılmış su ile beş kez üç dakika yıkayın ve 60 santigrat derecede fırında 30 dakika tutun. Numuneleri taze hazırlanmış kurşun aspartat çözeltisine daldırin ve 20 dakika boyunca 60 santigrat derece olarak ayarlanmış fırında kuluçkaya yatırın.Epoksi reçinesi hazırlayın. Malzemeleri tartın ve hızlandırıcı DMP 30 eklemeden önce reçineyi en az 30 dakika iyice karıştırın. Etanol dereceli seyreltme ile virüs hazırlayın.Daha sonra numuneleri fırından çıkarın ve her biri üç dakika boyunca beş kez çift damıtılmış su ile tekrar yıkayın. Bu arada, %50 reçineyi elde etmek için reçineyi %100 etanol ile bire bir oranında karıştırın. İyice karıştırın.Bunu takiben, her etanol seyreltmesinde örnekleri beş dakika susuz bırakın. Örneklerin asla tamamen kuruması gerektiğini unutmayın. Örneklere önce 30 dakika boyunca %50 reçine, bir saat boyunca %100 reçine ve sonra bir gecede tekrar %100 taze reçine ile sızın.Ertesi gün, örnekleri bir saat boyunca taze% 100 reçineye yerleştirin ve ardından floropolimer gömme levhaları arasına gömün. Etanol ile yağdan arındırılmış gömme levha parçalarını hazırlayın ve destek olarak kullanılacak cam slaytları bir kenara koyun. Bir cam kaydırağın üzerine bir parça gömme levha yerleştirin, üzerine bir damla reçine koyun, ardından örneği ahşap çubuk kullanarak dikkatlice aktarın.İkinci parçayla kapla. Hava kabarcıklarından kaçınmaya çalışın. Doku çok kırılgan olduğu için nazik olun.Gömme sac parçasının üzerine dikkatlice başka bir cam slayt yerleştirin ve numuneyi 70 santigrat derecede fırında en az 48 saat boyunca iyileştirin. Katmanları ayırın ve gömülü numunenin bir parçasını jiletle kesin. Parafin'e aktar.Bu, elektrostatik nedeniyle numuneyi kaybetme tehlikesini en aza indirecektir. Etanol ile yağdan arındırılmış bir alüminyum pim alın. İltifatlı bir epoksiyi iyice karıştırın ve numuneyi pime monte etmek için biraz kullanın.İlafatlı epoksiyi 70 santigrat derecede 10 dakika boyunca tedavi edin. Örnek bloğun her iki tarafını elmas bıçakla kesin ve doku açığa olana kadar bloğun yüzünü parlatın. İlerleyici boya kullanarak numuneyi pime topraklayıp kürle.Şarjı en aza indirmek için, numuneler ince bir altın veya altın paladyum tabakası ile kaplanmış olarak da tespit edilmelidir. Numune ile pimi seri blok bazlı tarama elektron mikroskobu haznesine yerleştirin. Örneği bıçağa hizalayın ve sonra hazneyi kapatın ve parametreleri ayarlayın.Bir yığın resim toplayın. Açıklanan yöntem kullanılarak fare beyin dokusunun görüntüleri elde edildi. Hipokampus bir bölgenin büyük görüntüsü alındı ve görüntüleme stratum radiatum merkezinde ayarlandı.Bir yığın görüntü elde edildi ve dendritik dikenler ve sinapslar gibi ilgi çekici nesneler bölümlere ayrılmıştır. İyi görünen membranlar ve sinaptik veziküller ve iyi korunmuş mitokondri ile kaliteli doku morfolojisi elde edildi. PSD 95 antikorunun immünofluoresan çalışmaları, hafif primer fiksasyon ve % 4 PFA ile geleneksel fiksasyonun karşılaştırılabilir sonuçlar verdiğini doğruladı.Sunulan protokol, seri blok bazlı taramalı elektron mikroskopisi, yüksek kaliteli doku morfolojisi ve 12 görünür membran kullanılarak beyin dokusu görüntülerinin elde edilmesine olanak tanır ve 10 doğru segmentasyon ve rekonstrüksiyonu kolaylaştırır. Birincil fiksasyonum, PSD 95 immünoforezosenscence ve elektron mikroskopi görüntüleme dendritik dikenlerinin analizi için aynı beyinleri kullanmayı mümkün kıldı. Burada PSE 9, 500 tomurcuklanma kullanıyoruz.Ancak, diğeri de kullanılabilir.

serial-block-face-scanning-electron-microscopy-sbem-for-study

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Nöronal aksonlar ve dendritler sergileyen fare kortikal beyin dokusunun sabit bir bölümünü alın. Dendritler, aksonlarla sinapslar oluşturan dendritik dikenler olarak bilinen çıkıntılara sahiptir. Dokuyu lipitlere bağlanan osmiyum-ferrosiyanür ile inkübe edin, ardından görüntüleme için yapısal kontrastı artıran başka bir osmiyum uygulaması yapın. Makromoleküllere bağlanan ve kontrastı artıran ağır bir metal bileşiği ile boyayın. Reçine gömmek için artan alkol konsantrasyonları kullanarak...

Sinaptik Bağlı Nöronların 3D Rekonstrüksiyonu için Odaklanmış İyon Işını Taramalı Elektron Mikroskobu

Kaynak: Pekarek, B. T., et. al., CLARITY Doku Temizleme ile Sağlam Nöronal Dendritlerin Görüntülenmesi ve Miktarının Belirlenmesi. J. Vis. Uzm. (2021)Bu videoda, konfokal mikroskopi ve 3D rekonstrüksiyon tekniklerini kullanarak dendritik direkleri, omurga morfolojisini ve nöronal dağılımı incelemek için temizlenmiş bir fare beyninin hazırlanmasını, görüntülenmesini ve analizini gösteriyoruz.

Temizlenmiş Bir Fare Beyninde Sağlam Dendritik Arbors ve Omurga Morfolojisinin Konfokal Mikroskopi Görüntülemesi

Kaynak: Mukherjee, K., et. al. Beyin Mitokondrilerinin Seri Blok Yüz Taramalı Elektron Mikroskobu Kullanılarak Analizi. J. Vis. Uzm.  (2016)Bu video hazırlığı göstermektedir,  Mitokondriyal üst yapıyı görselleştirmek için bir seri blok yüz taramalı elektron mikroskobu (SBFSEM) kullanarak fare beyin dokusunun görüntülenmesi ve analizi, aksonal ve dendritik nöronal bölmelerdeki morfolojilerinin ve uzamsal dağılımlarının hassas bir şekilde haritalanmasını sağlar.

 Nöronal Mitokondrinin Seri Blok Yüz Taramalı Elektron Mikroskobu Kullanılarak Görüntülenmesi

Bu makale Yapılandırılmış Aydınlatma Mikroskobu (SIM) kullanılarak in vitro hipokampalinden görüntü dendritik dikenler bir çalışma protokolünü açıklar. SIM kullanarak süper çözünürlüklü mikroskopi geliştirilmiş detaylar bireysel dendritik dikenler görüntüleme sağlayan, önemli ölçüde her üç boyutta ışık kırınım sınırı aşan görüntü çözünürlüğü sağlar.

Yapısal Aydınlatma Mikroskobu kullanılarak Rat İlköğretim hipokampalinden Dentritik Spine görüntüleme

Büyük ölçekli 2D elektron mikroskobu (EM) veya nanotomi, nano ölçekli çözünürlüklü EM'nin doku çapında uygulamasıdır. Burada, zebra balığı larva beynini sağlıkta ve non-invaziv beyin hasarı üzerine araştırmak için uygulanan nanotomi için evrensel bir yöntemi açıklıyoruz.

Sağlıklı ve Yaralı Zebra balığı Beyin büyük ölçekli Tarama Transmisyon Elektron Mikroskobu (Nanotomy)

Memeli beyin dokusundan mitokondriyal görselleştirme ve analiz zorlu bir iştir. Burada, bu kritik enerji üreten organelin morfolojik ve hacimsel analizi hakkında bilgi edinmek için seri blok yüz taramalı elektron mikroskobundan (SBFSEM) elde edilen üç boyutlu (3D) rekonstrüksiyon analizinin nasıl kullanılabileceğini açıklıyoruz.

Seri Blok-Yüz Taramalı Elektron Mikroskop Kullanarak Beyin Mitokondri Analizi

Burada, seri blok yüz ve odaklanmış iyon ışını tarama elektron mikroskobu ile ilgi alanını hedefleyen bir protokolü etkin bir şekilde birleştirmek için bir protokol sıyoruz. Bu, üç boyutlu olarak verimli arama yapılmasına ve geniş bir görüş alanında nadir olayları bulmanızı sağlar.

Seri Blok Yüz ve Odaklanmış Iyon ışını Scan Elektron Mikroskobu Kullanılarak Yapılan Hedefli Çalışmalar

Bu protokol, güçlü bir 3D görüntüleme tekniği olan seri blok yüz taramalı elektron mikroskopisini (SBF-SEM) kullanmak için rutin bir yöntemi özetlemektedir. SBF-SEM'in başarılı bir şekilde uygulanması, uygun fiksasyon ve doku boyama tekniklerinin yanı sıra görüntüleme ayarlarının dikkatli bir şekilde değerlendirilmesi üzerine kuruludur. Bu protokol, bu işlemin tamamı için pratik hususlar içerir.

Biyolojik Doku Örneklerinin Seri Blok-Yüz Tarama Elektron Mikroskopisi (SBF-SEM)

Dendritik dikenler, çoğu uyarıcı sinapsın post-sinaptik bölmeleridir. Dendritik omurga morfolojisindeki değişiklikler, nörogelişim, yaşlanma, öğrenme ve birçok nörolojik ve psikiyatrik bozukluk sırasında meydana gelir ve güvenilir dendritik omurga analizinin önemini vurgular. Bu protokol, otomatik üç boyutlu nöron rekonstrüksiyon yazılımı kullanılarak dendritik omurga morfolojisinin doğru ve tekrarlanabilir bir şekilde ölçülmesini açıklar.

Otomatik Üç Boyutlu Nöron Rekonstrüksiyon Yazılımı Kullanılarak Dendritik Omurga Ölçümü

Sunulan protokol, esas olarak sinaps sayısı ve dendritik omurga morfolojisine odaklanarak, fare namlu korteksindeki sirkadiyen değişiklikleri ölçmek için transmisyon elektron mikroskobunun (TEM) kullanımını açıklar.

Fare Namlu Koreksinde Sirkadiyen Sinaptik Plastisitenin Analizi için Görselleştirme Tekniği Olarak Transmisyon Elektron Mikroskobu

Öğrenin, SBEM ile fare hipokampusundaki dendritik dikenlerin yüksek çözünürlüklü görüntülenmesini. Bu yöntem, sinaptik plastisite ve öğrenme bellek süreçlerini anlamak için nöronal ağların bağlantısını detaylı şekilde ortaya koyar.

Dendritik Dikenlerin Çalışması için Seri Blok-Yüz Tarama Elektron Mikroskopisi (SBEM)

Daha fazla video keşfet