Dendritik Dikenlerin Çalışması için Seri Blok-Yüz Tarama Elektron Mikroskopisi (SBEM)

Murine hipokampustaki dendritik dikenleri görüntülemek ve analiz etmek için Seri Blok-Yüz Tarama Elektron Mikroskopisi (SBEM) uygulanır.

Beyindeki her nöron diğer nöron hücreleriyle yaklaşık 7.000 sinapsla bağlanır. Memeli beynindeki sinapsların esas olarak dendritik diken adı verilen zarın küçük çıkıntılarında bulunması dışında. Sinapsların ve dendritik dikenlerin ve benzeri önemli beyin fonksiyonlarının plastisitesi öğrenme ve hafıza süreçleri gibi.

Sadece elektron mikroskopisi, dendritik bir omurganın postiniptik bir girdiye sahip olup olmadığı hakkında tam bir fikir verdiğini belirtmek önemlidir. Dendritik diken görüntüleme ile ilgili çeşitli teknikler mevcuttur. Bununla birlikte, seri blok yüz taramalı elektron mikroskopisi, yüksek çözünürlüklü büyük hacimli dokuyu görüntülemesi için benzersiz bir olasılık sağlar.

Seri blok bazlı taramalı elektron mikroskopi tekniği, ağır metallerle güçlü kontrast içeren özel bir numune hazırlama protokolü gerektirir. Perfüzyon sırasındaki birincil fiksasyonum, hafifletilmiş elektron mikroskopisi için aynı beyinleri kullanmamızı sağladı. Fareler kurban edildi ve hafif bir birincil fiksatif ile perfüzyon yapıldı.

Beyin yarıya indirildi ve bir yarımküre immünofluoresansa adanmış fiksatif, kriyoprotektif ile sabitlendi, kriyostat kullanılarak dilimlendi ve immünofluoresans çalışmaları için işlendi. Diğer yarımkürenin elektron mikroskopisi fiksatifi ile sabitlendiği, vibratomla dilimlendiği ve elektron mikroskopi çalışmaları için hazırlandığı yer. Seri blok bazlı taramalı elektron mikroskopi çalışmaları için beyin dilimleri kontrast oluşturdu, reçineye düz bir şekilde gömüldü, daha sonra hipokampüsün bir CA1 bölgesi pime monte edildi ve seri blok tabanlı tarama elektron mikroskobu ile görüntülendi.

Protokolün sarı bir kutuda vurgulanan kısmı videoda yer aldı. Sabitlenmiş ve 100 mikrobiyotik dilim halinde kesilmiş dokuyu alın ve her biri üç dakika boyunca beş kez soğuk fosfat tamponu ile yıkayın. %4 osmiyum tetroksit ve %3 potasyum ferrosiyanid karışımı hazırlayın.

Son ürün kahverengiye dönecektir. Örnekleri bu karışıma daldırin. Sonra örnekleri buza yerleştirin.

Ve bu aşamadan itibaren onları ışıktan korumak önemlidir. Onları bir saat boyunca hafifçe sallayarak kuluçkaya yatırın. Bu arada, TCH çözümünü hazırlayın.

10 mililitre çift damıtılmış su ve 0,1 gram TCH karıştırın. Bir saat boyunca 60 Santigrat derece fırından fırına yerleştirin. Çözeltiyi zaman zaman swill önemlidir.

Hazır olduğunuzda oda sıcaklığına soğutun. Şimdi numuneleri her biri üç dakika boyunca beş kez çift damıtılmış suyla yıkayın ve ardından filtrelenmiş TCH çözeltisine daldırin. Dilimler siyaha dönecek.

Oda sıcaklığında 20 dakika kuluçkaya yatır. Numuneleri her biri üç dakika boyunca beş kez çift damıtılmış suyla yıkayın ve bu kez oda sıcaklığında 30 dakika boyunca% 2 osmiyum tetroksit ile kuluçkaya yatırın. Yine, numuneleri her biri üç dakika boyunca beş kez çift damıtılmış su ile yıkayın ve filtrelenmiş% 1 veya amil asetat içine yerleştirin.

Onları bir gecede 4 santigrat derecede kuluçkaya yatır. Ertesi gün, D-aspartat hazırlığı ile başlayın. Kurşun nitratı 60 santigrat dereceye kadar önceden ısıtılmış aspartik asit çözeltisi ile karıştırın.

Karışımı 60 santigrat dereceye ayarlanmış bir su banyosuna yerleştirin ve pH'ı bir azı dişi sodyum hidroksit ile 5,5'e ayarlayın. Şişeyi kurşun aspartat ile kapatın ve 60 santigrat derecede 30 dakika bekletin. Çözüm açık olmalı.

Bulutlu hale gelirse atılmalıdır ve yeni bir tane hazırlanmalıdır. Bu arada, numuneleri gazlı çift damıtılmış su ile beş kez üç dakika yıkayın ve 60 santigrat derecede fırında 30 dakika tutun. Numuneleri taze hazırlanmış kurşun aspartat çözeltisine daldırin ve 20 dakika boyunca 60 santigrat derece olarak ayarlanmış fırında kuluçkaya yatırın.

Epoksi reçinesi hazırlayın. Malzemeleri tartın ve hızlandırıcı DMP 30 eklemeden önce reçineyi en az 30 dakika iyice karıştırın. Etanol dereceli seyreltme ile virüs hazırlayın.

Daha sonra numuneleri fırından çıkarın ve her biri üç dakika boyunca beş kez çift damıtılmış su ile tekrar yıkayın. Bu arada, %50 reçineyi elde etmek için reçineyi %100 etanol ile bire bir oranında karıştırın. İyice karıştırın.

Bunu takiben, her etanol seyreltmesinde örnekleri beş dakika susuz bırakın. Örneklerin asla tamamen kuruması gerektiğini unutmayın. Örneklere önce 30 dakika boyunca %50 reçine, bir saat boyunca %100 reçine ve sonra bir gecede tekrar %100 taze reçine ile sızın.

Ertesi gün, örnekleri bir saat boyunca taze% 100 reçineye yerleştirin ve ardından floropolimer gömme levhaları arasına gömün. Etanol ile yağdan arındırılmış gömme levha parçalarını hazırlayın ve destek olarak kullanılacak cam slaytları bir kenara koyun. Bir cam kaydırağın üzerine bir parça gömme levha yerleştirin, üzerine bir damla reçine koyun, ardından örneği ahşap çubuk kullanarak dikkatlice aktarın.

İkinci parçayla kapla. Hava kabarcıklarından kaçınmaya çalışın. Doku çok kırılgan olduğu için nazik olun.

Gömme sac parçasının üzerine dikkatlice başka bir cam slayt yerleştirin ve numuneyi 70 santigrat derecede fırında en az 48 saat boyunca iyileştirin. Katmanları ayırın ve gömülü numunenin bir parçasını jiletle kesin. Parafin'e aktar.

Bu, elektrostatik nedeniyle numuneyi kaybetme tehlikesini en aza indirecektir. Etanol ile yağdan arındırılmış bir alüminyum pim alın. İltifatlı bir epoksiyi iyice karıştırın ve numuneyi pime monte etmek için biraz kullanın.

İlafatlı epoksiyi 70 santigrat derecede 10 dakika boyunca tedavi edin. Örnek bloğun her iki tarafını elmas bıçakla kesin ve doku açığa olana kadar bloğun yüzünü parlatın. İlerleyici boya kullanarak numuneyi pime topraklayıp kürle.

Şarjı en aza indirmek için, numuneler ince bir altın veya altın paladyum tabakası ile kaplanmış olarak da tespit edilmelidir. Numune ile pimi seri blok bazlı tarama elektron mikroskobu haznesine yerleştirin. Örneği bıçağa hizalayın ve sonra hazneyi kapatın ve parametreleri ayarlayın.

Bir yığın resim toplayın. Açıklanan yöntem kullanılarak fare beyin dokusunun görüntüleri elde edildi. Hipokampus bir bölgenin büyük görüntüsü alındı ve görüntüleme stratum radiatum merkezinde ayarlandı.

Bir yığın görüntü elde edildi ve dendritik dikenler ve sinapslar gibi ilgi çekici nesneler bölümlere ayrılmıştır. İyi görünen membranlar ve sinaptik veziküller ve iyi korunmuş mitokondri ile kaliteli doku morfolojisi elde edildi. PSD 95 antikorunun immünofluoresan çalışmaları, hafif primer fiksasyon ve % 4 PFA ile geleneksel fiksasyonun karşılaştırılabilir sonuçlar verdiğini doğruladı.

Sunulan protokol, seri blok bazlı taramalı elektron mikroskopisi, yüksek kaliteli doku morfolojisi ve 12 görünür membran kullanılarak beyin dokusu görüntülerinin elde edilmesine olanak tanır ve 10 doğru segmentasyon ve rekonstrüksiyonu kolaylaştırır. Birincil fiksasyonum, PSD 95 immünoforezosenscence ve elektron mikroskopi görüntüleme dendritik dikenlerinin analizi için aynı beyinleri kullanmayı mümkün kıldı. Burada PSE 9, 500 tomurcuklanma kullanıyoruz.

Ancak, diğeri de kullanılabilir.