Kuantum Nokta Nanopartiküller kullanma Korelatif Işık- ve Elektron Mikroskobu

Bu yöntemin genel amacı, floresan immünositokimyasal bilgileri transmisyon elektron mikroskobundan elde edilen ultra yapısal morfoloji ile tek bir görüntüde birleştirerek bağıntılı ışık ve elektron mikroskobu veya CLEM verileri elde etmektir. Bu yöntem, immünositokimya ve patoloji alanında, hangi alt hücresel yapının belirli bir proteinle ilişkili olduğu gibi temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin ana avantajı, hem hedef proteinden canlı mikroskopi sinyalini hem de elektron mikroskobu yapısal lokalizasyonunu elde etmek için aynı kuantum nokta nanoparçacık probunu kullanmasıdır.

İnsan somatostatinoma tümör dokusunu metin protokolüne göre sabitleyip, gömdükten ve kesitlere ayırdıktan sonra, 2.0 mililitre aseton içeren beş mililitrelik bir şişeye 20 santimetre şeffaf yapışkan bant yerleştirerek bir kesit yapıştırıcı solüsyon hazırlayın ve 10 dakika bekletin. Bandı çıkarın ve bir nikel ızgarayı çözeltiye batırın, ardından ızgarayı çıkarın ve kurumaya bırakın. Kuruduktan sonra, ultra ince bir bölüm almak için ızgaranın donuk tarafını kullanın.

Seçilen reçine formülasyonu için doğru aşındırma süresini belirlemek çok önemlidir. Bu formülasyon için 30 dakika iyi çalışır, ancak daha sert veya daha yumuşak formülasyonlar için yeniden hesaplanması gerekebilir. Damıtılmış suda bir mililitre taze doymuş sodyum metaperiodat aşındırma çözeltisi hazırlayın ve çözelti damlacıklarını temiz bir laboratuvar filmi yüzeyine yerleştirin.

Damlacıkların üzerine bölümler halinde tamamen kuru ızgaralar yerleştirin ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. Ardından, ızgaraları yıkamak için 60 saniye boyunca damıtılmış su damlacıklarına aktarın. Temiz bir laboratuvar filmi yüzeyinde antikor ve kuantum noktası veya QD etiketleme yapmak için 0,05 molar glisen ve PBS pipet damlaları.

Izgaraları damlacıkların üzerine yerleştirin ve bölümlerdeki kalıntı aldehiti bloke etmek için 10 dakika inkübe edin. Aldehit bloğunu çıkarmak için ızgaranın kenarını kısaca kurulayın. Daha sonra ızgarayı 10 dakika boyunca PBS'de yüzde bir normal keçi serumu veya NGS ve yüzde bir BSAC damlası üzerine yerleştirin.

890 mikrolitre PBS'ye 10 mikrolitre NGS ve 100 mikrolitre BSAC ekleyerek bir mililitre engelleme çözeltisi hazırlayın. Ardından, bölümleri 10 dakika boyunca bir antikor seyreltici damlası üzerine yerleştirerek koşullandırın. Daha sonra, anti-somatostatin poliklonal antikoru bir ila 10 seyreltmek için antikor seyreltici kullanın ve ızgaraları çözeltinin damlacıkları üzerine yerleştirin.

Oda sıcaklığında nemli bir odada bir saat inkübe edin. İnkübasyonun ardından, ızgaranın kenarını lekeleyerek antikor reaktifini çıkarın. Ardından, bölümleri her biri beş dakika boyunca iki kez yıkamak için antikor seyreltici kullanın.

İkincil antikoru bir ila 10 oranında seyrelttikten ve damlaları hazırladıktan sonra, damlacıklar üzerindeki ızgaraları oda sıcaklığında bir saat inkübe edin. Ardından, antikor solüsyonunu çıkarın ve bölümleri iki kez yıkayın. Streptavidin konjuge QD'leri bir ila 10 oranında seyreltin ve numuneleri karanlıkta, oda sıcaklığında bir saat boyunca çözeltinin damlaları üzerinde inkübe edin.

Ardından, ızgaraları her seferinde beş dakika boyunca iki kez yıkamak için antikor seyreltici kullanın ve ızgaraların kenarlarını kurulayın. Daha sonra, kenarları kurutmadan önce ızgaraları iki dakika damıtılmış suda yıkayın. İmmün lekeli ızgara bölümünü bir cam slayt üzerindeki bir su damlasına yerleştirin ve üzerini örtmek için bir cam kapak fişi kullanın.

Floresan ışık mikroskobu yapmak için, aşağıdaki özelliklere sahip bir filtre küpü yerleştirin ve 365 nanometre LED aydınlatma kullanın. İmmün boyalı bölümü immünofloresan mikroskobu aşamasına yerleştirin. Etiketleme modelini, spesifik olmayan etiketlemenin seviyesini değerlendirmek ve negatif kontrollerin açık olduğunu belirlemek için ışık mikroskobu kullanın.

Ardından, ızgara çubuklarıyla ilgili yatırım getirilerini belirleyin. Ardından tam renkli bir dijital kamerayı FL otomatik renge ayarlayın ve beyaz dengesini 3, 200 K olarak ayarlayın.Görüntülerin görünümünü optimize etmek için kamerayı 0,45 ile 1,00 arasında bir gama ayarıyla otomatik pozlama moduna ayarlayın ve analog kazanç bir X olarak ayarlayın. Ardından görüntüye odaklanın ve görüntüyü çerçeve deposuna yakalamak için ZEN Two Light yazılımı grafik arayüzünde Tuttur'a tıklayın.

Sıkıştırma ve pikselleşmeyi önlemek için görüntüleri tf dosyaları olarak kaydedin. ROI'nin ızgara çubuklarına veya diğer önemli doku yer işaretlerine göre konumunu gösteren bir baskı hazırlayın. Ardından ızgarayı slayttan çıkarın, damıtılmış suyla yıkayın ve kenarları nazikçe kurulayın.

Transmisyon elektron mikroskobunu gerçekleştirmek için, 100 kilovoltluk bir hızlanma voltajı kullanarak ızgarayı inceleme için mikroskoba aktarın. Izgarada gezinmek için yaklaşık 1.400X'lik düşük büyütme ile başlayın ve ışık mikroskobu ile bulunanlarla ROI'leri bulun. Tek tek QD'leri 70.000X veya daha yüksek büyütmede gözlemleyin.

Orta derecede elektron yoğunluğuna sahip düzensiz kristal yapılar olarak görüneceklerdir. Ardından, görüntüleme yazılımının grafik arayüzünde tek renkli 1.392 x 1.040 piksel sensörlü bir dijital kamera kullanarak, görüntüleri açmak ve almak için kamera simgesine tıklayın. Görüntüyü çerçeve deposunda saklamak için kamera simgesini kapalı konuma getirin.

CLEM görüntülemeyi gerçekleştirmek için, TEM'e göre karşılık gelen ROI'leri bulmak için ışık mikroskobu görüntülemeden bir baskı kullanın. Doku mimari özellikleri, kesit etrafında gezinmek için kullanışlıdır. TEM ile ilgili yatırım getirisinin bir görüntüsünü yakalayın.

Ardından, bir CLEM görüntüsü hazırlamak için, TEM görüntüsünün doğru yönlendirildiğinden ve ışık mikroskobu görüntüsüyle aynı boyut ve çözünürlüğe, bu durumda inç başına 300 piksele büyütüldüğünden emin olun. Işık mikroskobu görüntü tuvalinin boyutunu, boyutunu iki katına çıkarmak için genişletin. Ardından TEM görüntüsünü kopyalayıp floresan görüntüsünün yanına yapıştırın.

Photoshop CS2'de bir floresan kaplama oluşturmak için dikdörtgen seçim çerçevesi aracına tıklayın, floresan görüntüyü seçin ve bundan bir kopya katman oluşturun. Katman stili karıştırma seçeneklerini %30 - %40 saydamlık olarak ayarlayın. Ardından taşıma aracına tıklayın ve floresan kaplama katmanını ilgili TEM görüntüsünün üzerine sürükleyin ve görüntüleri hizalayın.

Görüntüleri hizaladıktan sonra, son kaplamayı oluşturmak için görüntüyü düzleştirin. Ardından, yeni kaplama görüntüsünü seçmek ve yeni bir tuvale kopyalamak için dikdörtgen seçim çerçevesi aracını kullanın. Son olarak, görüntüyü bir tf dosyası olarak kaydedin.

Bu floresan mikroskobu görüntüsünde, bireysel somatostatinoma tümör hücreleri bol miktarda salgı granülleri içerir ve somatostatin hormonu için pozitif olarak etiketlenmiştir. Çekirdekler karanlık delikler olarak ortaya çıktı ve düşük büyütmede, sitoplazmada değişken yoğunlukta granüler turuncu QD floresansı görüldü. Işık mikroskobu ile seçilen ROI, burada belirtildiği gibi bir 20X ışık mikroskobu görüntüsüne atıfta bulunularak TEM kullanılarak tanındı ve görüntülendi.

Daha yüksek büyütmede, hücre sitoplazmik granüllerde parlak floresan ve yoğun QD etiketlemesi gösterir. Bu örnekte olduğu gibi floresan verilerinin TEM görüntüleri üzerine bindirilmesi, güçlü pozitif etiketlemenin, vezikül sınırlayıcı zarı içinde orta derecede elektron yoğun malzeme içeren granüllere karşılık geldiğini düşündürür. Son olarak, burada daha yüksek büyütmede görüldüğü gibi, orta derecede elektron yoğun granüller yoğun QD nanokristal immüno-etiketleme gösterdi.

Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde yapılırsa sekiz saat içinde yapılabilir. Prosedürü denerken, ızgaraları yalnızca kenarlarından dikkatli bir şekilde tutmayı unutmamak önemlidir. Izgarayı alırken bölüme dokunmak, bölümü ızgaradan ayırabilir.

Bu prosedürü takiben, ilgilendiğiniz proteinin başka bir proteinle birlikte lokalize olup olmadığı gibi ek soruları yanıtlamak için multipleks immünoetiketleme gibi diğer yöntemler de gerçekleştirilebilir. Geliştirilmesinden sonra, bu teknik, patoloji alanındaki araştırmacıların elektron mikroskobu için arşiv insan dokusu sürecinde protein lokalizasyonunu keşfetmelerinin yolunu açtı. Bu videoyu izledikten sonra, floresan ışık mikroskobundan elde edilen immünositokimyasal bilgilerin transmisyon elektron mikroskobundan elde edilen ultra yapı ile nasıl birleştirileceğini iyi anlamış olmalısınız.

Osmiyum tetroksit ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedür uygulanırken koruyucu ekipman giymek, çeker ocakta çalışmak ve uygun atık bertarafı gibi önlemler alınması gerektiğini unutmayın.