Kuantum Nokta Nanopartiküller kullanma Korelatif Işık- ve Elektron Mikroskobu

Bu yöntemin genel amacı, floresan immünositokimyasal bilgileri ile transmisyon elektron mikroskobundan elde edilen ultra-yapısal morfolojiyi tek bir görüntüde birleştirerek korelatif ışık ve elektron mikroskobisi (CLEM) verileri elde etmektir. Bu yöntem, immünositokimya ve patoloji alanındaki, örneğin ilgilenilen belirli bir proteinin hangi hücre altı yapı ile ilişkili olduğu gibi temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, hedef proteinden gelen canlı mikroskopi sinyalini ve elektron mikroskobu yapısal lokalizasyonunu elde etmek için aynı kuantum nokta nanoparçacık probunu kullanmasıdır.

Metin protokolüne uygun olarak insan somatostatinoma tümör dokusunu fiksasyon, gömme ve kesit alma işlemlerinden geçirdikten sonra, 2,0 mL aseton içeren beş mililitrelik bir şişeye 20 santimetre şeffaf yapışkan bant yerleştirerek bir kesit yapıştırıcı çözeltisi hazırlayın ve 10 dakika bekletin. Bandı çıkarın ve bir nikel ızgarayı çözeltiye daldırın, ardından ızgarayı çıkarıp havada kurumaya bırakın. Kuruduğunda, ultra ince bir kesiti almak için ızgaranın körelmiş tarafını kullanın.

Seçilen reçine formülasyonu için doğru aşındırma süresini belirlemek kritik önem taşır. Bu formülasyon için 30 dakika etkili sonuçlar vermektedir, ancak daha sert veya daha yumuşak formülasyonlar için bu sürenin yeniden hesaplanması gerekebilir. Distile su içerisinde bir mililitre taze doygun sodyum metaperiyodat aşındırma çözeltisi hazırlayın ve çözeltiden damlaları temiz bir laboratuvar filmi yüzeyine yerleştirin.

Kesitlerin bulunduğu tamamen kuru ızgaraları damlacıkların üzerine yerleştirin ve oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inkübe edin. Ardından, yıkamak için ızgaraları 60 saniye boyunca distile su damlacıklarına aktarın. Temiz bir laboratuvar filmi yüzeyinde antikor ve kuantum nokta (QD) etiketlemesi yapmak için, 0,05 molar glisin ve PBS damlatın.

Kesitlerdeki kalıntı aldehitleri bloke etmek için ızgaraları damlacıkların üzerine yerleştirin ve 10 dakika boyunca inkübe edin. Aldehit bloğunu uzaklaştırmak için ızgaranın kenarını kısaca kurulayın. Ardından ızgarayı, %1 normal keçi serumu (NGS) ve PBS içinde %1 BSAC içeren bir damlacığın üzerine yerleştirerek 10 dakika bekletin.

890 µL PBS'ye 10 µL NGS ve 100 µL BSAC ekleyerek bir mililitre bloklama solüsyonu hazırlayın. Ardından, kesitleri 10 dakika boyunca bir damla antikor dilüent üzerine yerleştirerek koşullandırın. Sonra, anti-somatostatin poliklonal antikoru antikor dilüent ile 1/10 oranında seyreltin ve gridleri solüsyon damlacıkları üzerine yerleştirin.

Sıcaklıkta bir saat boyunca nemli bir oda içerisinde inkübe edin. İnkübasyonun ardından, ızgaranın kenarını tamponlayarak antikor reaktifini uzaklaştırın. Ardından, kesitleri beşer dakikalık iki yıkama işlemi için antikor dilüenti kullanın.

Sekonder antikoru 1:10 oranında seyreltip damlalar hazırladıktan sonra, gridleri damlacıklar üzerinde oda sıcaklığında bir saat boyunca inkübe edin. Ardından, antikor çözeltisini uzaklaştırın ve kesitleri iki kez yıkayın. Streptavidin konjuge QD'leri 1:10 oranında seyreltin ve numuneleri çözelti damlaları üzerinde, karanlıkta, oda sıcaklığında bir saat boyunca inkübe edin.

Ardından, gridleri her seferinde beş dakika boyunca iki kez antikor dilüenti ile yıkayın ve gridlerin kenarlarını kurulayın. Sonra, kenarları kurulayıp temizlemeden önce gridleri iki dakika boyunca distile su ile yıkayın. İmmün boyanmış grid kesitini bir lam üzerindeki bir damla suyun içine yerleştirin ve üzerini kapatmak için bir lameli kullanın.

Floresan ışık mikroskopisi gerçekleştirmek için, aşağıdaki özelliklere sahip bir filtre kübü yerleştirin ve 365 nanometre LED aydınlatma kullanın. İmmün boyanmış kesiti immünofloresan mikroskop tablasına yerleştirin. Boyama modelini, herhangi bir spesifik olmayan boyama düzeyini değerlendirmek ve negatif kontrollerin temiz olduğunu doğrulamak için ışık mikroskopisi kullanın.

Ardından, ızgara çubuklarıyla ilişkili olarak ilgilenilen bölgeleri (ROI) belirleyin. Daha sonra, tam renkli bir dijital kamerayı FL otomatik renge ayarlayın ve beyaz dengesini 3.200 K olarak belirleyin. Görüntülerin görünümünü optimize etmek için kamerayı, gama ayarı 0,45 ile 1,00 arasında olacak şekilde otomatik pozlama moduna getirin ve analog kazancı 1X olarak ayarlayın. Canlı görüntüleme için ZEN Two Light yazılımı grafik arayüzündeki kamera simgesine tıklayın. Ardından görüntüye odaklanın ve görüntüyü kare deposuna kaydetmek için ZEN Two Light yazılımı grafik arayüzündeki Snap düğmesine tıklayın.

Sıkıştırmayı ve piksellenmeyi önlemek için görüntüleri tf dosyaları olarak kaydedin. ROI'nin ızgara çubuklarına veya diğer önemli doku işaretlerine göre konumunu gösteren bir baskı hazırlayın. Ardından ızgarayı lamdan çıkarın, distile su ile yıkayın ve kenarları nazikçe kurulayın.

Geçirimli elektron mikroskobisi gerçekleştirmek için, gridi 100 kilovolt hızlandırma voltajı kullanarak inceleme amacıyla mikroskoba aktarın. Grid üzerinde gezinmek ve ışık mikroskobisiyle belirlenen ilgi bölgelerini (ROI) bulmak için yaklaşık 1.400X düşük büyütme ile başlayın. Münferit QD'leri 70.000X veya daha yüksek büyütmede gözlemleyin.

Bunlar, orta düzeyde elektron yoğunluğuna sahip düzensiz kristal yapılar olarak görünecektir. Ardından, görüntüleme yazılımının grafik arayüzündeki monokrom 1.392'ye 1.040 piksellik sensöre sahip bir dijital kamera kullanarak, görüntüleri elde etmek için kamera simgesine tıklayarak açın. Görüntüyü kare depolama alanına kaydetmek için kamera simgesini kapalı konumuna getirin.

CLEM görüntülemesini gerçekleştirmek için, TEM ile karşılık gelen ROI'leri belirlemek amacıyla ışık mikroskobu görüntüsünün bir çıktısını kullanın. Doku mimari özellikleri, kesit üzerinde yön bulmak için kullanışlıdır. TEM ile karşılık gelen ROI'nin görüntüsünü yakalayın.

Ardından, bir CLEM görüntüsü hazırlamak için TEM görüntüsünün doğru yönlendirildiğinden ve ışık mikroskobu görüntüsüyle aynı boyuta ve çözünürlüğe, bu durumda inç başına 300 piksel olacak şekilde büyütüldüğünden emin olun. Işık mikroskobu görüntüsü kanvasının boyutunu iki katına çıkarın. Daha sonra TEM görüntüsünü floresan görüntüsünün yanına kopyalayıp yapıştırın.

Photoshop CS2'de bir floresan üst üste bindirme (overlay) oluşturmak için dikdörtgen seçim aracına (rectangular marquee tool) tıklayın, floresan görüntüsünü seçin ve bundan yinelenen bir katman oluşturun. Katman stili karıştırma seçeneklerini (blending options) %30 ila %40 şeffaflığa ayarlayın. Ardından taşıma aracına (move tool) tıklayıp floresan üst üste bindirme katmanını ilgili TEM görüntüsünün üzerine sürükleyin ve görüntüleri hizalayın.

Görüntüleri hizaladıktan sonra, nihai üst üste bindirmeyi oluşturmak için görüntüyü düzleştirin. Ardından, yeni üst üste bindirme görüntüsünü seçmek için dikdörtgen seçim aracını kullanın ve görüntüyü yeni bir tuvale kopyalayın. Son olarak, görüntüyü tf dosyası olarak kaydedin.

Bu floresan mikroskopi görüntüsünde, tekil somatostatinoma tümör hücreleri bol miktarda sekretuar granül içermektedir ve somatostatin hormonu için pozitif olarak etiketlenmiştir. Çekirdekler koyu delikler şeklinde görünmektedir ve düşük büyütmede, sitoplazmada değişken yoğunlukta granüler turuncu QD floresansı görülmüştür. Işık mikroskobu ile seçilen ROI, burada belirtildiği gibi 20X ışık mikroskobu görüntüsüne başvurularak TEM kullanılarak tanımlanmış ve görüntülenmiştir.

Daha yüksek büyütmede, hücre sitoplazmik granüllerde parlak floresans ve yoğun QD etiketlemesi göstermektedir. Bu örnekte olduğu gibi, floresans verilerinin TEM görüntülerinin üzerine bindirilmesi, güçlü pozitif etiketlemenin vezikül sınırlayıcı membranı içindeki orta derecede elektron yoğunluğundaki materyali içeren granüllere karşılık geldiğini göstermektedir. Son olarak, burada daha yüksek büyütmede görüldüğü üzere, orta derecede elektron yoğunluğundaki granüller yoğun QD nanokristal immünolabeling göstermiştir.

Bu teknik uzmanlaşıldığında, doğru şekilde uygulandığı takdirde sekiz saat içinde tamamlanabilir. Prosedür uygulanırken, ızgaraların yalnızca kenarlarından tutularak dikkatli bir şekilde taşınması gerektiğini hatırlamak önemlidir. Izgara alınırken kesite dokunulması, kesitin ızgaradan ayrılmasına neden olabilir.

Bu prosedürün ardından, ilgilendiğiniz proteinin başka bir proteinle aynı bölgede konumlanıp konumlanmadığı gibi ek soruları yanıtlamak için multipleks immünlekeleme gibi diğer yöntemler uygulanabilir. Bu teknik geliştirildikten sonra, patoloji alanındaki araştırmacıların arşivlenmiş insan doku örneklerindeki protein lokalizasyonunu elektron mikroskobu ile incelemelerinin önünü açmıştır. Bu videoyu izledikten sonra, floresan ışık mikroskobundan elde edilen immünositokimyasal bilgilerin, transmisyon elektron mikroskobundan elde edilen ultrastrüktür ile nasıl birleştirileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

Osmiyum tetroksit ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini unutmayın; bu prosedürü gerçekleştirirken koruyucu ekipman kullanımı, çeker ocakta çalışma ve uygun atık imhası gibi önlemler alınmalıdır.