En yüz Yüksek Boyutlu Mekansal Moleküler Analiz için Fare Retinasının Kriyoseksiyonu

Retina, nöronal hesaplamaları anlamak için yararlı bir modeldir. Bu hesaplamalar, hücrelerin özel konumlarına bağlıdır. Bununla birlikte, bunun kapsamlı haritaları belirsiz kalmıştır.

Son on yılda, tek hücre dizilimi, retinal hücre tiplerinin net tanımlarını sağladı. Şimdi, uzamsal transkriptomik, bu açıklamaları sağlam dokuda kullanmak için yeni bir yol sağlıyor. Mekansal transkriptomikleri kullanmak için kritik bir zorluk, çok ince doku kesitleri gerektirmeleridir. Retina, ilgilendiğimiz yatay düzlemde zaten oldukça incedir.

İnce ve hızlı kesitler oluşturmak için bu yöntemi icat ederek, aynı dokudaki tüm retinal ganglion hücrelerini haritalamak için makine öğreniminde uzamsal transkriptomikleri kullanmak. Son 30 yılda, 45 farenin retinal ganglion hücrelerinden sadece 17'si haritalandı ve bu teknik hepsini bir kerede haritalamamızı sağladı.

[Öğretim Görevlisi] Başlamak için, çalışma masasına ötenazi yapılmış bir fare yerleştirin. Oryantasyonu korumak ve diseksiyon için zayıf bir nokta oluşturmak için dünyanın temporal kutbunu kornea üzerinde çalıştırın. Küreyi batırın ve çözeltiyi bir parça filtre kağıdı içeren bir tabağa hedefleyin. Keskin beş numaralı forseps ve İris makası ile sklerayı delmeden tüm kas sistemini, fasyayı, damar sistemini ve sinirleri dünyadan dikkatlice çıkarın. Bir Iris makas bıçağının ucunu kornea markasına dik olarak yerleştirin. Bu konumda dünyayı delin. Kornea ve limbus boyunca tek bir temiz kesi yapın, sklera ve retinaya optik sinir kafasına doğru devam edin. Ardından bıçağı ilk kesime dik olarak, limbusun yaklaşık bir milimetre arkasına yerleştirin. Sklera ve retinayı radyal olarak kesmeye başlayın. Küreyi yönlendirmek ve döndürmek için keskin forsepsler kullanarak limbusun arkasında ve paralelinde tutarlı bir kesme çizgisi koruyun. Retina ve sklera ayrılırsa, İris makas bıçağını birlikte kesmek için yeniden konumlandırın. İris makas bıçağının orta genişliğini kullanarak bir milimetre arka mesafeyi tahmin edin Limbusa paralel radyal kesimi tamamladıktan sonra, kalan retina bağlantılarını kontrol edin. Ön ve arka küre bölümleri ayrılana kadar bunları İris makasıyla dikkatlice kesin. Daha sonra, dünyanın ön ve arka kısımlarını nazikçe ayırmak için iki çift keskin beş numaralı forseps kullanın. Daha yaşlı farelerde, şeffaf lifler lensi retina kabına bağlarsa, retinal skleral ayrılmayı en aza indirirken bunları İris makasıyla dikkatlice kesin. Filtre kağıdını bir destek platformu olarak kullanarak, retinayı İris makasıyla demir haç deseni olarak da adlandırılan bir yonca yaprağı şeklinde kesin. Diseksiyonu ikinci gözle tekrarlayın. Diseke retina ve skleradan daha büyük bir açıklık oluşturmak için tek kullanımlık bir plastik transfer pipetinin ucunu kesin. Retinayı pipete yavaşça emdirin ve bir cam mikroskop lamı üzerine koyun. Bir laboratuvar mendili ile, retina artık yüzmeyene ve düzleşebilmeye kadar fazla aim solüsyonunu çıkarın. Şimdi retinayı açmak için iki keskin beş numaralı forseps kullanın ve iç göz kabı yukarı bakacak şekilde düz bir şekilde konumlandırın. Düzleştirmeye yardımcı olmak için her yonca kabartma segmentinde 0,5 ila iki milimetre uzunluğunda kabartma kesimler yapın ve katlanmayı önlemek için ayarlayın. Retinaya bitişik sıvı dışında kalan tüm hedef solüsyonu çıkarın. Bir kapak kayması kullanarak, retinayı hızlı bir şekilde bastırın ve aktarın, böylece dış sklera yukarı bakar ve iç göz kabı kapak kayması ile temas eder. Retinanın katlanmadığını doğrulayın ve gerekirse ayarlamalar yapın. Manipülasyona yardımcı olmak için nişan alma solüsyonu ekleyin, ancak kıvrılmayı önlemek ve beş ila 10 saniye havayla kurumaya izin vermek için fazlalığı bir mendille alın. Şimdi retinayı kaplamak için OCT besiyeri uygulayın. Ardından, yüzdürmeyi önlemek için katmanı kapak kayma boyunca eşit şekilde yaymak için forseps kullanın. Sıvı nitrojen buharı ile soğutulmuş metal bir plaka kullanarak veya doğrudan kuru buzla temas ederek retinayı OCT ortamında hızlı dondurun. Donmuş retinayı hemen kullanım için kuru buz üzerinde saklayın. Kriyoseksiyon için, aynı kriyostat modeli kullanılıyorsa, numune aynası üzerinde, iç iki ila üç halkayı işgal eden bir OCT kubbesi oluşturun. Numune aynasını kesme yüzeyine düz bir şekilde hizalayın. Mandren'i kriyostat aşamasıyla ilişkilendiren yönlendirme kılavuzunu oluşturun veya not edin. Ardından, bıçağa paralel düz bir yüzey oluşturmak için kubbeyi kesin. Bir tıraş bıçağı ile fazla OCT'yi yanal olarak çıkarın ve retinayı hareketli hale getirmek için kapak kaymasından dikkatlice ayırın. Mandreni sahneden çıkarın ve hazırlanan düz OCT yüzeyine küçük bir damla sıvı OCT uygulayın. Ardından, retinayı doğrudan sıvı OCT üzerine yerleştirin. Donana kadar retinayı basılı tutmak için önceden soğutulmuş bir cam slayt kullanın. Yapışmayı sağlamak için retina ve ayna üzerine daha fazla OCT uygulayın. Ardından düzeneği kriyostat hızlı dondurma alanında dondurun. Kesit için, retina görünene kadar fazla OCT'yi dikkatlice kesin. Retinaya yakın OCT blok kenarlarını şekillendirmek için bir tıraş bıçağı kullanın. Sklera varlığını kontrol ederken kesmeye devam edin. Sklera görünür olduğunda, sahne açısını gerektiği gibi ayarlayın. Sklera bölümler arasında yaklaşık olarak eşit bir şekilde dağıldığında kesmeyi bırakın. Şimdi, bölümleri değiştirmek ve toplamak için önceden soğutulmuş slaytlar ve iki boya fırçası kullanın. OCT eriyene ve dokuyu slayta yapışana kadar yaklaşık beş saniye boyunca bölümün altına bir parmak yerleştirin. Ardından slaydı yeniden dondurmak için soğuk bir yüzeye geri koyun. Hazırlanan slaytları hemen kullanım için kuru buz üzerinde saklayın. Ganglion hücre tabakasında belirgin İmmünoreaktivite veya RBPMS ve domates lektini ile işaretlenmiş vasküler pleksilerin net bir şekilde ayrılması, retinal laminasyon ve protein belirteçlerinin başarılı bir şekilde korunduğunu doğruladı. 12 pleks RNA Kapsam paneli kullanılarak yapılan multipleks RNA tespiti, uzamsal yapıyı başarıyla korudu ve yüz dilimi boyunca Grm6 ve RBPMS gibi belirteçlerin farklı ekspresyonunu ortaya çıkardı. Yüksek çözünürlüklü görüntüler, RBPMS ve Mafb6 ve Meis2 gibi diğer belirteçler için tek hücre ekspresyon modellerini doğruladı ve ganglion hücre tabakasında hem protein hem de RNA lokalizasyonunu doğruladı. Yonca yaprağı bölümleri boyunca tek tip sinyal dağılımı ve ksenyum uzamsal transkriptomik verilerdeki güçlü sinyaller, başarılı yüksek verimli profil oluşturmayı ve RNA bütünlüğünü doğruladı. Xenium ile eşleşen manuel algılama modellerini kullanan tek hücre çözünürlüğü görselleştirmesi, protokolün platformlar arasında sağlamlığını doğrular. Hücre tipine özgü transkript belirteçleri, retina kesitinde ve yüz haritalamasında tabakalı laminer dağılım gösterdi ve derinlikler boyunca konumlarını korudu. Ganglion hücre katmanına yapılan ayrıntılı yakınlaştırma, DAPI nükleer boyamaya göre doğru uzamsal transkript tespitini doğruladı.