Immünhistokimya için fare retinal Cryo-bölümler hazırlanması

Fare retinal diseksiyonu, gözlerin büyüklüğü ve şekli ve retina bölümünün kırılganlığı nedeniyle gerçekten hassas bir süreçtir. Uygulama zorunluluğu, verimli yöntem ve ipuçları sağlayan ayrıntılı bir protokole sahip yüksek kaliteli retinadisemi ve kesitanahtarıdır. Araştırmacının ortak tuzaklardan kaçınmasına ve immünohistokimyaya uygun yüksek kaliteli retina kesitleri elde etmelerine yardımcı olacak ipuçları ve öneriler sayılmaktayız.

Çok hafifçe kornea dokunarak bir kuyruk küretterizer kullanarak bir ötenazi farenin gözünün zamansal kısmını işaretleyin ve korneayı hafifçe yakmak ve delik açmaktan kaçınmak için bir saniyeden fazla bir süre için. Bundan hemen sonra fare gözleri enucleate kavisli Dumont 545 forceps kullanılır. Gözleri 1,5 mililitrelik kriyotube'a yerleştirin ve %4'lük bir mililitre PFA ve PBS ile 15 dakika boyunca buzüzerinde kuluçkaya yatırın.

Daha sonra, kavisli Dumont 545 çömleci kullanarak sabit gözleri PBS ile doldurulmuş modifiye edilmiş 35 milimetrelik bir diseksiyon kabına aktarın ve diseksiyon mikroskobun altına yerleştirin. Korneanın limbus sınırının hemen üzerinde ve dik yanık işareti küçük bir kesi yapmak için bir mikrobıçak kullanın. Kesiiçine kavisli makas yerleştirin ve limbus aşağıdaki kornea bir circumferential kesim gerçekleştirin.

Daha sonra, ince Dumont 5 forseps kullanarak, kornea kaldırmak, lens ayıklamak, ve ince göz arka kısmından kaldırın. Vitreus vücut lens ile çıkacak ve retina arka göz fincan içinde kapsayan beyaz bir yüzey olarak görünür olacaktır. İzole göz kaplarını bir mililitre PBS'de iki kez oda sıcaklığında 10 dakika yıkayın.

Göz kaplarını kriyo-korumak için, batışına kadar bir gecede %15 sakaroz ve PBS ile dört derece santigrat dereceye kadar dengeleyin. Daha sonra göz kaplarını batana kadar 2-3 saat boyunca %30 sakaroz ve PBS'ye aktarın. Katıştırma için 10 tarafından 10 milimetre kriyo-kalıplar EKIM göz bardak yerleştirin.

Bir diseksiyon mikroskobu altında, yanık izi üstte olana kadar gözü döndürerek dorsal ventral ekseni boyunca kriyo-kalıp takik gözü yönlendirin. Optik sinir bir sol ve kalıp kesilmiş kısmı sağ yüzleri. Retina dokusunu dondurmak için kriyo-kalıbı isopentane içeren metal bir kabın içine en az beş dakika batırın ve kabıkabın yüksekliğinin üçte birine kadar sıvı nitrojene yerleştirin.

Dondurulmuş blok çıkarın, alüminyum folyo sarın ve eksi 80 santigrat derece saklayın. Yönünü kaydetmek için dondurulmuş bloğu işaretlemek için bir kalem veya Sharpie kullanın. Eksi 20 ile eksi 25 santigrat derece arasındaki kriyostat sıcaklığını ayarladıktan sonra, gömülü göz bardaklarını içeren kalıpları içine yerleştirin ve bir saat boyunca kriyostat sıcaklığına dengede vermelerini bekleyin.

Dorsal ventral oryantasyon ile kriyostat blok yükleyin ve 10 mikrometre kalınlığında seri bölümleri kesmeye başlayın. Retina kesitlerini açıklamalı ve numaralanmış mikroskop slaytlarına dikkatlice yerleştirin ve ardından immünboyamaya hazır olana kadar eksi 20 santigrat derece veya eksi 80 santigrat derece lik slayt kutularında saklayın. Retina kesitlerinde rodopsin antikorları olan immünohistokimya, fotoreseptör belirteci, glutamik asit dekarboksilaz 65, amakrin hücre belirteci, glutamin synthetase ve Muller hücre belirteci ve kalbindin yapıldı.

Sonuçlar, bu protokolün farklı bir protokolden elde edilen düşük kaliteli retina kesitlerinin aksine yüksek kaliteli ve iyi korunmuş retina kesitleri verdiğini göstermektedir. Rodopsin açısından zengin iç ve dış segmentleri retina pigmentli epitel in üzerini örten çok az ve hiç ayrım ile dikey ve bozulmamış kalır. İnternöronlar, Gad65 pozitif amakrin hücreleri gibi, düzgün iç nükleer tabaka ve iç pleksiform tabakası içinde tabakalaşmış kalır.

Ayrıca, Muller hücreleri iyi soma düzgün ganglion hücre tabakası dış nükleer tabaka yayılan sitoplazmik süreçler hizalanmış ile korunmuş kalır. Ayrıca, iyi tanımlanmış yatay hücreler iç nükleer tabaka ve dış pleksiform tabaka sınırında tespit edilebilir. Gözün üst bölgesini işaretlemek ve katıştırma sırasında yönünü korumak önemlidir.

Her zaman uygun kişisel koruyucu ekipman ile kaputun altında paraformaldehit hazırlamak.