Name: Immünhistokimya için fare retinal Cryo-bölümler hazırlanması (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 25 s
Description: Öğrenin fare retinası kriyobölümleme ve immünhistokimya için doku hazırlama yöntemlerini. Bu protokol, retinal yapıların korunması ve hücresel analiz için yüksek kaliteli kesitler sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma NıH (RO1-GMO97327) ve Üniversite Araştırma Vakfı (UPenn) ' den gelen fonlar tarafından destekleniyordu. Özellikle, immunohistokimya protokolü, Gordon Ruthel (Pennsylvania Üniversitesi) ve Penn VET Imaging Core ile ilgili yardım için mikroskopi ve Leslie King, PhD. .

Burada tarif edilen tüm yöntemler, laboratuar hayvan kaynakları Enstitüsü tarafından sağlanan Laboratuvar hayvanlarının bakımı ve kullanımı için Ulusal Sağlık Rehberi 'nin önerileri ile sıkı bir şekilde yürütülmüştür ve Pennsylvania Üniversitesi Kurumsal hayvan bakımı ve kullanım Komitesi.
Yöntem için tüm araç ve ekipmanlar Şekil 1 ' de gösterilir ve malzeme tablosundalistelenir.
1. Fare göz enucleation, göz bardağı diseksiyon ve gömme
<ol><li>Karbon dioksit (Co2) ile ötenize fareler (postnatal fareler P0-P11) veya servikal çıkığı (Yetişkin > P11 fareler) ya dekasitasyon izledi. P0-P14 fareler için, gözler deri ile kaplıdır. Sonraki adımlardan önce cildi kaldırmak için emin olun.</li>
	<li>Gözün temporal kısmını işaretleyin (Şekil 2a) bir kuyruk cauterizer kullanarak biraz kornea yakmak. Kornea çok hafifçe dokunarak ve cauterizer ile bir bölünmüş ikinci daha fazla değil, kornea bir delik yakmak kaçının.</li>
	<li>Hemen eğimli Dumont #5/45 forseps kullanarak fare gözleri anlatabilirsin. Buz üzerinde fosfat-tamponlu tuz (PBS) içinde 1 ml% 4 paraformaldehit (PFA) ile 1,5 ml geminizi tüpünde 15 dakika boyunca inküye yapın.</li>
	<li>% 4 PFA 15 dakika sonra, sabit göz kavisli forseps kullanarak transfer Dumont #5/45 değiştirilmiş bir 35 mm diseksiyon çanak için (bkz: malzeme ve Şekil 1C tablo ) PBS ile dolu ve diseksiyon mikroskop altında yer.</li>
	<li>Mikro bıçağı kullanarak limbus (kornea sınırı) üzerinde ve sadece üzerinde dik, yanık işareti küçük bir kesi olun.</li>
	<li>Eğri makas kesi içine yerleştirin ve limbus aşağıdaki kornea bir çevresel kesim gerçekleştirmek (Şekil 2B).</li>
	<li>Kornea çıkarın ve ince bir Dumont #5 forseps ile objektif ayıklamak, (Şekil 2B) ve özenle uzak gözün posterior kısmından kaldırın. Vitreus Vücut, objektif ve Retina arasındaki boşluğu dolduran açık jel, objektif (Şekil 2B) ile ortaya çıkar ve Retina arka göz bardağı iç kapsayan beyaz bir yüzey olarak görünür olacaktır. Retinada delik veya gözyaşı gibi görünür bir hasar olmadığından emin olun (Şekil 2C).</li>
	<li>Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 1 mL PBS 'de iki kez göz bardağı yıkayın.</li>
	<li>Göz bardağı lavabolar kadar 4 °c gecede PBS% 15 sakaroz bir çözüm onları dengeleyici tarafından göz bardağı koruyun</li>
	<li>Göz bardağı lavabolar kadar 2-3 h için PBS içinde% 30 sakaroz su bardağı aktarın.</li>
	<li>10 x 10 mm cryomolds (Şekil 3A) Ekim ayında göz bardağı katıştırın. Bir diseksiyon mikroskop kullanarak, onun dorsal-ventral ekseni boyunca cryomold göz yönlendirmek (Şekil 2D, Şekil 3A) yanık işareti üstte kadar göz çevirerek, optik sinir solda ve kalıp kesme parçası sağ yüzleri ( Şekil 2D). Doku yakınındaki kabarcıkları önlemek için dikkat alın. Not: göz bardağı manipüle etmek Için, bir pipet ucu bağlı bir titanyum tel yapılmış bir titanyum prob kullanın.</li>
	<li>Retina dokusu Snap-dondurmak için, ısopentane içeren bir metal kabı en az 5 dk için cryomold daldırın ve sıvı nitrojen veya kuru buz/% 100 etanol banyosu içinde kabı yerleştirin (kadar 1/3 metal kabı yüksekliği). Not: cryomold ısopentane içinde yüksekliğinin yarısından daha büyük, ancak tamamen subbirleştirilmiş olması gerekmez dalmış olmalıdır.</li>
	<li>Dondurulmuş bloğu çıkarın ve alüminyum folyo içinde sarın.</li>
	<li>-80 °C ' de saklayın.</li>
	<li>Blokun yönünü kaydetmek için bir kalem veya keskinleştirme kullanarak dondurulmuş bloğu işaretleyin (Şekil 3B).</li>
</ol>2. Bir kriyostat kullanarak bölümleme
<ol><li>Kriyostat sıcaklığını (-20 ve-25 °C arasında) ayarladıktan sonra, gömülü göz bardakları içeren kalıpların 1 h için kriyostat sıcaklığına dengelenmesine izin verin.</li>
	<li>Bloğu Dorso-ventral oryantasyona (Şekil 3c) takın ve 10 μm kalınlığında seri bölümleri keser. Retina bölümlerini dikkatle detaylandırılmış ve numaralandırılmış mikroskop slaytlarına yerleştirin.</li>
	<li>Slayt kutularındaki slaytlar-20 °C veya-80 °C ' ye kadar ıFC prosedürlerine kadar saklayın.</li>
</ol>3. Slayt raf kullanarak floresan immünostans
Not: slayt raf sistemi (örn., Sequenza), cam mikroskop slaytlarını bir kapak plakasına sahiptir ve slayt ile plaka arasında bir ~ 100 μL kapiller boşluğu yaratmaktadır.
<ol><li>Oda sıcaklığında (RT) Cryo-bölümlerin, Kuru ve mikroskop slaytlarına bağlaymalarına izin vermek için 2 saat ile 4 saat arasında çözüyor. Not: Ayrıca 30-37 °C ' de 30 dakika ila 1 saat boyunca kurutmak mümkündür.</li>
	<li>Slaytları Slayt rafa yerleştirin ve 100-200 μL PBS 'de 2 dakika boyunca retina bölümleri iki kez yıkayın.</li>
	<li>RT 'de 5 dakika boyunca PBS 'de% 0,25 Triton-X/0,05% Nan3' te onları inküle ederek Retina bölümleri geçirgen.</li>
	<li>100 Ekle μL slaytlar için çözüm engelleme.</li>
	<li>100 ekleme μL birincil antikor slaytlar için engelleme çözümü seyreltilmiş.</li>
	<li>Retina bölümlerini 4 °C ' de geceleyin. Not: Bu süre zarfında, bölümlerin kurutmaması için slayt rafa 'nı kapun.</li>
	<li>Retina bölümleri 3 kez, her biri 15 dakika boyunca, 200 μL PBS kullanarak yıkayın. Not: 0,001-0,002% Triton-X100 PBS (PBS-T) ilavesi daha sıkı bir yıkama sağlar ama bazı membranlar ve hücresel yapıları bozabilir.</li>
	<li>RT 'de 1 h için floresan etiketli ikincil antikorlarda Retina bölümleri inkük. Şu andan itibaren ışığın korunması.</li>
	<li>Retina bölümlerini 3 kez, her biri 15 dakika yıkayın.</li>
	<li>Hoechst 33342 veya DAPI solüsyonu gibi bir nükleer Marker ile RT 'de Retina bölümleri 5 dakika boyunca kulvarın.</li>
	<li>Retina bölümleri 15 dakika boyunca 1 kez yıkayın.</li>
	<li>Laboratuvar tezgah üzerinde bir kağıt havlu üstüne bir lamel magazini yerleştirin.</li>
	<li>Coverslip merkezine Anti-solma montaj medya 2 damla ekleyin.</li>
	<li>Retina Cryo bölümünün aşağı bakacak şekilde slaytı çevirin.</li>
	<li>Lamel magazini 'ı ~ 45 ° ' lik bir açı ile dikkatlice monte edin ve slayt üzerine montaj ortamına doğru kaydırın. Not: slaytı yerine düşürmeye çalıştığınızda baloncuklar oluşturarak kaçınarak.</li>
	<li>Aşırı montaj ortamını ortadan kaldırmak için ağır bir kitap veya katalog kullanarak (aşağıya bakın), slayt-coverslip kombinasyonuna bile basınç uygulayın. Not: örnek hazırlıkta tutarlılığı sağlamak Için, her zaman aynı nesneyi kullanın (örn. aynı kitap veya katalog), slayt montajı sırasında kapak kaymasına bile baskı uygulamak için.</li>
	<li>Düz tutun ve karanlıkta RT bir gecede sertleşmesine izin. Slaytlar 4 °C ' de sonsuza kadar düz saklayın.</li>
	<li>Geniş alan veya konfokorik floresan mikroskobu ile görüntü (Şekil 4).</li>
</ol>

<ol><li>Coons, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Labelled+antigens+and+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Labelled antigens and antibodies.</a> Annual Review of Microbiology. 8, 333-352 (1954).</li>
<li>Coons, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+antibodies+as+histochemical+tools%5BTitle%5D)+AND+%22Federation+Proceedings%22%5BJournal%5D)">Fluorescent antibodies as histochemical tools.</a> Federation Proceedings. 10 (2), 558-559 (1951).</li>
<li>Coons, A. H., Kaplan, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+antigen+in+tissue+cells%3B+improvements+in+a+method+for+the+detection+of+antigen+by+means+of+fluorescent+antibody%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Localization of antigen in tissue cells; improvements in a method for the detection of antigen by means of fluorescent antibody.</a> Journal of Experimental Medicine. 91 (1), 1-13 (1950).</li>
<li>Chatterjee, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artefacts+in+histopathology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Oral+Maxillofacial+Pathology%22%5BJournal%5D)">Artefacts in histopathology.</a> Journal of Oral Maxillofacial Pathology. 18 (Suppl 1), S111-S116 (2014).</li>
<li>Hartz, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frozen+sections+from+Bouin-fixed+material+in+histopathology%5BTitle%5D)+AND+%22Stain+Technology%22%5BJournal%5D)">Frozen sections from Bouin-fixed material in histopathology.</a> Stain Technology. 20, 113(1945).</li>
<li>Benerini Gatta, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+alternative+fixatives+to+formalin+in+diagnostic+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Histochemistry%22%5BJournal%5D)">Application of alternative fixatives to formalin in diagnostic pathology.</a> European Journal of Histochemistry. 56 (2), e12(2012).</li>
<li>Tokuyasu, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+cryoultramicrotomy+to+immunocytochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Application of cryoultramicrotomy to immunocytochemistry.</a> Journal of Microscopy. 143 (Pt 2), 139-149 (1986).</li>
<li>Imai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+properties+of+rhodopsin+and+rod+function%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Molecular properties of rhodopsin and rod function.</a> Journal of Biological Chemistry. 282 (9), 6677-6684 (2007).</li>
<li>Lee, J. W., Lim, M. Y., Park, Y. S., Park, S. J., Kim, I. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reexamination+of+Dopaminergic+Amacrine+Cells+in+the+Rabbit+Retina%3A+Confocal+Analysis+with+Double-+and+Triple-labeling+Immunohistochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Reexamination of Dopaminergic Amacrine Cells in the Rabbit Retina: Confocal Analysis with Double- and Triple-labeling Immunohistochemistry.</a> Experimental Neurobiology. 26 (6), 329-338 (2017).</li>
<li>Bringmann, A., Grosche, A., Pannicke, T., Reichenbach, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABA+and+Glutamate+Uptake+and+Metabolism+in+Retinal+Glial+%28Muller%29+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Endocrinology+%28Lausanne%29%22%5BJournal%5D)">GABA and Glutamate Uptake and Metabolism in Retinal Glial (Muller) Cells.</a> Frontiers in Endocrinology (Lausanne). 4, 48(2013).</li>
<li>Nakhai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ptf1a+is+essential+for+the+differentiation+of+GABAergic+and+glycinergic+amacrine+cells+and+horizontal+cells+in+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Ptf1a is essential for the differentiation of GABAergic and glycinergic amacrine cells and horizontal cells in the mouse retina.</a> Development. 134 (6), 1151-1160 (2007).</li>
<li>Applebury, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+murine+cone+photoreceptor%3A+a+single+cone+type+expresses+both+S+and+M+opsins+with+retinal+spatial+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The murine cone photoreceptor: a single cone type expresses both S and M opsins with retinal spatial patterning.</a> Neuron. 27 (3), 513-523 (2000).</li>
</ol>

Açıklamalar yok.

Fare Retina diseksiyon küçük boyutu ve fare gözleri şekli ve Retina doku kırılganlık nedeniyle hassas bir süreçtir. Yüksek kaliteli diseksiyon yapmak bir uygulama meselesi olsa da, ayrıntılı bir protokole sahip olmak, verimli yöntemler ve ipuçları sağlamak Retina bölümler ve IHC elde etmek için bir zorunluluktur. Burada açıklanan protokollere ek olarak, tekrarlanabilir IHC için uygun olan tutarlı yüksek kaliteli Retina bölümler için izin çeşitli ipuçları vardır.
Diseksiyon başlamadan önce, rah...

İmmünhistokimya (IHC), situ1,2,3' te dokularda spesifik proteinleri ve hücresel yapıları yerelleştirme için güçlü bir tekniktir. Uygunsuz fiksasyon yöntemleri ve kompleks dokuların alt-optimum kesmesi doku yapısını bozabilir, yüksek arka plan boyama veya antikor-epitope etkileşimlerini azaltır, boyama eserler ve sonuç olarak yanlış yorumlama sonucu IFC veri4. Vertebrat retinası, birbirine bağlı fotoreceptörler, internöronlar ve ganglion hücrelerinin tabaklarından oluşan kompleks ve son derece organize nöral organdır, çok kırılgan ve diseksiyon ve sekleme sırasında kolayca bozulabilir. Fare göz diseksiyonu ve immünostasyon oryantasyonlarından ayrıntılı, standartlaştırılmış ve onaylanmış bir protokol, ıHC yapılarını önemli ölçüde azaltmaya yardımcı olur, böylece sonuçların güvenilirliğini arttırır ve daha doğru karşılaştırmalı veri sağlar Analysis.
IHC için doku hazırlama için birçok protokol vardır, ancak, tüm Retina doku için uygun değildir. % 10 formalin veya Bouin çözeltisi gibi güçlü fiksatörler, diseksiyon ve sekleme sırasında retina yapısını korur5. Ne yazık ki, güçlü fiksasyonlar genellikle Gelişmiş arka plan floresans ve epitopu maskeleme nedeniyle epitoplar kimyasal modifikasyon6yol açar. Öte yandan,% 4 paraformaldehit (PFA) gibi daha hafif fiksatörler, bu yapıtlardan bazılarını hafifletebilir ancak optimum retina yapısını korumak için titiz diseksiyon ve sekürleme gerektirir. PFA hızla dokuya nüfuz eder, ancak proteinleri çok yavaş çapraz bağlar, epitopu maskeleme riskini azaltır. Kısa süre içinde PFA inkübasyon nispeten hafif bir fikfasyon olduğundan, dokularda genellikle antijenleri korumak için hızlı donma gerektirir. Doku donma sırasında buz kristali oluşumunun önlenmemesi ve hücrelerin ve dokularının bütünlüğünü bozması önemlidir7.
Burada, tutarlı ve güvenilir ıFC verilerini sağlayan fare oküler posterior bardakların diseksiyon, sabitleme ve Cryo koruması için ayrıntılı ve standartlaştırılmış protokoller açıklanmaktadır.

<table><tbody><tr><td>6qt. Paslanmaz Çelik Beher (185 x 218mm)</td> <td>Gilson&nbsp;</td><td>#MA-48</td><td>Sıvı nitrojen için (Şekil 1E)</td></tr> <tr><td>Alüminyum folyo ve nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Koterizatör&nbsp;</td><td>Bovie</td><td>#AA01</td><td>Göz yönünü işaretlemek için (Şekil 1A)</td></tr><tr><td>Kavisli forseps, Dumont #5/45 cımbız, 45 derece bükülmüş&nbsp;</td><td>Elektron Mikroskobu Bilimleri</td> <td># 72703-D</td><td>Fare gözü enükleasyonu ve bakımı için (Şekil 1A)</td></tr> <tr><td>Kavisli makas, Vannas Yaylı Makas - 2,5 mm Kesici Kenar&nbsp;</td><td>Güzel Bilim Araçları&nbsp;</td><td>#15002-08</td><td>Korneayı çevresel olarak kesmek için (Şekil 1B)</td></tr><tr>Göz <td>kabı diseksiyonu için</td> <td>diş balmumu kaplı 35 mm diseksiyon kabı</td><td></td><td></td> (Şekil 1C)</tr><tr><td>Diseksiyon mikroskobu&nbsp;</td><td>Leica, Houston, ABD&nbsp;</td><td>MZ12.5 Yüksek Performanslı Stereomikroskop</td><td></td></tr><tr><td>Mikro Bıçaklar - Plastik Saplı&nbsp;</td><td>Güzel Bilim Araçları&nbsp;</td><td>#10315-12</td><td>Yanık izinde küçük bir kesi yapmak için (Şekil 1A)</td></tr><tr><td>Pembe diş mumu&nbsp;</td><td>Elektron Mikroskobu Bilimleri&nbsp;</td><td># 72660</td><td>Diseksiyon çanağını kaplamak için</td></tr><tr><td>Sürgülü Raf ve Kapak Plakası</td><td>Ted Pella</td> <td># 36107</td><td>Retinal IHC için (Şekil 1G)</td></tr> <tr><td>Paslanmaz Çelik Beher (89 x 114mm)</td> <td>Gilson&nbsp;</td><td>#MA-40</td><td>İzopentan banyosu için (Şekil 1E)</td></tr><tr><td>Strafor kutu</td><td></td><td></td><td>Yalıtımlı soğutucu için</td></tr><tr><td>İnce forseps Dumont #5&nbsp; &nbsp;</td><td>Güzel Bilim Araçları&nbsp;</td><td>#11254-20</td><td>Korneayı çıkarmak ve lensi çıkarmak için (Şekil 1B)</td></tr><tr><td>Tissue-Tek kriyomold&nbsp; (10 mm x 10 mm x 5 mm)</td><td>Elektron Miskroskopi Bilimleri&nbsp;</td><td># 62534-10</td><td>OCT gömme için kalıp</td></tr><tr><td><güçlü>Tamponlar ve Reaktifler</td><td>Company< > <</td><td>strong>Katalog Numarası</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Blokaj çözümü</td><td></td><td></td>% <td>2 Normal At Serumu,% 1.5 Soğuk Balık derisi Jelatin (H2O'da% 40-50'de, kedi #G7765),% 5 sığır serum albümini (kedi #AK1391-0100) geçirgenlik tamponunda. &nbsp;</td></tr><tr><td>Gelvatol (solmayı önleyici montaj ortamı)Çeker</td><td></td><td></td> <td>ocak altında, 0.337g DABCO'yu (Sigma cat #D2522-25G) 10mL Fluoromount G (Fisher cat #OB100-01) içinde çözün. 12N HCl (~ 5 damla) ile pH 8-8.5'e ayarlayın. Kehribar damla şişede 4 ° C'de saklayın; C&nbsp; (8).&nbsp;</td></tr><tr><td>Hoechst 33342 1000x Stok</td><td>Thermo Scientific</td> <td># 62249</td><td>PBS'de (1000x) 1 mg / ml. Aliquot ve karanlıkta, 4 ° C'de saklayın; 1 yıla kadar veya -20 ° C'de; Uzun süreli depolama için C. Taze hazırlayın&nbsp; 1 ug / mL (1x) & nbsp'de;</td></tr><tr><td>İzopentan, %99&nbsp;</td><td>PBS Elektron Mikroskobu Bilimlerinde GFS Kimyasalları</td> <td># 2961</td><td></td></tr><tr><td>Sıvı Azot</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehit (PFA)</td> &<td>nbsp;</td><td>#15710</td><td>%16 PFA stoğundan taze %4 PFA hazırlandı. Kalan %16 PFA'yı 4 ° C'de saklayın; Karanlıkta C.&nbsp;</td></tr><tr><td>Geçirgenleştirme çözümü</td><td></td><td></td><td>PBS +% 0.25 Triton-X (AMRESCO cat # 0694-1L) +% 0.05 NaN3.&nbsp; Taze hazırlayın.</td></tr><tr><td>Fosfat tamponlu tuzlu su (PBS)</td><td>Bioworld&nbsp;</td><td>#41620015-20</td><td>0,02 g/L KCl, 0,02 g/L KH<alt>2</alt>PO4, 0,8 g/L NaCl, 0,216 g/L Na<alt>2</alt>HPO4, pH 7,4.&nbsp; 10x stoktan hazırlanmıştır&nbsp;</td></tr><tr><td>Sükroz çözeltileri</td><td>Fisher Scientific&nbsp; &nbsp;</td><td>#S-5-500</td><td>Uygun miktarda sakarozun &nbsp; 37& derece içinde çözün; C PBS (çözünmesi ~ 15 dakika sürer). 4 ° C'de birkaç gün saklanabilir.</td></tr><tr><td>Tissue-Tek OCT bileşik&nbsp;</td><td>Sakura</td><td>&nbsp;#4583</td><td></td></tr><tr><td>Antikorlar</td><td>Company<</td><td>strong>Katalog Numarası</td><td>Comments</td></tr><tr><td>anti-calbindin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8666</td><td>Horinzotal hücreleri etiketlemek için&nbsp;</td></tr><tr><td>anti-GAD65</td><td>Chemicon</td><td>AB5082</td><td>GABAerjik amakrin hücreleri etiketlemek için</td></tr><tr><td>anti-GS</td><td>BD İletim</td><td>610517</td><td>M&uuml'u etiketlemek için; ller hücreleri</td></tr><tr><td>anti-rodopsin</td><td>Millipore</td><td>MAB5316</td><td>Çubukları etiketlemek için</td></tr></tbody></table>

immünhistokimya için fare retinal cryo-bölümler hazırlanması

Preparation of Mouse Retinal Cryo-sections for Immunohistochemistry

İmmünhistokimya (ıHC) için yüksek kaliteli fare göz bölümlerinin hazırlanması, Retina yapısının ve fonksiyonunun değerlendirilmesi ve Retina hastalıklarının temelindeki mekanizmaların belirlenmesi için önemlidir. Doku hazırlığı boyunca yapısal bütünlüğünü sürdürmek, tekrarlanabilir Retina IFC verilerini elde etmek için hayati önem taşımaktadır, ancak Retina sitilinin kırılganlık ve karmaşıklığı nedeniyle zor olabilir. % 10 formalin veya Bouin çözeltisi gibi güçlü fiksatörler Retina yapıyı optimum şekilde korur, genellikle arka plan floresan ve/veya azalan antikor-epitopu etkileşimleri, epitopu maskeleme olarak bilinen bir süreci artırarak IFC analizini azaltır. Diğer taraftan,% 4 paraformaldehit gibi daha hafif fiksatörler, retina yapısını korumak için arka plan floresan ve epitope-maskeleme, titiz diseksiyon tekniklerini azaltmıştır. Bu yazıda, Retina yapısal bütünlük kaybı olmadan en antikor-epitope etkileşimlerini korumak için yeterli olan IFC için fare oküler posterior bardakları hazırlamak için kapsamlı bir yöntem sunuyoruz. En uygun ve en uygun koşullarda doku koruma ve oryantasyonunu göstermek için çeşitli Retina hücre tipi belirteçleri için antikor ile temsilci ıHC içerir. Amacımız ihc 'de oküler posterior fincan diseksiyon tam bir protokol sağlayarak retinada ıFC çalışmalarını optimize etmektir.

Nasıl bu protokoller, IFC için optimum Retina koruma sağlamak göstermek için, biz P28 WT fareler (C57BL/6N) rodopsin (bir fotoreceptor Marker) antikorlar ile retina bölümler probed8, glutamik asit decarboksilaz 65 (Gad65, bir amacrine hücre Marker)9, glutamin sentetaz (GS, bir Müller hücre Marker)10, ve calbindin (yatay hücre işaretleyicisi)11 (Şekil 4). IHC, proto...

Bu raporda, immünhistokimya (ıHC) için dondurulmuş fare Retina bölümlerini hazırlamak için kapsamlı yöntemler açıklanmaktadır. Tanımlanan yöntemlerle oküler posterior bardak diseksiyonu, paraformaldehit fikstasyon, optimum kesme sıcaklığı (OCT) medya ve doku oryantasyonu, seksiyonlama ve immünostasyonu katıştırma bulunmaktadır.

Immünhistokimya için fare retinal Cryo-bölümler hazırlanması

Preparation of high-quality mouse eye sections for immunohistochemistry (IHC) is critical for assessing the retinal structure and function and for ...

Fare retinal diseksiyonu, gözlerin büyüklüğü ve şekli ve retina bölümünün kırılganlığı nedeniyle gerçekten hassas bir süreçtir. Uygulama zorunluluğu, verimli yöntem ve ipuçları sağlayan ayrıntılı bir protokole sahip yüksek kaliteli retinadisemi ve kesitanahtarıdır. Araştırmacının ortak tuzaklardan kaçınmasına ve immünohistokimyaya uygun yüksek kaliteli retina kesitleri elde etmelerine yardımcı olacak ipuçları ve öneriler sayılmaktayız.Çok hafifçe kornea dokunarak bir kuyruk küretterizer kullanarak bir ötenazi farenin gözünün zamansal kısmını işaretleyin ve korneayı hafifçe yakmak ve delik açmaktan kaçınmak için bir saniyeden fazla bir süre için. Bundan hemen sonra fare gözleri enucleate kavisli Dumont 545 forceps kullanılır. Gözleri 1,5 mililitrelik kriyotube'a yerleştirin ve %4'lük bir mililitre PFA ve PBS ile 15 dakika boyunca buzüzerinde kuluçkaya yatırın.Daha sonra, kavisli Dumont 545 çömleci kullanarak sabit gözleri PBS ile doldurulmuş modifiye edilmiş 35 milimetrelik bir diseksiyon kabına aktarın ve diseksiyon mikroskobun altına yerleştirin. Korneanın limbus sınırının hemen üzerinde ve dik yanık işareti küçük bir kesi yapmak için bir mikrobıçak kullanın. Kesiiçine kavisli makas yerleştirin ve limbus aşağıdaki kornea bir circumferential kesim gerçekleştirin.Daha sonra, ince Dumont 5 forseps kullanarak, kornea kaldırmak, lens ayıklamak, ve ince göz arka kısmından kaldırın. Vitreus vücut lens ile çıkacak ve retina arka göz fincan içinde kapsayan beyaz bir yüzey olarak görünür olacaktır. İzole göz kaplarını bir mililitre PBS'de iki kez oda sıcaklığında 10 dakika yıkayın.Göz kaplarını kriyo-korumak için, batışına kadar bir gecede %15 sakaroz ve PBS ile dört derece santigrat dereceye kadar dengeleyin. Daha sonra göz kaplarını batana kadar 2-3 saat boyunca %30 sakaroz ve PBS'ye aktarın. Katıştırma için 10 tarafından 10 milimetre kriyo-kalıplar EKIM göz bardak yerleştirin.Bir diseksiyon mikroskobu altında, yanık izi üstte olana kadar gözü döndürerek dorsal ventral ekseni boyunca kriyo-kalıp takik gözü yönlendirin. Optik sinir bir sol ve kalıp kesilmiş kısmı sağ yüzleri. Retina dokusunu dondurmak için kriyo-kalıbı isopentane içeren metal bir kabın içine en az beş dakika batırın ve kabıkabın yüksekliğinin üçte birine kadar sıvı nitrojene yerleştirin.Dondurulmuş blok çıkarın, alüminyum folyo sarın ve eksi 80 santigrat derece saklayın. Yönünü kaydetmek için dondurulmuş bloğu işaretlemek için bir kalem veya Sharpie kullanın. Eksi 20 ile eksi 25 santigrat derece arasındaki kriyostat sıcaklığını ayarladıktan sonra, gömülü göz bardaklarını içeren kalıpları içine yerleştirin ve bir saat boyunca kriyostat sıcaklığına dengede vermelerini bekleyin.Dorsal ventral oryantasyon ile kriyostat blok yükleyin ve 10 mikrometre kalınlığında seri bölümleri kesmeye başlayın. Retina kesitlerini açıklamalı ve numaralanmış mikroskop slaytlarına dikkatlice yerleştirin ve ardından immünboyamaya hazır olana kadar eksi 20 santigrat derece veya eksi 80 santigrat derece lik slayt kutularında saklayın. Retina kesitlerinde rodopsin antikorları olan immünohistokimya, fotoreseptör belirteci, glutamik asit dekarboksilaz 65, amakrin hücre belirteci, glutamin synthetase ve Muller hücre belirteci ve kalbindin yapıldı.Sonuçlar, bu protokolün farklı bir protokolden elde edilen düşük kaliteli retina kesitlerinin aksine yüksek kaliteli ve iyi korunmuş retina kesitleri verdiğini göstermektedir. Rodopsin açısından zengin iç ve dış segmentleri retina pigmentli epitel in üzerini örten çok az ve hiç ayrım ile dikey ve bozulmamış kalır. İnternöronlar, Gad65 pozitif amakrin hücreleri gibi, düzgün iç nükleer tabaka ve iç pleksiform tabakası içinde tabakalaşmış kalır.Ayrıca, Muller hücreleri iyi soma düzgün ganglion hücre tabakası dış nükleer tabaka yayılan sitoplazmik süreçler hizalanmış ile korunmuş kalır. Ayrıca, iyi tanımlanmış yatay hücreler iç nükleer tabaka ve dış pleksiform tabaka sınırında tespit edilebilir. Gözün üst bölgesini işaretlemek ve katıştırma sırasında yönünü korumak önemlidir.Her zaman uygun kişisel koruyucu ekipman ile kaputun altında paraformaldehit hazırlamak.

preparation-of-mouse-retinal-cryo-sections-for-immunohistochemistry

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Biz beyin bölümlerinin kesit alma fareler, kaldırma ve kesit beynin yanı sıra immunoperoksidaz boyama, reçine gömme ve ultra ince transcardiac perfüzyon için bir protokol tanımlamaktadır. Bu prosedürlerin tamamlanmasının ardından, ile immunohistokimyasal malzeme transmisyon elektron mikroskobu ile incelenmesi için hazırdır.

Fare Beyin Dokusu Immunoelectron Mikroskopi için hazırlanması

Yenidoğan fare retina bir anjiyogenez modüle farklı genler ya da uyuşturucu rolleri soruşturma izin anjiyogenez bir iyi karakterize fizyolojik modeli...

Anjiyogenez Araştırma Yenidoğan Fare Retina Tüm Dağı Immunofluorescent Boyama<em&gt; In vivo</em

Burada açıklanan protokol, tam montajlı bir retinal preparatın yapısal değerlendirmesi içindir. Bu, doku diseksiyonunun tanımlarını, hidrofilize politetrafloroetilen (PTFE) membran ekine montajı, floresan işaretleyicilerle bolus yüklemesini ve hücresel ve sinaptik bileşenlerin immünohistokimyasal analizi için karbodiimid ve paraformaldehit ile fiksasyonun karşılaştırılmasını içerir.

Görüntüleme ve İmmünhistokimyanın için Retina Wholemount Hazırlık için optimize edilmiş Protokolü

Biz üç farklı doku hazırlama teknikleri immunohistokimyasal görselleştirme sıçan retina mikrovasküler perisitlerden, Yani, soğutucu bölümü, Bütün bağlar ve damar ağının hipotonik yalıtım için göstermek.

Retina Cryo-kesitler, Bütün bağlar ve mikrovasküler perisitlerden immunohistokimyasal görselleştirme hipotonik izole damarlara hazırlıkları

Bu rapor amacı sağlam immunohistokimyasal algılama epigenetik işaretleri için iletişim kuralı tanımlamak için fare retina 5-metilsitozin (5mC) ve 5 arasında bakterilerde görülen (5hmC) gelişmekte olan ve postmitotic.

5-metilsitozin ve gelişmekte olan 5-arasında bakterilerde görülen immunohistokimyasal tespiti ve Postmitotic fare Retina

Burada, standart immünohistokimyasal lekelenme ve retina nöronlarının ve bunların hücre altı yapılarının yüksek çözünürlüklü görüntüleme kalitesini artırmak için beyin dokularının CLARITY yöntemini tam montajlı retinalara uyarlamak için bir protokol sunuyoruz.

CLARITY Doku Temizleme Yöntemi ile Tüm Mount Retinaların İmmünasyonunun İmmünasyon

Fare modelleri, retinal pigmentli epitelin (RPE) biyolojisini araştırmak için yararlı araçlar olabilir. Farelerin bir dizi RPE patolojisi geliştirebileceği tespit edilmiştir. Burada, ışık, iletim elektronu ve konfokal mikroskopi kullanarak farelerde RPE patolojilerini aydınlatmak ve ölçmek için bir fenotipleme protokolü tarif ediyoruz.

Yaşa Bağlı Makula Dejenerasyonunun Fare Modellerinde Retinal Pigmentli Epitel Patolojilerini Değerlendirme ve Ölçme Protokolü

Bu protokol, retinadaki sinaptik devreleri ve protein lokalizasyonunu keşfetmeye odaklanarak, önceden gömülü immünoelektron mikroskobunun ayrıntılı adımlarını ana hatlarıyla belirtir.

İmmünoelektron Mikroskobunun Önceden Gömülmesi ile Retina Devrelerinin ve Moleküler Lokalizasyonun İncelenmesi

Retinal vasküler sistemdeki perisitler, retroorbital floresan domates lektin enjeksiyonu sonrası trombosit kaynaklı büyüme faktörü reseptörü β ile immünofloresan boyama ile incelendi. Etiketli retina, doku temizleme yöntemi ile daha fazla tedavi edildi ve retina vaskülatürünü çevreleyen perisitlerin üç boyutlu görünümlerini konfokal mikroskop altında görselleştirmek için tamamen monte edildi.

Farelerde Retinal Vasküler Perisitlerin İmmün Boyama ile 3D Görüntülenmesi 

Fare retinal kriyoseksiyonlarının hazırlanması ve fotoreseptörler üzerinde immün boyama yapılması için bir protokol tanımlanmıştır. Bu makale, araştırmacıların iyi korunmuş morfoloji ve yüksek kaliteli immün boyama sonuçları ile fare retinal donmuş kesitlerini tutarlı bir şekilde üretmelerini sağlar.

Fare Retinasının Kriyoseksiyonu ve İmmün Boyanması

Retina, laminer yapısı boyunca karmaşık uzamsal organizasyon sergiler. Modern mekansal transkriptomik ve dizileme teknikleri, 20 μm kalınlığında doku kesitleri &lt; gerektirir ve bu da retinal araştırma uygulanabilirliklerini sınırlar. Bu taze dondurulmuş kriyoseksiyon yöntemi, düzlemsel uzamsal ilişkileri korurken fare retinasının ince yüz kesitlerini üretir ve laminalar arasında kapsamlı moleküler haritalama sağlar.

En yüz Yüksek Boyutlu Mekansal Moleküler Analiz için Fare Retinasının Kriyoseksiyonu

Öğrenin fare retinası kriyobölümleme ve immünhistokimya için doku hazırlama yöntemlerini. Bu protokol, retinal yapıların korunması ve hücresel analiz için yüksek kaliteli kesitler sağlar.

Immünhistokimya için fare retinal Cryo-bölümler hazırlanması

Daha fazla video keşfet