Mikrotübül Polimer Mekaniğinin İncelenmesi için Mikroakışkan Tabanlı Bir Yaklaşımın Geliştirilmesi

Mikrotübüller, hücre bölünmesi ve hücre içi taşınmada önemli rol oynayan hücre iskeleti polimerleridir. Bu çalışmada, mikrotübül mekaniğini in vitro olarak incelemek için mikroakışkanları benimsiyoruz. Bu çalışma, mikroakışkan cihazlardaki mikrotübülleri incelemek için iki özel sınırlamayı, proteinleri denatüre edebilen hava kabarcıkları potansiyelini ve yüksek verimli tahlillerin kullanılmamasını ele almaktadır. Mikroakışkan cihazımız ve protokolümüz, önceki akış hücresi tahlillerimizden daha sağlam, yüksek verimli test yeteneklerine sahip bir dizi deney kurulumuna izin verir.

[Öğretim Görevlisi] Başlamak için, oksijen veya temiz kuru hava plazması kullanarak üç inçlik bir silikon gofreti vakum altında beş dakika boyunca plazma ile temizleyin. Vakum basıncının beş çarpı on üzeri eksi beş torr'un altında olduğundan emin olun. Temiz silikon gofreti, foto direnç biriktirme için döndürme kodlayıcıya ortalayın ve silikon gofretin merkezine bir ila iki mililitre SPR 227.0 foto resist bırakın. 30 saniye boyunca dakikada 1000 devirde 13 mikrometre kalınlığında bir tabaka elde etmek için fotorezisti döndürün. Kaplanmış yüzeyle teması en aza indirirken, silikon gofretleri 70 santigrat dereceye ayarlanmış bir sıcak plakaya aktarın. Silikon gofreti sıcak plaka üzerinde inkübe edin, sıcaklık 115 santigrat dereceye ulaşana kadar sıcaklığı her üç ila beş dakikada bir 10 santigrat derece artırın. Ardından sıcak plakayı kapatın ve silikon gofretin sıcaklığı 65 santigrat derecenin altına düşene kadar soğumasını bekleyin. Forseps kullanarak, soğutulmuş gofretleri maske hizalayıcısına aktarın. Hem silikon gofret'i hem de uygun fotoğraf maskesini üreticinin veya bölgeye özel protokollere göre hizalayıcıya yükleyin, şimdi gofretleri santimetre kare başına yaklaşık 400 milijoule enerji ile ultraviyole radyasyona maruz bırakın. Formülü kullanarak gerekli maruz kalma süresini hesaplayın. Rehidrasyon ve ısıl işlemden sonra, gofreti uygun geliştiriciye batırın. Ardından gofretin her iki tarafını da deiyonize su ile 30 saniye nazikçe durulayın. Geliştirilen gofretleri nitrojen gazı kullanarak kuruttuktan sonra, bir desikatöre aktarın. Kurutucuya küçük bir alüminyum kap yerleştirin ve alüminyum kabın içine bir damla silan ekleyin. Kuruduktan sonra, karıştırılmış ve gazı alınmış Polidimetilsiloksanı bir Petri kabı içindeki ana kalıba dökün. PDMS'nin tamamen kürlenmesini sağlamak için çanağı gece boyunca 65 santigrat derecede inkübe edin. Cihaz özelliklerinin etrafında, ana katmandan dikdörtgen PDMS parçalarını kesmek için bir neşter veya tıraş bıçağı kullanın. Her parçanın uygun yapıştırma temasına izin vermek için yeterli yan boşluk içerdiğinden ve 22 x 22 milimetrelik bir cam kapak kızağına uyduğundan emin olun. PDMS'yi sert yüzeylerden kaçınarak yedek bir kurban PDMS katmanına yerleştirin. Ardından, 1,5 milimetrelik temiz bir delgeç kullanarak her PDMS parçasında giriş ve çıkış delikleri açın. Şimdi 22 x 22 milimetrelik bir cam kapak kayışı alın ve izopropil alkolle karıştırılmış bir mendil kullanarak temizleyin. Daha sonra temiz, kuru hava plazması kullanarak cam kapak kızağını vakum altında beş dakika boyunca plazma ile temizleyin. Her ikisini de plazma temizleyiciye yerleştirmeden önce hem cam kapak sürgüsünü hem de PDMS'nin özellik tarafını izopropil alkollü ıslak mendillerle silin ve aynı anda temiz, kuru hava plazması kullanarak vakum altında 30 saniye boyunca plazma ile temizleyin. Temizledikten sonra, PDMS'yi özellik tarafı aşağı bakacak şekilde ters çevirin. PDMS'yi cam kapak sürgüsünün üzerine yerleştirin ve yapıştırmayı teşvik etmek için hafifçe bastırın. Stabilize edilmiş mikrotübül uzantıları, büyüme yönlerine dik olarak akan tampon çözeltisi ile büküldü ve bu da cihaz içinde yönlü kuvvet uygulama kapasitesini gösterdi. Mikrotübüllerin deneyimlediği yüzeye yakın akış hızı, Navier-Stokes denklemine dayalı simülasyon ve analitik modelleme kullanılarak saniyede 92 mikrometre olarak hesaplandı. Hesaplamalı simülasyonlar, öngörülebilir konsantrasyon modellerini gösteren bir floresan boya ile deneysel olarak doğrulanan cihaz boyunca kararlı gradyanların oluşturulduğunu gösterdi. Çift etiketli mikrotübül uzantıları, cihaz boyunca farklı uzamsal bölgelerde baskın olan farklı floresan proteinleri ile gradyan tabanlı bölümlemeyi doğruladı.