Şekil Morfometrik Analizleri: Zebrafish'te Kraniofasiyal Şekil Nicelesi için Analiz Yazılımı Araç Kutusu
February 27th, 2026
Bu çalışma, zebrafish larvalarında yüz yapısındaki değişiklikleri ölçmek için ücretsiz yazılım (tpsDigs2, MorphoJ ve PAST) kullanılarak kraniofasiyal kıkırdak şeklinin nicelendirilmesine yönelik bir protokolü tanımlar.
Araştırmamız, etanol ve bmp7a'nın zebra balıklarında ince kraniofasiyal kusurlara neden olup olmadığını niceletmek için morfometrik yazılım kullanmaktadır. Doğrusal ölçümler ince değişiklikleri kaçırır. Bu yöntemle, şekil değişikliklerini niceliklendirmek için işaretleri kullanır ve boyut farklarını kontrol ederiz.
Başlamak için tpsDigs2 yazılımını açın. Kaynağı Gir'e tıklayın, sonra Dosya'ya tıklayın ve kaydedilen TPS Notepad dosyasını seçin. Görsel araçlar seçeneğini görselleştirmek için Seçenekler'e tıklayın.
Referans uzunluğunu 100 mikrometreye ayarlayın ve Set scale'e basın. Ölçek parametrelerini doğrulamak için Ok'a tıklayın, ardından Image tools penceresinden çıkın. Sonra, nişan sembolüne tıklayın ve ilk işareti Meckel kıkırdakları arasındaki orta çizgi eklemine yerleştirin.
İkinci işaretleri Meckel ile palatoquadrat kıkırdaklar arasındaki ikilateral eklemlere yerleştirin. Üçüncü işareti seratohyal kıkırdaklar arasındaki orta çizgi eklemine, dördüncü işareti ise palatoquadrat ile ceratohyal kıkırdaklar arasındaki iki taraflı eklemlere yerleştirin. Sonra, beşinci işaretleri hyomandibular kıkırdakların uzak ucuna yerleştirin; böylece her görüntü için aynı sırayla yer alırlar.
Simge işaretleri yerleştirdikten sonra, açılır menü açmak için Dosya'ya tıklayın. Verileri kaydet, ardından güncellenmiş dosyayı kaydetmek için Üzerine Yaz seçeneğini seçin. tpsDigs2 yazılımından çıkın.
MorphoJ yazılımını başlatın. Dosya'ya tıklayın, Yeni Veri Seti Oluştur'u seçin ve veri setine bir isim atayın. TPS'ye tıklayın ve yeni eklenen veri noktalarını içeren Notepad dosyasını seçin.
Sonra, veri setini oluşturun. Project Tree'de, veri setine tıklayın. Ön elemeleri seçin, ardından Yeni Procrustes Fit'i.
Ana eksenlere göre hizalamayı seçin ve Procrustes Uyumunu Gerçekleştir'e tıklayın. Ön Elemeler bölümünde, procrustes koordinatlarını elde etmek için Kovaryans Matrisi Oluştur seçeneğini seçin. Istendiğinde fonksiyonu çalıştırın.
Şimdi, Tel Çerçeve Oluştur veya Düzenle seçeneğini seçin ve görsellerdeki noktaları bağlayın. Bağlantılı noktalara tıklayın ve görseli kabul edin veya oluşturun, ardından gerektiğinde sınıflandırıcıları düzenleyin. MorphoJ'yi açık tutarken bir tablo programı açın.
GENOTYPE, TREATMENT ve GENOTYPE TREATMENT gibi sınıflandırıcı bilgileri girin, ardından dosyayı CSV dosyası olarak kaydedin. MorphoJ'de, Dosya'ya tıklayın ve CSV dosyasını içe aktarmak için Sınıflandırıcı Değişkenlerini İttere Et'i seçin. Project Tree'ye geri dönün ve veri setine tıklayın.
Ön Hazırlıklar bölümünde, tüm görsellerin dahil olduğunu doğrulamak için Sınıflandırıcıları Düzenle'yi seçin. Project Tree'de CovMatrix'i seçin, ardından sayfanın üstündeki Varyasyon'a tıklayın. Ana bileşen puanlarını hesaplamak için Ana Bileşen Analizi'ni seçin.
Oluşturulan grafik görüntülemek için PC puanlarına tıklayın. Grafiğe sağ tıklayın ve istenen sınıflandırıcı eklemek için Güven Üç noktası seçin. Renk Veri Noktaları'nı seçin, renkleri atanız ve değişiklikleri uygulamak için Tamam'a tıklayın.
Ön Hazırlıklar bölümünde, ekranın altındaki Şekil Grafiği için Seçenekleri Ayarla'yı seçin. Wireframe Grafiklerini seçin ve hedef şeklin, başlangıç şeklinin ve sayıların renklerini değiştirin. Varyasyonu seçin, sonra procrustes ANOVA'yı seçin.
Procrustes ANOVA sonuçlarını daha önce oluşturulan elektronik tablo dosyasına dışa aktarın. MorphoJ'de, Project Tree'de orijinal veri setini seçin. Karşılaştırma'ya tıklayın, ardından Kanonik Varyant Analizi'ne tıklayın.
GENOTYPE TREATMENT sınıflandırıcı değişkenlerini seçin ve fonksiyonu çalıştırın. Sonuçları dışa aktarmak için Sonuçlar sekmesine tıklayın ve sonuçlar sayfasına sağ tıklayın. Dosyaya Dışa Aktar seçeneğini seç ve sonuçları kaydet.
Project Tree'de, Kanonik Varyant Analizi'ni seçin, ardından puanlar. Dosya'ya tıklayın, Veri Set'i İhracat Et'i seçin, veri türünü ve GENOTYPE TREATMENT seçeneğini seçin. CVA puanlarını TXT dosyası olarak kaydet.
Dosyayı PAST yazılımı için hazırlamak için, kaydedilen CVA puanlarını bir metin düzenleyicide açın. Sol üst köşedeki terim id'yi Etiket ile değiştirin ve düzenlenen dosyayı kaydedin. PAST yazılımını açın ve File'a tıklayın, ardından düzenlenmiş CVA puan dosyasını seçmek için açın.
İç aktarma penceresinde. Isimler, satır ve sütun için veri ve ayırıcı olarak Tab'ı seçin, ardından İçe Aktar'a tıklayın. Göster sekmesinden Column attributes (Column attributes) seçeneğini seçin.
Tip'in yanındaki açılır menüde, sınıflandırıcı değişkenleri içeren ilk sütuna Grup atayın. Ana bileşeni veya kanonik varyasyon veri sütunlarını vurgulayın. Çoklu değişken, ardından Testler seçin ve ana bileşen ve kanonik değişken verileri için normallik testini ayrı çalıştırmak üzere Çok Değişkenli normalliği seçin.
Tüm veri setini seçmek için Yazı başının üst sol köşesindeki gri boş hücreye tıklayın. Çoklu değişken, ardından Testler ve analiz için çok değişkenli varyantlar analizini seçin. MANOVA sonuçlarını daha önce oluşturulan tablo dosyasına aktarın.
Her genotipte ve tedavi grubundaki her larva için visserokraniyum görüntüleri alındı. Viserokraniyumun kıkırdakları temsil edici bir görüntüyle etiketlendi ve her görselde işaretler yerleştirilerek işaretli veri setleri oluşturuldu. Ana bileşen 1, toplam şekil değişiminin yaklaşık %34'ünü, ana bileşen 2 ise toplam şekil varyasyonunun %20'sini oluşturdu.
Her ana bileşen, tüm visserokranilerin ortalama şekline göre visserokranial şekilde özel bir varyasyon göstermiştir. Ana bileşen analiz grafiki, genotip ve tedavi grupları arasında belirgin bir kümelenme olmadan örtüşen ortalamalar göstermiştir. Etanol ile işlenmiş yabani tip larvalar, düşük örneklem büyüklüğü nedeniyle ortalamanın %95 güvenle ellips ölçüsüne sahipti.
Kanonik varyat 1, macenta tel çerçevedeki seratohyal eklemin ortalama siyah tel çerçeveye göre hafif kısaltılması veya uzamasını temsil eder. Kanonik varyat 2, Meckel's-palatoquadrate ile palatoquadrate-ceratohyal arasındaki eklemlerde visserokraniyumun sadece bir tarafında medial bir kayma gösterdi. Etanol ile işlenmiş yabani tip larvalar, diğer tüm grupların üzerinde üst üste düşen ortalamanın %95 güvenli bir ellipsi göstermiştir.
Varyantların çok değişkenli analizi, genotip ve tedavinin anlamlı bir genel etkisini ortaya koydu. Tutarlı örnek montajı en büyük zorluktur. Eğik larva, yanlış ölçümlere yol açabilir ve sonuçları değiştirebilir.
Bu protokol farklı anatomik yapılara uyum sağlar, 3D verileri analiz eder, doğrusal ölçümler üretir ve deneysel örneklem boyutlarının belirlenmesine yardımcı olur. Gelecekteki çalışmalar, diğer genotip-etanol hassasiyetlerini araştıracak, örnek boyutlarını genişletecek ve bu çok yönlü araç kutusunu çeşitli anatomik yapılara uygulayacak.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overview
This article presents a detailed morphometric protocol for analyzing subtle craniofacial shape changes in zebrafish larvae following ethanol exposure, with a focus on gene-ethanol interactions. The approach leverages landmark-based geometric morphometrics and multivariate statistical analyses to quantify and compare facial skeletal variation, addressing challenges in assessing fetal alcohol spectrum disorders (FASD) phenotypes.
Key Study Components
Area of Science
- Developmental biology
- Genetics
- Morphometrics
- Toxicology
Background
- FASD encompasses a range of physical, cognitive, and behavioral disabilities caused by prenatal ethanol exposure.
- Facial skeletal abnormalities are a hallmark of FASD, but their analysis is complicated by genetic variability and subtle shape changes.
- Zebrafish are an effective model due to genetic similarity to humans, external fertilization, conserved craniofacial structures, and transparent larvae.
- Traditional linear measurements may miss subtle or complex shape changes, necessitating advanced morphometric approaches.
Purpose of Study
- To quantify subtle craniofacial defects resulting from ethanol and bmp7a gene interactions in zebrafish.
- To develop and demonstrate a reproducible workflow for landmark-based morphometric analysis of craniofacial shape.
- To enable pairwise and multivariate comparisons of facial morphology across genotypes and treatments.
Methods Used
- Landmark placement on viscerocranial cartilage images using tpsDigs2 software.
- Procrustes alignment, principal component analysis (PCA), and canonical variate analysis (CVA) using MorphoJ.
- Multivariate normality and MANOVA tests using PAST software.
- Statistical visualization and export of results for further analysis.
Main Results
- Principal component 1 and 2 accounted for 34% and 20% of total shape variation, respectively.
- PCA plots showed overlapping means among genotype and treatment groups, with no distinct clustering.
- Canonical variate analysis revealed subtle, localized shape changes in the viscerocranium, such as shortening/lengthening of the ceratohyal joint and medial shifts at specific cartilage joints.
- MANOVA indicated a significant overall effect of genotype and treatment on craniofacial shape.
Conclusions
- The morphometric protocol enables detection of subtle craniofacial shape changes that linear measures may miss.
- Consistent sample mounting is critical to avoid measurement artifacts.
- This workflow is adaptable to other anatomical structures and can be extended to 3D data and larger sample sizes in future studies.
Frequently Asked Questions
Chapters in this video
0:00
Introduction
0:24
Adding Landmarks to Zebrafish Larvae Viscerocranium Images Using tpsDigs2 Software
1:48
Using MorphoJ to Analyze Cranofacial Shape by Procrustes ANOVA
4:26
Canonical Variate Analysis of the Dataset and MANOVA in PAST Software
6:43
Results
8:30
Conclusion
