Üç boyutlu Floresans Images Hücresel Morfoloji Değişiklikleri rakamlarla Analitik Aracı

Bu prosedürün genel amacı, üç boyutlu konfokal floresan görüntülerden alınan tanımlanmamış şekle sahip bir hücrenin morfolojisindeki değişimleri analiz etmek ve nicelleştirmek için otomatik bir yöntem sağlamaktır. Bu işlem, öncelikle agonist ile işlem görmüş hücreleri, antagonist ile işlem görmüş ve ardından agonist uygulanmış hücreleri ve hiçbir işlem görmemiş hücreleri içeren kimyasal stimülasyon deneyinin gerçekleştirilmesiyle sağlanır. Ardından hücreler, immünofloresan analiz için hazırlanır.

İkinci adım, multispektral üç boyutlu floresan görüntüler elde etmektir. Ardından ameris neuroscience, ameris XT ve MATLAB bilgisayar yazılımları kullanılarak üç boyutlu morfometrik analiz gerçekleştirilir. Son adım olarak, üç boyutlu morfometrik analiz yoluyla görselleştirilen tek hücre fenotipik değişiklikleri analiz edilir ve nicelleştirilir.

Nihayetinde, bu yazılım platformu reseptör aktivasyonunu takiben hücre şeklindeki değişimleri nicelleştirmek için kullanılır ve ilaç keşfi için ek bir araç sağlar. Genel olarak, biyolojik sistemler konusunda standart uzmanlığa sahip olan araştırmacılar, bilgisayar uygulamalarına aşina olmayabilirler. I 60 modülündeki bu protokol, bu prosedürün başlangıcından önce görselleştirme ile bilgisayar dili arasındaki boşluğu doldurmaktadır.

Yazılı protokolde belirtildiği üzere, insan embriyonik böbrek hücrelerini hemaglutinin etiketli kortikotropin salgılatıcı faktör reseptör iki veya CRF R iki ile transfekte edin. CFR iki, bir G proteini kenetli reseptör veya GPCR'dir. Transfeksiyondan bir gün sonra lamel camları alevle sterilize edin ve altı kuyucuklu bir plakaya yerleştirin.

Beş miligram liyofilize polilizin içeren bir şişeye 10 mililitre PBS ekleyin ve karıştırın. Ardından, çözünmüş polilizinin beş mililitresini 500 mililitre PBS ile seyreltin ve bu karışımdan ikişer mililitreyi her bir lamelin üzerine ekleyin. Lamellerin bulunduğu plakayı 20 dakika boyunca oda sıcaklığında bekletin. 20 dakika sonra, lamellere iki mililitre PBS ekleyip ardından uzaklaştırarak lamelleri yıkayın; bu işlemi iki kez tekrarlayın.

İki mililitre %10 FBS içeren DMEM besiyerinin eklenmesinin ardından, lamellere iki ila beş damla hücre ekleyin. Hücreler, %60 konfluens sağlamak için gerekli konsantrasyonda olmalıdır. Ertesi gün.

Hücreleri bir gece boyunca 37 °C'de inkübe edin. Ertesi gün, agonist tedavisi için hücrelerin %60 konfluense ulaştığını kontrol edin. Belirlenen hücreleri, mevcut medyumu CRF R2 endojen ligandı olan bir µM konsantrasyonda kortikotropin salgılatıcı faktör eklenmiş iki mL medyumla değiştirerek stimüle edin.

Hücrelerin antagonist ile ön işlemden geçirilmesi için hücreleri 37 °C'lik bir inkübatörde 30 dakika inkübe edin. Besiyerini, 1 µM konsantrasyonda seçici CFR iki antagonist anti salvaging 30 ile desteklenmiş iki mL besiyeri ile değiştirin. Hücreleri 37 °C'lik bir inkübatörde 30 dakika inkübe edin.

Antagonist uygulamasından sonra. İşlem görmemiş hücreler için hücreleri agonist CRF ile stimüle edin ve 37 °C'de 30 dakika boyunca inkübe edin. Uygulamanın ardından medyayı iki mililitre taze medya ile değiştirin.

37 °C'de 60 dakikalık inkübasyonun ardından, her kuyucuktaki medyayı iki mililitre taze medya ile değiştirin ve bine bir oranında seyreltilmiş anti HHA ekleyin. Medyayı aspire edin ve her kuyucuğa iki mililitre fiksatif ekleyin. Fiksatifi aspire ettikten sonra plakayı oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin.

Hücreleri tris tamponlu salin ile üç kez yıkayın. Her bir lamın üzerine 100 µL bloklama çözeltisi ekleyin ve oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inkübe edin. Ardından, kuyucuklardaki mevcut bloklama çözeltisini aspire edin ve her bir lamın üzerine 100 µL taze sekonder antikor kokteyli ekleyerek oda sıcaklığında ve karanlıkta 45 dakika inkübe edin; ardından, çözeltiyi kuyucuğun yan duvarından nazikçe ekleyip çıkararak TBSC ile dört kez yıkayın ve son yıkama çözeltisi içerisindeyken işlemi tamamlayın.

Her bir lamel, bir iğne ve kavisli pens yardımıyla kaldırın. Lamel üzerindeki hücrelerin aşağı bakacak şekilde, bir damla vector shield montaj medyumu bulunan bir lam üzerine yerleştirin, oje ile sabitleyin ve 15 ila 20 dakika kurumaya bırakın. CFR2'yi görüntülemek için Alexa 488 nanometre konjuge fare antikoru, çekirdekleri görüntülemek için ise DAPI kullanılır; mitotik evreye başlamak için fikse edilmiş hücreleri bir floresan mikroskoba monte edin. Deneysel öznelliği sınırlamak için, görüntüler elde edilip analiz edilene kadar deneysel koşulları gizli tutun ve görüntüleri edinin.

Zeiss LSM 510 Meta konfokal mikroskobun coherent entegre iki foton lazer sistemiyle birlikte kullanımında, 63x büyütmeli ve 1.4 sayısal açıklıklı DIC objektifi ile plan acro mat yağ daldırma objektifi kullanılmıştır. Veri toplama işlemi sırasında, nükleer membrandan dış hücre dışı reseptör uçlarına kadar olan verileri kapsayacak şekilde, hücreleri hem çok kanallı hem de c bölümlendirme yöntemiyle kompartmanlara ayırın. Floresan verilerini, 3D mikroskopi veri setinin görselleştirilmesine ve segmentasyonuna olanak tanıyan Amaris kullanarak işleyin. Amaris tarafından tasarlanan algoritmayı takip ederek, öncelikle nükleer membranı temsil etmek için yüzey oluşturma (surface rendering) özelliğini kullanın.

Amaris, ilgi bölgesinde (ROI) birden fazla çekirdek olup olmadığını belirleyecektir. Ardından, CFR two uzantı noktalarını konumlandırmak için nokta oluşturma algoritmasını kullanın. Amorf şekilli hücrelerin karmaşık ağındaki arka plan gürültüsünü ve düzensiz yoğunluğu telafi ederek CFR two'nun her bir floresan tespit biriminin dahil edilmesini maksimize etmek için, nokta çapını görüntüdeki en küçük birim olan 0.2 µm olarak ayarlayın.

Bu, ölçülen bir yoğunluk şeklinde belirgin bilgilerin ekstrapolasyonuna olanak tanır. Bir Gaussian filtresi kullanarak, spotların otomatik oluşturma sürecine spot filtrelemeyi dahil edin. Veri kaybını önlemek için veri setini sekiz bitlik sabit noktadan 32 bitlik float formatına dönüştürün.

Oluşturulan yüzeyi seçin ve çekirdek zarını referans noktası olarak kullanarak bir mesafe dönüşümü gerçekleştirip çekirdek yüzeyinin dışındaki her bir noktanın kesin uzaysal konumunu belirleyin. MATLAB ile entegre ameris XT modülünü kullanarak voksel yoğunluğu verilerini nokta koordinatları verileriyle değiştirin. Noktaları seçin ve istatistik türü kısmından istatistiksel kodlamayı seçin.

Oluşturulan yeni kanalda bildirilen yoğunluk merkezini seçin. Görüntüleme için istenen rengi yükleyin ve analiz için renk haritası aralığını ayarlayın. Sayısal veriler istatistik sekmesinde görselleştirilebilir ve GraphPad prism kullanılarak excel'e aktarılabilir.

Elde edilen verileri nicelleştirin ve istatistiksel analiz için grafik formatında sunun. Gruplar arasındaki karşılaştırmaları iki yönlü ANOVA ve Bonferroni sonrası testi kullanarak gerçekleştirin; verileri ortalama artı veya eksi standart sapma şeklinde sunun. Bu yaklaşımın gücünü göstermek için, G-proteini kenetli reseptörlerin ve kortikotropin salgılatıcı faktör reseptör iki'nin endojen ligandı CRF ile etkileşimi sonucunda ortaya çıkan hücresel değişiklikleri inceleyin.

Transfekte edilmiş HT K 2 93 hücrelerinde nicelleştirme yapılmış; birleştirilmiş görüntüler, Alexa 4 88 konjuge anti-fare sekonder antikor ve çekirdekleri görüntülemek için DPI kullanılarak görselleştirilmiştir. Sonuçlar, CRF R iki reseptörlerinin plazma membranında yer aldığını ve hücre membranının belirli bölgelerinden dışarı doğru uzandığını ortaya koymaktadır. Konvansiyonel 2D analiz kullanılarak, hücre dışı CRF R iki reseptörlerinin bu alt kümesi ancak cam lam üzerindeki reseptör yapışma noktaları analiz edildiğinde tespit edilebilmektedir.

Sonuç olarak, ZS üst üste binmiş MULTISPEKTRAL verilerden elde edilen diğer tüm bilgiler kaybolur. Sonuç, hiçbir işlem uygulanmamış grup ile agonist arasında fark olmadığını göstermiştir. Hücreler CRF ile işlendiğinde reseptör yapışma noktaları dramatik şekilde farklılaşırken, noktaların plazma membranına olan uzaklığındaki azalmanın gösterdiği üzere, hücre dışı reseptörler büyük oranda azalmıştır.

Ayrıca, öncelikle sınırlı bölgelerden bir dizi ayrı bölgeye yeniden dağılırlar. CRF'nin reseptör membran dağılımı üzerindeki etkisi, CR2 spesifik antagonistleri ile ön işlem uygulanarak önlenir. 30 30.

Bu koşullar altında, CRFR'nin iki uzantısı CRF tedavisiyle değişmemektedir. Voksellerin nükleer membrandan olan uzaklığını görselleştirmek için, beş mikrometrelik spektrum renk kodlu aralıklarla çizilen lekelerin distal dağılımı kullanılmıştır. Tedavi uygulanmayan grup ile agonist tedavisi öncesi antagonist ön tedavisi uygulanan grup arasında GPCR kontraksiyonunda anlamlı bir fark görülmemiştir.

Hücrelerin agonist CRF ile tedavisi, tedavi uygulanmayan veya antagonist As ile ön işlem yapılmış hücrelerle karşılaştırıldığında, CRF2 içeren voksel sayısını kademeli olarak azaltır. Bu teknik, kantitatif görüntüleme tekniği alanındaki araştırmacıların çok sayıda tek hücre fenotipik değişikliğini keşfetmelerine ve karakterize etmelerine yol açarak, bu hücre tabanlı analizi ilaç keşif süreci için ek bir tek hücre profilleme aracı haline getirmiştir.