Üç boyutlu Floresans Images Hücresel Morfoloji Değişiklikleri rakamlarla Analitik Aracı

Bu prosedürün genel amacı, üç boyutlu konfokal floresan görüntülerden alınan tanımsız bir şekil hücresinin morfolojisindeki değişiklikleri analiz etmek ve ölçmek için otomatik bir yöntem sağlamaktır. Bu, önce agonist hücrelerle tedavi edilen, antagonistle tedavi edilen hücreleri, ardından agonist ve tedavi edilmeyen hücreleri içerecek şekilde kimyasal stimülasyon deneyinin gerçekleştirilmesiyle gerçekleştirilir. Hücreler daha sonra immünofloresan analizi için hazırlanır.

İkinci adım, çok spektral üç boyutlu floresan görüntüler elde etmektir. Daha sonra ameris neuroscience, ameris XT ve MATLAB bilgisayar yazılımı kullanılarak üç boyutlu morfometrik analiz yapılmıştır. Üç boyutlu morfometrik analiz ile görselleştirilen tek hücreli fenotipik değişiklikler daha sonra analiz edilir ve son adım olarak niceliksel olarak ölçülür.

Sonuç olarak, bu yazılım platformu, reseptör aktivasyonunu takiben hücre şeklindeki değişiklikleri ölçmek için kullanılır ve ilaç keşfi için ek bir araç sağlar. Genel olarak, araştırmacı biyolojik sistem konusunda standart bir uzmanlığa sahiptir, bilgisayar uygulamalarına aşina olmayabilir. I 60 modülündeki bu protokolde, bu prosedür başlamadan önce de görselleştirme ve bilgisayar dili arasındaki boşluğu doldurun.

Yazılı protokolde atıfta bulunulduğu gibi hemaglutinin etiketli kortikotropin salma faktörü reseptörü iki veya CRF R iki ile insan embriyonik böbrek hücrelerini transfekte edin. CFR iki, bir G proteinine bağlı reseptör veya GPCR'dir. Transfeksiyondan sonraki gün alev kapağı kayar ve bunları altı kuyulu bir plakaya yerleştirin.

Beş miligram liyofilize polilisin içeren bir şişeye 10 mililitre PBS ekleyin ve karıştırın. Daha sonra beş mililitre çözünmüş polilisini 500 mililitre PBS içinde seyreltin ve kapak fişlerinin her birine iki mililitre karışım ekleyin. Plakayı kapak fişleri ile birlikte oda sıcaklığında 20 dakika bekletin 20 dakika sonra, iki mililitre PBS ekleyerek ve ardından çıkararak kapak fişlerini yıkayın, bu işlemi iki kez tekrarlayın.

% 10 FBS ortamı ile iki mililitre DMEM baskısının ardından, kapak fişlerine iki ila beş damla hücre ekleyin. Hücreler, %60 co akıcılığı elde etmek için gerekli konsantrasyonda olmalıdır. Ertesi gün.

Hücreleri ertesi gün gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Agonist tedavisi için hücrelerin %60 oranında birleştiğini kontrol edin. Bir mikromolar konsantrasyonda CRF R iki endojen ligand kortikotropin salma faktörü ile desteklenmiş iki mililitre medya ile ortamı değiştirerek belirlenen hücreleri uyarın.

Hücrelerin antagonist ile ön işleme tabi tutulması için hücreleri 37 santigrat derece inkübatörde 30 dakika inkübe edin. Ortamı, bir mikromolar konsantrasyonda seçici CFR iki antagonist anti kurtarma 30 ile desteklenmiş iki mililitre ortamla değiştirin. Hücreleri 37 derecelik bir inkübatörde 30 dakika inkübe edin.

Antagonist tedavisinden sonra. Hücreleri agonist CRF ile uyarın ve tedavi edilmemiş hücreler için 30 dakika boyunca 37 santigrat derece inkübe edin. İşlemden sonra ortamı iki mililitre taze ortamla değiştirin.

Her bir oyuktaki ortamı iki mililitre taze ortamla değiştirin ve 37 santigrat derecede 60 dakikalık bir inkübasyonun ardından bir ila bin oranında seyreltilmiş anti HHA ekleyin. Ortamı aspire edin ve her birine iki mililitre sabitleyici ekleyin. Fiksatifi aspire ettikten sonra plakayı oda sıcaklığında 20 dakika boyunca inkübe edin.

Hücreleri üç kez tris puffered salin ile yıkayın. Çakır. Her kapağın üzerine 100 mikrolitre kan solüsyonu ekleyin, kaydırın ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. Daha sonra mevcut blotto solüsyonunu kuyucuklardan aspire edin ve oda sıcaklığında karanlıkta dört kez inkübasyonun ardından her bir kapak fişine 100 mikrolitre taze ikincil antikor kokteyli ekleyin, TBSC ile dört kez yıkayın

Her kapak fişini bir iğne ve kavisli forseps ile alın. Kapak kayma hücrelerini, oje ile dappy fix ile bir damla vektör kalkanı montaj ortamı ile bir slayt üzerine aşağı bakacak şekilde yerleştirin ve 15 ila 20 dakika kurumasını bekleyin. Alexa, 4 88 nanometre konjuge ilham perisi antikoru, CFR iki'yi görselleştirmek için kullanılır ve DAPI, deneysel öznelliği sınırlamak için fiks hücreleri bir floresan mikroskoba monte etmeye başlamak için çekirdek mitotik aşamasını görselleştirmek için kullanılır, deneysel koşulları görüntüler elde edilene ve görüntüler elde etmek için analiz edilene kadar bilinmez tutar.

Tutarlı bir entegre iki foton lazer sistemine bağlı zeis LSM beş 10 meta konfokal mikroskop ile birlikte 63 x büyütme ve 1.4 sayısal açıklığa sahip bir plan acro mat yağı, DIC objektifi kullanıldı Veri toplama işlemi sırasında, hücreleri hem çok kanallı hem de c bölümleme ile bölümlere ayırın nükleer zardan dış hücre dışı reseptör ekstremitelerine kadar olan verileri dahil etmek için. Floresan verilerini, bir 3D mikroskopi veri kümesinin görselleştirilmesine ve segmentasyonuna izin veren amris'i kullanarak işleyin. İlk olarak Amaris tarafından tasarlanan algoritmayı takiben, NU nükleer zarını temsil etmek için yüzey oluşturmayı kullanın.

Amaris, ilgilenilen bölgede birden fazla çekirdek olup olmadığını veya ROI olup olmadığını belirleyecektir. Ardından, CFR iki uzatma noktasını bulmak için nokta oluşturma algoritmasını kullanın. CFR iki'nin her bir floresan algılama biriminin dahil edilmesini en üst düzeye çıkarmak için karmaşık amorf şekilli hücre ağının arka plan gürültüsünü ve düzensiz yoğunluğunu telafi eder, nokta çapını görüntüdeki en küçük birim olan 0,2 mikrometreye ayarlar.

Bu, farklı bilgilerin ölçülen bir yoğunluk biçiminde ekstrapolasyonuna izin verir. Bir Gauss filtresi kullanarak, spotun otomatik oluşturma sürecine spot filtrelemeyi dahil edin. Veri katyonunu önlemek için, veri kümesini sekiz bitlik sabit noktadan 32 bitlik float'a dönüştürün.

Oluşturulan yüzeyi seçin ve nükleer zarı referans noktası olarak kullanarak bir mesafe dönüşümü gerçekleştirerek nükleer yüzeyin dışındaki her bir noktanın tam uzamsal konumunu belirleyin. MATLAB ile arayüzlü ameris XT modülünü kullanarak voksel yoğunlukları verilerini spot koordinat verilerine dönüştürün. Noktaları seçin ve istatistiksel türde kodlanmış istatistiksel seçin.

Oluşturulan yeni kanalda bildirilen yoğunluk merkezini seçin. Görüntülemek için istediğiniz rengi yükleyin ve analiz için renk haritası aralığını ayarlayın. Sayısal veriler istatistiksel sekmede görselleştirilebilir ve GraphPad prizması kullanılarak excel'e aktarılabilir.

Elde edilen verileri nicelleştirin ve istatistiksel analiz için grafik formatta sunun. İki yönlü Inova ve Bonferroni son test kullanarak gruplar arasında karşılaştırmalar yapın, verileri ortalama artı veya eksi standart sapma olarak sunun. Bu yaklaşımın gücünü göstermek için, G-proteinine bağlı reseptörlerin ve kortikotropin salgılayan faktör reseptörü iki'nin endojen ligand CRF ile etkileşiminden kaynaklanan hücresel değişiklikler.

Transfekte edilmiş HT K 2 93 hücrelerinde nicelik belirlendi, birleştirilmiş görüntüler, çekirdekleri görselleştirmek için Alexa 4 88 konjuge, anti fare, ikincil antikor ve DPI kullanılarak görselleştirildi. Sonuçlar, CRF R'nin iki reseptörünün plazma zarında bulunduğunu ve hücre zarının sonlu bölgelerinden çıkıntı yaptığını ortaya koymaktadır. Konvansiyonel 2D analiz kullanılarak, hücre dışı CRF R iki reseptörünün bu alt kümesini tespit etmek, ancak cam kapaklar üzerindeki reseptör yapışma noktaları analiz edilirse mümkündür.

Sonuç olarak, ZS yığılmış MULTİSPEKTRAL verilerinden elde edilen diğer tüm bilgiler kaybolur. Sonuç, tedavi olmaması ve agonist arasında bir fark seçmedi. Hücreler CRF ile tedavi edildiğinde reseptör yapışma noktaları önemli ölçüde farklı olsa da, hücre dışı reseptörler, lekelerin plazma zarından uzaklığındaki azalma ile gösterildiği gibi büyük ölçüde azalır.

Ayrıca, öncelikle sonlu konumlardan bir dizi gizli konuma yeniden dağıtılırlar. CRF'nin reseptör membran dağılımı üzerindeki etkisi, CR iki spesifik antagonisti ile ön muamele ile önlenir. 30 30.

Bu koşullar altında, CRFR'nin iki uzantısı CRF tedavisi ile değişmez. Beş mikrometre spektrumlu renk kodlu aralıklarla çizilen noktaların distal dağılımı, voksellerin nükleer zardan uzaklığını görselleştirmek için kullanılır. Agonist tedavisinden önce hiçbir tedavi ve antagonist ön tedavisi GPCR kontraksiyonunda anlamlı bir fark göstermedi.

Hücrelerin agonist CRF ile tedavisi, tedavi edilmediğinde veya hücrelerle karşılaştırıldığında, iki voksel içeren CFR sayısını aşamalı olarak azaltır. Antagonist ile ön muamele Gelişiminden sonra olduğu gibi. Bu teknik, niceleme görüntüleme tekniği alanındaki araştırmacıların çok sayıda tek hücreli fenotipik değişikliği keşfetmesine ve karakterize etmesine yol açtı ve bu hücre bazlı testi, ilaç keşif süreci için ek bir tek hücre profilleme aracı haline getirdi.