Bölünmüş Brokoli RNA Raporlayıcıları Kullanılarak In vitro RNA Kümelerinde Moleküller arası RNA Eşleşmesinin Görselleştirilmesi ve Nicelendirilmesi
29 Mayıs 2026
Bu protokol, RNA kümelerinde moleküller arası baz eşleşmesini in vitro tespit etmek ve nicelendirmek için bölünmüş Brokoli RNA raporlayıcıları kullanılarak görsel bir testi tanımlar.
RNA kümelerinde moleküller arası baz eşleşmesini in vitro tespit etmek ve nicelendirmek için split brokoli RNA raporlayıcı testini uygularız. Kimyasal araştırma ve simülasyonlar RNA etkileşimlerini önerir ancak doğrudan ölçülemez. Bu protokol, RNA kümeleri içinde doğrudan ve doğru değerlendirmeyi mümkün kılar.
DNA şablonlarını in vitro RNA transkripsiyonu için hazırladıktan sonra, çalışma yüzeyi, tüp rafları ve pipetleri ribonükleaz dekontaminasyon çözeltisi ile silin. Tüm pipetleme adımlarında ribonükleaz içermeyen filtrelenmiş uçlar kullanın. Transkripsiyon kiti ile birlikte verilen reaksiyon tamponu ve nükleotid çözeltilerini, uridin trifosfat Siyanin 5 veya UTP-Cy5 ile birlikte buz üzerinde eritin.
Tüm tüpleri 2.000g ile iki saniye boyunca santrifüjleyin. Sonra DNA'daki timin bazlarının sayısını hesaplayın. 20 mikrolitrelik bir transkripsiyon reaksiyonu için gerekli UTP ve UTP-Cy5 hacimlerini belirleyin, aynı zamanda RNA türleri arasında tutarlı etiketleme yoğunluğunu koruyun.
Sonra, sunulan reaktifleri birleştirerek 20 mikrolitrelik bir transkripsiyon reaksiyonu hazırlanır. Pipetle yukarı aşağı iyice karıştırın ve 2.000g ile iki saniye boyunca santrifüj yapın. Reaksiyonu 37 derece Celsius'ta altı saat kuluçka ettikten sonra, kit ile birlikte verilen bir mikrolitre deoksiribonükleaz ekleyin, pipetle iyice karıştırın ve tekrar santrifüj yapın.
Sonra 37 derece Celsius'ta ek 15 dakika kuluçka yapın. Reaksiyonu 1,5 mililitrelik bir tüpe aktarın. Kitle birlikte verilen 115 mikrolitre nukleazsız su ve 15 mikrolitre amonyum asetat durdurma çözeltisi ekleyin.
Karıştırdıktan sonra, çözeltiyi 2.000g ile iki saniye boyunca santrifüjle yapın. Sonra, tüpe 150 mikrolitre fenol klorofom ekleyin ve fazları birleştirmek için nazikçe karıştırın. 16.000g sıcaklıkta, dört derece Celsius'ta 10 dakika boyunca santrifüj yapın.
Sonra üst sulu fazı yeni bir tüpe aktarın. Transfer edilen çözeltiye eşit miktarda kloroform ekleyin ve doğru faz etkileşimini sağlamak için iyice karıştırın. Şimdi 16.000g sıcaklığında dört derece Celsius'ta iki dakika boyunca santrifüj yapın ve faz ayırma işlemini bir kez daha tekrarlayın.
Daha sonra yaklaşık 100 ila 150 mikrolitre kadar sulu tabakayı yeni bir tüpe aktarın. 900 mikrolitre izopropanol ekleyin ve iyice karıştırın. Çözeltiyi ayrı tüplerde alikot ettikten sonra, örnekleri gece boyunca veya en fazla bir ay boyunca eksi 20 derece Celsius sıcaklıkta saklayın.
RNA örneğini izopropanolde 16.000g sıcaklıkta, dört derece Celsius'ta 15 dakika boyunca santrifüjlenin. İzopropanolu dikkatlice RNA pelletini rahatsız etmeden çıkarın. Sonra pelete nükleaz içermeyen suda hazırlanmış %70 etanolden bir mililitre ekleyin.
16.000g ile dört derece Celsius'ta iki dakika boyunca santrifüj yapın. Etanol çıkarıldıktan sonra, tüpe nükleaz içermeyen suda hazırlanmış %70 etanol bir mililitre ekleyin ve santrifüjasyonu tekrarlayın. Son etanol yıkama sırasında, etanolün çoğunu 1.000 mikrolitrelik pipet ile çıkarın.
Kısa süreliğine 2.000g ile iki saniye boyunca bir tezgah üstü mini santrifüjde santrifüj yapın ve kalan etanolü 20 mikrolitrelik pipet ile çıkarın. RNA pelleti kurutulduktan sonra, onu 20 mikrolitre nukleazsız suya yeniden süsle getirin. Örneği buz üzerinde tutun ve ışıktan koruyun.
Mikro hacim spektrofotometresi kullanılarak RNA konsantrasyonu ve saflığını ölçebilirsiniz. 260 üzerinde 280 nanometrede absorbans oranının yaklaşık 2.0 ve 260 üzerinde 230 nanometrede oranın 2.0'dan büyük olduğundan emin olun. 100 milimolar spermin çözeltisi ve %50 polietilen glikol 8.000 içinde bir tüpü buz üzerinde eritin.
Gösterilen bileşenleri birleştirerek 10X RNA yeniden katlama tamponunu taze hazırlayın. Bileşenler pipetle iyice karıştırdıktan sonra, 2.000g boyunca iki saniye boyunca bir tezgah üstü mini santrifüjde santrifüj yapın. Birlikte katlanma durumu için, 200 mikrolitrelik bir PCR tüpünde, üst veya alt diziyi taşıyan in vitro transkripsiyonlu RNA, RNA yeniden katlama tamponu ve nükleaz içermeyen su birleştirin.
Daha önce gösterildiği gibi pipetle yukarı aşağı ve santrifüj yaparak iyice karıştırın. Örneği 90 derece Celsius'ta iki dakika ısıtın. Numuneyi hemen oda sıcaklığına aktarın.
Işığa karşı korun ve bir saat kuluçka için. Ayrı katlama koşulları için, RNA örneğini 200 mikrolitrelik bir PCR tüpünde ısıtın ve ardından hemen en az 15 dakika buzun üzerine koyun. 200 mikrolitrelik bir PCR tüpünde, üst veya alt diziyi taşıyan in vitro transkripsiyonlu RNA, 10 kez RNA yeniden katlama tamponu ve nükleaz içermeyen su birleştirin.
Reaksiyonu oda sıcaklığında, ışıktan korunarak 30 dakika kuluçka edin. Şimdi üst ve alt dizileri içeren RNA örneklerini tek bir PCR tüpünde birleştirin ve pipetle yukarı aşağı iyice karıştırın. Santrifüj, 2.000g ile iki saniye boyunca bir tezgah üstü mini santrifüjde koyun.
Oda sıcaklığında 30 dakika kuluçka yapın. Her iki durumda da, 100 milimolar spermin ve %50 polietilen glikol 8.000 içeren bir ila iki premiksin altı mikrolitre ekleyin. İçerik karıştıktan sonra, 2.000g ile iki saniye boyunca bir tezgah üstü mini santrifüjde santrifüj yapın.
Şimdi reaksiyona iki mikrolitre bir milimolar DFHBI-1T karıştırın ve tekrar santrifüj yapın. Reaksiyonu cam odalı bir kapak camına yükleyin. Buharlaşmayı en aza indirmek için odayı oda sıcaklığında, kapağı üzerlikte dört saat boyunca kuluçkaya geçirin.
Cam odalı kapak camını mikroskop aşamasına yükleyin. Lazeri açın, sonra göz merceklerini kullanarak örneği bulup üzerine odaklanın. Mikroskobu ilgi gören her bölgeyi önce her Z düzleminde siyanin 5 kanalıyla görüntüleyecek şekilde yapılandırın.
Sonra aynı ilgi alanını yeşil floresan protein kanalıyla görebilirsiniz. Tüm kanallar için pozlama süresini 500 milisaniyeye ayarlayın. Sonra lazer gücünü yeşil floresan protein kanalı için %80, siyanin 5 kanalı için %40 olarak ayarlayın.
150 nanometrelik Z adım boyutu kullanılarak, reaksiyon damlasının dışındaki bir örtü kayma bölgesini oda sıcaklığında görebilirsiniz. Daha sonra, görüntü analiz yazılımı kullanarak moleküller arası baz eşleşmesini nicelikle ölçün. RNA kümelenmesinin indüklenmesinde, her iki RNA da tek tek ya da birlikte küme oluştururdu.
RNA kümeleri içindeki DFHBI-1T floresansı, sadece üst veya alt RNA'lar için birlikte katlanma durumuna kıyasla önemli ölçüde daha düşüktü. Ayrı katlanma durumunda, normalleştirilmiş DFHBI-1T sinyali 0.031 idi; bu, sadece üst veya alt seviyede gözlemlenen temel seviyelerle karşılaştırılabilir. Shu-top, shu-bottom, shu-anti-top ve shu-anti-bottom bireysel olarak minimal DFHBI-1T floresansı göstermiştir.
shu-top'un shu-bottom ile veya shu-anti-top'un shu-anti-bottom ile birlikte katlanması, ayrı katlamadan daha yüksek DFHBI-1T sinyali üretti. Shu-üst ve shu-bottom'un birlikte katlanması, normalleşmiş DFHBI-1T floresansında 5,63 kat artışa yol açmıştır. Shu-üst ve shu-bottom'un ayrı katlanmasında, başlangıç seviyelerine kıyasla sadece 1,04 kat artış görüldü.
Shu-top, shu-anti-bottom ve shu-anti-top ile shu-bottom karışımı, her iki katlanma koşullarında da aynı yönelimli çiftlere göre daha yüksek DFHBI-1T floresansı göstermiştir. shu-top'un shu-anti-bottom ve shu-anti-top ile shu-bottom ile birlikte katlanması DFHBI-1T floresansında sırasıyla 61,86 ve 82,60 kat artışa yol açmıştır. Bu karışık çiftlerin ayrı katlanması sırasıyla 2,69 ve 4,94 kat daha küçük artışlar sağladı.
En önemli husus, sağlam sinyal üretiminin sıkıştırma reaktifleri gerektirebileceği, hassasiyetin ise bölünmüş brokoli RNA'larının verimli dimerizasyonu ve katlanmasına bağlı olmasıdır. Bu test, RNA kümelerinde moleküller arası baz eşleşmesini incelemek için RNA aşağı çekilme ve jel elektroforezi yaklaşımlarını tamamlar. Bu test, RNA dizilerinin, helikazların ve iyonların RNA kümeleri içindeki moleküller arası baz eşleşmesi üzerindeki etkilerini inceleyebilir.
Overview
This article presents a protocol for directly detecting and quantifying intermolecular base pairing in RNA clusters in vitro using a split Broccoli RNA reporter assay. The method leverages fluorescently labeled RNAs and a split aptamer system to visualize and measure RNA–RNA interactions, providing a quantitative alternative to chemical probing and computational predictions.
Key Study Components
Area of Science
- Molecular biology
- RNA biochemistry
- Fluorescence microscopy
Background
- RNA clustering is driven by multivalent intermolecular RNA–RNA interactions.
- Traditional methods like chemical probing and computational simulations infer but do not directly measure these interactions.
- Direct assessment of intermolecular base pairing within RNA clusters has been limited.
- The split Broccoli RNA aptamer system enables fluorescence-based detection of RNA dimerization.
Purpose of Study
- To develop and demonstrate a visual assay for direct detection of intermolecular base pairing in RNA clusters.
- To quantify how in vitro clustering conditions affect RNA–RNA interactions.
- To provide a complementary approach to existing RNA interaction assays.
Methods Used
- Preparation of DNA templates and in vitro transcription of RNAs labeled with Cy5.
- Purification of transcribed RNAs using phenol-chloroform extraction and ethanol precipitation.
- Folding of RNAs under co-folding and separate folding conditions with crowding reagents (spermine, PEG 8000).
- Assembly of split Broccoli RNA reporters and addition of DFHBI-1T fluorophore.
- Fluorescence imaging using confocal microscopy and quantitative image analysis.
Main Results
- DFHBI-1T fluorescence was substantially higher in co-folded RNA samples compared to separately folded or single RNA controls.
- Co-folding of complementary split Broccoli RNAs resulted in up to 82.6-fold increases in fluorescence, indicating robust intermolecular base pairing.
- Mixed orientation pairs (shu-top with shu-anti-bottom, etc.) showed the highest fluorescence increases upon co-folding.
- Robust signal generation depended on crowding reagents and efficient RNA dimerization.
Conclusions
- The split Broccoli RNA reporter assay enables direct, quantitative assessment of intermolecular base pairing in RNA clusters.
- This method complements traditional RNA interaction assays such as pull-downs and gel electrophoresis.
- The assay can be used to study the effects of RNA sequence, helicases, and ions on RNA–RNA interactions in vitro.
Frequently Asked Questions
Executive Industry Relevance
Direct quantification of intermolecular RNA base pairing in vitro addresses a critical gap in early discovery, enabling mechanistic de-risking of RNA-driven clustering phenomena. The split Broccoli RNA reporter assay provides a quantitative, fluorescence-based readout for RNA–RNA interactions, supporting predictive confidence in target validation and assay development. This capability enhances portfolio triage by clarifying the molecular basis of RNA clustering under defined conditions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of RNA–RNA interaction hypotheses within clustered assemblies.
- Supports mechanistic de-risking by distinguishing specific intermolecular base pairing from background association.
- Provides quantitative data to inform target validation and early-stage portfolio decisions.
Screening & Assay Development
- Facilitates preparation of validated RNA cluster systems for downstream screening workflows.
- Delivers standardized, reproducible fluorescence outputs for assay benchmarking.
- Enables reliable evaluation of sequence, helicase, or ionic effects on RNA–RNA interactions.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant RNA clustering models when mechanistic continuity is required.
- Supports risk-adjusted advancement by providing quantitative, comparative readouts across experimental conditions.
- Offers predictive de-risking for RNA-targeted therapeutic strategies.
Pipeline & Workflow Integration
This assay integrates into the discovery continuum from hypothesis-driven target validation through assay development and preclinical mechanistic studies.
- Discovery Biology: Quantifies direct intermolecular base pairing, clarifying RNA clustering mechanisms.
- Screening: Provides reproducible, quantitative fluorescence outputs for comparative analysis.
- Analytics: Enables statistical comparison of folding conditions and sequence variants using normalized fluorescence measurements.
- Translational Research: Supports continuity by modeling RNA–RNA interactions relevant to disease or therapeutic context.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform for diverse RNA interaction studies across programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in RNA clustering studies.
- Operational Value: Standardizes detection and quantification of RNA–RNA interactions for scalable workflows.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and reduces late-stage biological risk for RNA-targeted assets.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization based on direct, quantitative mechanistic data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in RNA biochemistry and fluorescence microscopy.
- Needs access to confocal imaging and quantitative image analysis infrastructure.
- Demands rigorous cross-team standardization of RNA preparation and folding protocols.
- May require adaptation for different RNA sequences or clustering models.
- Sensitivity depends on efficient dimerization and folding of split Broccoli RNAs and use of crowding reagents.
