Kütle spektrometresi tabanlı kimlik RNA-bağlama bölgelerinin için numune hazırlama

Bu prosedürün genel amacı, canlı hücrelerdeki RNA bağlayıcı proteinleri tanımlamak ve UV aracılı foto çapraz bağlama ve ardından kütle spektrometresi kullanarak RNA bağlanma bölgelerini haritalamaktır. Bu yöntem, hangi epigenetik düzenleyicilerin RNA'ya bağlı olduğu ve etkileşimler için hangi protein bölgelerinin gerekli olduğu gibi epigenetik alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, protein RNA komplekslerinin saflaştırılmasını içermemesi ve bu nedenle çok az malzeme gerektirmesi ve herhangi bir RNA tipine bağlı proteinleri tanımlamasıdır.

Sunulduğu gibi, bu yöntem nükleer proteinlere odaklanmaktadır, çünkü bu bizim bilimsel ilgi alanımızdır, ancak fraksiyonlama adımlarındaki küçük değişikliklerle, diğer stu-nu-lar bölmelerdeki RNA ve bağlayıcı proteinleri incelemek için kullanılabilir. Fare ESC'lerini metin protokolüne göre kültürledikten ve genişlettikten sonra, hücreleri gerekli sayıda 10 santimetrelik plakaya genişletin. Plakalar birleşmeye ulaşmadan önce, 500 mikro azı dişinin nihai konsantrasyonuna kadar doğrudan ortama dört SU ekleyin.

4sU kontrol kaplarını tedavi edilmeden bırakın. 4sU'yu ortam boyunca homojen bir şekilde dağıtmak için plakaları hafifçe sallayın, ardından plakaları iki saat boyunca aynı doku kültürü inkübatörüne geri koyun. 4sU dahil etmesinin verimliliği hücre tiplerine göre değişir ve bu nedenle verimli çapraz bağlanmayı sağlamak ve toksisiteyi en aza indirmek için konsantrasyonunu ve inkübasyon süresini optimize etmek gerekebilir.

Ardından, plakaları bir buz kovasına aktarın ve ortamı atın. Ardından, plakaları nazikçe durulamak için 5 mililitre buz gibi PBS kullanın. 2 mililitre buz gibi soğuk PBS ekleyin ve kapaksız plakaları UV-B yayan ampullerle donatılmış bir çapraz bağlayıcıya yerleştirin.

Plakaları santimetre kare başına 1 Joule enerji ayarında ışınlayın. Verimli UV çapraz bağlama kritik öneme sahiptir. UV-B ışığı kullanmanızı öneririz, ancak UV-A da kullanılabilir.

Her durumda, kullanılan UV enerjisi miktarı optimize edilmeli ve PAR-CLIP veya ChIRP ile izlenebilir. Hücreleri toplamak ve bunları konik tüplerde buz gibi soğuk PBS'ye aktarmak için hücre kaldırıcılar kullanın. Daha sonra, hücreleri beş dakika boyunca 2000 kez g ve dört santigrat derecede santrifüjleyin.

Süpernatanı çıkarın ve hücre peletini 2 milimolar EDTA ve 0.2 milimolar PMSF ile beş mililitre buz gibi soğuk PBS'de yeniden süspanse edin. Bir hemositometre ile hücreleri sayın. Sırasıyla 10 santimetre ve 15 santimetre plakalardan beş ila on ve on ila yirmi milyon hücre bekleyin.

Daha sonra, hücreleri beş dakika boyunca 2000 kez g ve 4 santigrat derecede santrifüjleyin. Çekirdekleri hücrelerden izole etmek için, metin protokolünde belirtildiği gibi buz gibi soğuk tampon A hazırlayın. Kullanmadan önce, istenen miktarda tampon A'ya 0.5 milimolar DTT ve 0.2 milimolar PMSF ekleyin.Hücrelere yıkamak için 2 mililitre soğuk tampon ekleyin, ardından hücreleri 2500 kez g ve dört santigrat derecede döndürün.

Süpernatanı atın ve iyonik olmayan, denatüre olmayan bir deterjanın yüzde 0.2'si ile takviye edilmiş tampon A'yı ekleyin, ardından numuneyi beş dakika boyunca 4 santigrat derecede döndürün. Hücreleri beş dakika boyunca 2500 kez g'de döndürdükten sonra, süpernatanı çıkarın. Pelet, sitoplazmadan yoksun sağlam çekirdekler içerir.

Çekirdeği parçalamak için, tüpe 200 mikrolitre lizis tamponu ekleyin. Kromatini beş ila on saniye boyunca yüzde 50 genlik ayarında kesmek için numuneyi sonikasyon yapmak için 1/8 inçlik bir prob kullanın. Numuneyi beş dakika boyunca 12000 kez g'de döndürün ve peleti önlemek için sadece 175 mikrolitre süpernatant toplayın.

Daha sonra, protein konsantrasyonunu Bradford testi veya benzer bir teknikle ölçün. Ardından, farklı numunelerdeki proteini mililitre başına 1 miligrama veya en düşük numune konsantrasyonuna seyreltmek için lizis tamponu kullanın. Nükleer lizata 5 milimolar DTT çözeltisi ekleyin ve numuneyi oda sıcaklığında bir saat inkübe edin.

Daha sonra, taze stoktan 14 milimolar iyodoasetamid ekleyin ve lizatı oda sıcaklığında karanlıkta 30 dakika inkübe edin. Lizatı 50 milimolar amonyum bikarbonat hacminin beş katı ile seyreltin, ardından tripsin ekleyin. Numuneyi gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.

Numune başına özel yapım bir aşama ucu hazırlamak için, 200 mikrolitrelik bir pipet ucunun altına bir katı faz ekstraksiyon C18 malzemesi diski yerleştirin. C18 diskinin üzerine 50 mikrolitre Oligo R3 ters fazlı reçine ekleyin, ardından aşama ucunu bir santrifüj adaptörünün içine yerleştirin ve adaptörü 1,5 mililitrelik bir mikrofüj tüpünün içine yerleştirin. Yıkamak için uçlara 100 mikrolitre yüzde 100 asetonitril ekleyin.

Daha sonra çözücüyü çıkarmak için uçları bir dakika boyunca 1000 kez g'de santrifüjleyin. Uçları 50 mikrolitre yüzde 0.1 trifloroasetik asit veya TFA ile dengeleyin. Ardından, onları tekrar döndürün.

PH'ı 2 ila 3'e düşürmek için sindirilmiş protein örneğine yüzde 100 formik asit ekleyin. Ardından, numuneyi özel yapım bir aşama ucuna yükleyin ve numunenin tamamı uçtan geçene kadar numuneyi bir dakika boyunca 1000 kez g'de santrifüjleyin. Bağlı peptitleri 50 mikrolitre yüzde 0.1 TFA ile yıkayın.

Daha sonra, numuneyi bir dakika boyunca 1000 kez g'de döndürdükten sonra, aşama ucuna 50 mikrolitre elüsyon tamponu ekleyerek peptitleri elüte edin ve elüsyon tamponunu uçtan dışarı çıkarmak için bir dakika boyunca 1000 kez g'de santrifüjleyin. Numuneyi kurutmak için bir saat boyunca 150 kez g ve 1 ila 3 kilopaskal olarak ayarlanmış bir vakumlu santrifüj kullanın. Numuneden çapraz bağlı RNA'yı çıkarmak için, peleti 50 mikrolitre 2x nükleaz tamponunda yeniden süspanse edin.

Peptit konsantrasyonunu 280 nanometrede, mililitre peptit başına 1 miligram ve 1 A280 varsayılarak ölçün. Tüm numuneleri mililitre başına bir miligrama veya en düşük konsantrasyona ayarlamak için 2x nükleaz tamponu kullanın, ardından numune başına 50 mikrolitre su artı 1 mikrolitre yüksek saflıkta nükleazdan oluşan bir ana karışım hazırlayın. 50 mikrolitre peptit örneğini 50 mikrolitre su ve nükleaz ana karışımı ile birleştirin.

Ardından, numuneyi bir saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Son olarak, metin protokolüne göre nanosıvı kromatografisi, kütle spektrometresi ve veri işleme gerçekleştirin. Bu şekil, fare ESC'lerinden elde edilen bir RBR id sonucunun volkan grafiğini göstermektedir.

Bir RNA tanıma motifi alanıyla örtüşen peptitler mavi renktedir ve oldukça tutarlı tükenme seviyeleri gösterir. HNRNPC'den bir RNA bağlayıcı peptit kırmızı ile vurgulanmıştır. Burada, bir protein bölgesinin RNA bağlanma olasılığının bir tahmini olarak hesaplanan RBR kimlik puanlarının bir ısı haritası gösterilmektedir.

Skor, spliceozomal alt birim U1-70k'nin yüzeyine yansıtılır. Kristal yapı tarafından belirlendiği gibi, RNA temasının yakınındaki parlak kırmızı renk, protein RNA etkileşiminin doğru tanımlandığını gösterir. Bu şekilde, TET2 yeni bir RBP olarak sunulmuştur ve RNA bağlanma aktivitesi, proteinin birincil dizisi boyunca RBR kimlik skorunu çizerek bir C terminal bölgesine eşlenmiştir.

Son olarak, bu yeni RBR gereksinimi, vahşi tip dizisini kullanarak PAR-CLIP gerçekleştirilerek ve sinyali, tahmin edilen RBR'den yoksun bir mutantınkiyle karşılaştırarak doğrulanabilir. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde yapılırsa iki gün boyunca yedi ila sekiz saat içinde yapılabilir. Çapraz bağlanmadan önce, farklılaşmanın nasıl başladığı veya hücre döngüsünün RNA protein etkileşimlerini nasıl düzenlediği gibi ek soruları yanıtlamak için hücreler çeşitli tedavilerle uyarılabilir.

Bu videoyu izledikten sonra, kütle spektrometresi ile protein RNA etkileşim bölgelerini belirlemek için çapraz bağlı protein RNA kompleksleri içeren ekstraların nasıl oluşturulacağını iyi anlamış olmalısınız.