Name: Kütle spektrometresi tabanlı kimlik RNA-bağlama bölgelerinin için numune hazırlama (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 52 s
Description: Öğrenin, canlı hücrelerde RNA bağlayan proteinleri ve bağlanma bölgelerini kütle spektrometresiyle haritalama yöntemini. Fare embriyonik kök hücrelerinde UV fotokrosbağlama kullanarak epigenetik düzenleyicilerin RNA etkileşimlerini inceleyin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

R.B. Searle bilim programı, WW Smith Vakfı (C1404) ve Mart Dimes Vakfı (1-FY-15-344) tarafından desteklenmiştir. B.A.G hibe desteğinden NIH R01GM110174 ve NIH R01AI118891, DOD yanı sıra BC123187P1 hibe eder. RW-T. NIH eğitim grant T32GM008216 tarafından desteklenmiştir.

1. Kültür ve genişleme mESCs Not: fare embriyonik kök hücre kültür için kolay ve hızlı bir şekilde biyokimyasal deneyler sayesinde hızlı bisiklet zaman gerektirdiği büyük sayılar için genişletilebilir. Sağlıklı mESCs çift her 12 h.
<ol><li>MESC gelatinized levha istenen numaraya genişletme mESCs orta (aşağıya bakın) doku kültürü kuluçka muhafaza 37 ° C, % 5 CO 2, ve &#62; % 95 nem. 
	Not: Yeterli plakaları için 3-5 biyolojik çoğaltır için hazır olmalıdır + 4SU örnek ile - 4SU denetimi. Bir 10 cm tabak (Yani 5-10 milyon hücreleri) biyolojik her çoğaltma için daha--dan yeterli.</li>
	<li>Orta mESCs için Dulbecco oluşan &#39; s modifiye kartal &#39; s orta (DMEM) takıma % 15 fetal sığır serum ile (FBS), 2 mM L-glutamin, 0.5 x penisilin/streptomisin, 1 x esansiyel olmayan amino asitler, 100 µM beta-mercaptoethanol, 1.000 U /mL lösemi inhibitör faktörü (LIF), 3 µM CHIR99021, 1 µM PD0325901.</li>
	<li>MESCs passaging önce 10 cm tabak için istediğiniz sayıyı hazırlayın.
	<ol><li>4 mL %0,1 jelatin plaka tüm yüzeyine kaplıdır emin su ekle; (RT) oda sıcaklığında 10 dakika için kuluçkaya; jelatin çözüm kaldırın.</li>
	</ol></li> <li>~ 48 h aşı takip genellikle plaka, başına ~ 10 milyon hücre ulaştıkları zaman geçiş hücreleri. 
	Not: mESCs yoğun kolonilerde büyüdükçe, tabaklar asla % 100 confluency monolayers (örneğin HEK293 veya 3T3 hücreleri) büyümek hücre hatları için gözlemlediği gibi ulaşmak için izin verilmelidir. ~ %50 Konfluent ve kesinlikle orta önce sarı dönüştüğünde bir mESC plaka passaged.
	<ol>Hücreleri, ayırmak için <li>yıkama pilakalar ve yoğun mESC bir kez 1 x 2 mM EDTA, takıma fosfat tamponlu tuz (PBS) kültürlerde sonra % 0.05 tripsin DMEM içinde çözünmüş eklemek ve dönmek 5 min için kuluçka plakasına (37 ° C, % 5 CO 2, ve &#62; % 95 nem).</li>
		<li>Kuluçka Gelişim makinesi plaka kaldırmak ve hücreler eşit DMEM hacmi ile yukarı ve aşağı birkaç kez şiddetle pipetting tarafından resuspend.</li>
		<li>Say hemasitometre kullanarak hücreleri ve hücreleri tek hücre süspansiyon oluşturmak emin olun (Yani hiçbir kümeleri), hücre karışımı 500 x g için oda sıcaklığında 5 dk santrifüj kapasitesi. Süpernatant kaldırmak ve hücre Pelet 1-2 mL DMEM resuspend.</li>
		<li>Aşılamak bir yoğunluk 10.000 hücre/cm 2 mESC orta (Yani 800.000 ~ 10 cm tabak başına hücre) hücreleri 1.3.1. adımda hazırlanan jelatin kaplı plakalar kullanarak.</li>
	</ol></li></ol> 2. Protein Crosslink &#8211; RNA etkileşimleri canlı hücrelerdeki Not: RNA-protein crosslinking fotoğraf alınabilen ribonucleoside analog 4-thiouridine tarafından (4SU) aracılı. 4SU vardır uzun bir Absorbans en yüksek değerden endojen nükleotit ve sadece RNA; dahil edilebilir Bu nedenle orta dalga UVB seçerek crosslink RNA proteinleri 25 , 26 için kullanılabilir. UVB tedavisi 4SU tedavi hücre açar kovalent Glossar 4SU içeren RNA ve de Tyr, bildirilen seven amino asitleri arasındaki Trp, Met, Lys ve Cys 27.
<ol><li>10 cm tabak gerekli sayıda açıklandığı adım 1 olarak genişletme mESCs. 
	Not: Yeterli plakaları için 3-5 biyolojik çoğaltır için hazır olmalıdır + 4SU örnek ile - 4SU denetimi. Bir 10 cm tabak (Yani 5-10 milyon hücreleri) biyolojik her çoğaltma için yeterli.</li>
	<li>Plakaları confluency ulaşmadan 4SU 500 son bir konsantrasyon için doğrudan orta eklemek µM. bırak - tedavi edilmezse 4SU denetim yemekleri.</li>
	<li>Yavaşça 4SU homojen orta boyunca dağıtmak için shake plakaları. Aynı doku kültürü kuluçka 2s için onları dönmek (37 ° C, % 5 CO 2, ve &#62; % 95 nem).</li>
	<li>Bir buz kovası tabak transfer ve orta atın.</li>
	<li>5 mL de buz gibi PBS ile hafifçe plaka durulayın. 
	Not: nazikçe yıkayın veya hücreler ayırabilirsiniz.</li>
	<li>UVB yayan ampul ile donatılmış bir crosslinker 2 mL kapaklar olmadan buz gibi PBS ve yer plakaların eklentisi (312 nm). Bir enerji ayarında 1 J/cm 2 tabak ışınlatayım. 
	Not: Plastik kapağı kaldırılır veya UV ışık hücrelerden kalkan ve çapraz önlemek olabilir önemlidir.</li>
	<li>Hücre halterci kullanarak hücreleri toplamak ve konik tüpler içinde buz gibi PBS aktarın. 5 min, 4 ° c için 2.000 x g, santrifüj</li>
	<li>Süpernatant kaldırmak ve 5 mL buz gibi PBS 2 mM EDTA ve 0.2 mM phenylmethylsulfonyl florür (PMSF) ile hücre Pelet resuspend.</li>
	<li>Bir hemasitometre kullanarak hücreleri hesaplama. 10 cm, 15 cm tabak 5-10 ve 10-20 milyon hücrelerden sırasıyla bekliyoruz.</li>
	5 min, 4 ° c için 2.000 x g de <li>santrifüj 
	Not: Pelleted hücreleri hemen adım 3 için kullanılabilir veya flash donmuş sıvı azot ve-80 ° C'de süresiz olarak depolanabilir. Bu nokta durdurma bir potansiyeldir.</li>
</ol> 3. Çekirdeklerin izolasyon Not: çekirdeklerin sitoplazmik protein kaldırmak ve nükleer protein kapsamını artırmak için izole. Bu adımı RBPs farklı hücresel kompartmanlarda içinde çalışmaya hücresel ayırma diğer formları ile değiştirilebilir.
<ol><li>Hazırla buz gibi tampon (10 mM Tris-HCl pH 7.9, 4 ° C, 1.5 mM MgCl 2, 10 mM KCl). Ayıklama için (2,9 adımda sayılır gibi) 10 milyon hücre başına en az 2.5 mL kullanın. 
	Not: Stokları (örneğin 500 mL şişe) arabelleği A önceden hazırlanmış ve 4 ° C'de 6 ay süreyle depolanır.
	<ol><li>0,5 mM dithiothreitol (DTT) ve 0.2 mM PMSF buz gibi soğuk arabellek A. istenilen miktarda (10 milyon hücre başına 2.5 mL) için kullanılmadan önce Ekle</li>
	</ol></li> <li>Yıkama 2 mL arabellek A başına 10 milyon hücre kullanarak hücreleri. Spin 2500 x g 4 ° C'de 5 min için de</li>
	<li>Atma süpernatant eklemek arabellek Oktil-phenoxy-polyethoxy-etanol gibi bir Nonyonik, Sigara denaturing deterjan % 0,2 ile takıma A (bakınız Tablo malzemeler), 500 µL 10 milyon hücre başına. 4 ° C'de 5 min için döndürme</li>
	<li>2500 x g 5 dakika süreyle, santrifüj</li>
	<li>Kaldır süpernatant; Pelet sitoplazma yoksun olduğu gibi çekirdek oluşur. 
	Not: Çekirdeklerin hemen adım 4 veya flash donmuş sıvı azot için kullanılan ve-80 ° C'de süresiz olarak saklanır. Bu nokta durdurma bir potansiyeldir.</li>
</ol> 4. Çekirdeklerin lizis Not: çapraz çekirdek protein ve protein-RNA kompleksi serbest bırakmak için bir kütle spektrometresi uyumlu arabellek lysed.
<ol><li>Ekle lizis arabellek (9 M üre, 100 mM Tris-HCl pH 8.0, 24 ° C), 10 milyon hücre başına 200 µL. Kromatin bir 1/8'i kullanarak yamultmak için solüsyon içeren temizleyicide &#34; 5-10 s. için % 50 genlik ayarında sonda</li>
	<li>Spin 12.000 g 5 min için x ve toplamak 175 µL olan Pelet önlemek için süpernatant. 
	Not: 100 µL sonraki PRİX-ID adımlar için kullanılacak olan ve kalan 75 µL lysate, daha sonra kullanmak ve/veya western blot analizi için-80 ° C'de saklanabilir.</li>
	<li>Ölçü protein konsantrasyonu Bradford tahlil veya benzer tekniği 28 üzerinden. Protein konsantrasyonu 1 mg/ml farklı örneklerinde veya lizis arabellek uygun miktarda kullanarak en düşük örnek konsantrasyon sulandırmak. 
	Not: 10 milyon mESCs çekirdekleri 100-200 µg protein bekliyoruz.</li>
</ol> 5. Tripsin sindirim Not: protein sindirilir peptidler s oluşturmak içinAşağıdan yukarıya kütle spektrometresi (MS) analizi için uitable.
<ol><li>Dik, 1 h için kuluçkaya eklemek DTT çözüm nükleer lysate (5 mm son);</li>
	<li>İodoacetamide taze stok (14 mM son) Ekle; RT, 30 dk içinde belgili tanımlık karanlık için kuluçkaya.</li>
	<li>Dilute 50 mM NH 4 HCO 3 5 kere hacmi ile lysate</li>
	<li>Tripsin ekleyin (µg protein: µg tripsin = 200:1); 37 ° C'de gecede kuluçkaya.</li>
</ol> 6. Peptidler desalting <ol><li>bir özel yapım aşamasında uç örnek başına hazırlayın.
	<ol><li>6.1.1. katı faz ayıklama C18 malzemenin bir disk 200 µL pipet ucu dibine yerleştirin.</li>
		<li>Ekle 50 µL oligo R3, faz reçine C18 disk üzerine ters. Yer sahne ipucu Santrifüjü adaptör içinde ve yerde İpucu 1.5 mL microfuge tüp içinde adaptörle.</li>
		<li>Ekle 100 µL % 100 Asetonitril yıkamak için ipuçları. Santrifüj için çözücü kaldırmak 1 dk 1000 x g de.</li>
		<li>Equilibrate 50 µL % 0,1 trifluoroacetic asit (TFA). 1 dk. 1000 x g, santrifüj</li>
	</ol></li> <li>%100 formik asit pH 2-3 için azaltmak için sindirilmiş protein örneği ekleyin. 
	Not: Bu ~ 5 µL seyreltilmiş peptid Örnek 1 mL başına istemeniz gerekir, ancak pH-meli var olmak eklendi ölçülü ve daha formik asit gerekirse.</li>
	<li>Yük örnek özel yapım aşamasında uç, 1dk kadar tüm örnek için 1000 x g, santrifüj üzerine ucu ile gider.</li>
	<li>Yıkama bağlı 50 µL % 0.1 ile peptidler TFA. 1 dk. 1000 x g, santrifüj</li>
	<li>50 µL elüsyon arabelleği ekleyerek peptidler elute (% 75 Asetonitril, % 0,025 TFA) sahne ipucu ve santrifüj elüsyon Arabellek yetersiz ucu zorlamak 1 dk 1000 x g de.</li>
	<li>Kuru vakum santrifüj 150 x g ve 1 h için 1-3 kPa ayarlamak kullanarak örnek 
	Not: Kurutulmuş peptidler-80 ° C'de süresiz olarak saklanır. Bu nokta durdurma bir potansiyeldir.</li>
</ol> 7. Çapraz RNA kaldırılması Not: tedavi etmek RNA kaldırmak için nükleaz ile peptidler.
<ol><li>Nükleaz arabellek (100 mM NH 4 HCO 3, 4 mM MgCl 2) x 50 µL 2 Pelet resuspend.</li>
	Absorbans 280 kullanarak <li>ölçü peptid konsantrasyonu 1 mg/mL 1 A 280 için peptidler varsayarak nm. 
	Not: Beklenen konsantrasyonu 1 mg/mL'dir.</li>
	<li>Tüm örnekleri 1 mg/mL veya 2 x nükleaz arabellek kullanarak en düşük konsantrasyon ayarlayın.</li>
	<li>50 µL H 2 O + 1 µL yüksek saflıkta nükleaz ana karışımı hazırlar (&#8805; 250 U) (Tablo malzemeler için başvurmak) örnek başına.</li>
	<li>50 µL peptid örneği alıp 50 µL H 2 O + nükleaz master mix ekleyin.</li>
	1 h. kütle spektrometresi gerçekleştirmek için devam etmek için 37 ° C'de <li>Incubate. 
	Not: Peptidler kütle spektrometresi için hazırsınız. Onlar hemen analiz veya süresiz olarak-80 ° C'de depolanan. Bu nokta durdurma bir potansiyeldir.</li>
</ol> 8. Nano sıvı Kromatografi, kütle spektrometresi ve ham veri işleme Not: 4SU crosslinking peptid kitle değiştiğinden, onların iyonları çapraz peptid yoğunluğunu doğru LC-MS/MS sırasında dikkate alınmaz hangi bu nedenle çapraz tarafından azaltılan görünüyor. Derecesi ve bu düşüş tutarlılığını protein-RNA crosslinking her peptid 24 derecesini yansıtır.
<ol><li>Hazırlamak HPLC arabelleği aşağıdaki gibi: %0,1 formik asit HPLC sınıf su (a tampon); %0,1 formik asit HPLC sınıf Asetonitril (arabellek B).</li>
	<li>Bir nano-HPLC varsa bağlanmak bir nano-sütun aşağıdaki özelliklerle: iç çap 75 µm; C18-AQ parçacıkları ile; Paketli uzunluğu 20-25 cm. 
	Not: kullanılabilir HPLC yüksek akış oranları çalışıyorsa belirtilen akış hızı için uygun sütun boyutu kullanın. Daha yüksek akış Kromatografi duyarlılık azalır.</li>
	<li>Program HPLC yöntemi aşağıdaki gibi: akış hızı 250-300 nL/dk; 2 gradyan % 28 arabelleğinden B 120 dak, sonraki 5 min için % 80'b ve isocratic % 80'i B 10 dk. 28 ' 
	Not: HPLC bir otomatik sütun denge önceki örnek yükleme yoksa, program 10 dk %0 B örnek yüklemeden önce başlayın.</li>
	<li>MS edinme yöntem veri bağımlı kazanım (DDA) standart av tüfeği proteomik deneyler olarak gerçekleştirmek için program. Enstrüman iş hacmi tam MS taramaları ile tandem MS inceden inceye gözden geçirmek (ya da MS/MS) en yoğun sinyallerin alternatif. Proteomik MS çalışır için en iyi ayarları kullanın. 
	Not: kendine güvenen sonucu elde etmek için en az tam MS gerçekleştirebilirsiniz kullanım aletleri yüksek çözünürlük modu (örneğin orbitrap, uçuş saat) inceden inceye gözden geçirmek. Doğru miktar için 3 s. uzun görev devir ayıklanan iyon chromatograms doğru tanımı engelleyebilir daha tam MS taramalar arasında aralıklarla artık olduğunuzdan emin olun.</li>
	<li>1-2 µg örneği HPLC sütuna yük ve programlanmış gibi HPLC-MS/MS yöntemini çalıştırın. Biyolojik her çoğaltma için en az iki bağımsız çalışması yapmak ve onları tedavi olarak teknik çoğaltır.</li>
	<li>Sonra MS, MS/MS spectra kimlik ve peptid miktar üzerinden ayıklanan iyon Kromatografi için proteomik yazılım paketi içine raw dosyalarını alın. Birden fazla Kromatografik hizalama gerçekleştirebilir yazılım paketleri öneririz MS çalışır (bakınız Tablo reçetesi) 29 , 30.</li>
	<li>Bilgisayar yazılımı maiyet seçeneği varsa, etkinleştirme &#34; maç arasında ishal &#34; veri işleme başlamadan önce.</li>
	<li>Analiz tamamlandığında miktar değerleri ile birlikte peptid listeyi verebilir.</li>
</ol>

<ol><li>Bonasio, R., Shiekhattar, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+transcription+by+long+noncoding+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Regulation of transcription by long noncoding RNAs.</a> Annu Rev Genet. 48, 433-455 (2014).</li>
<li>Bonasio, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+topics+in+epigenetics%3A+ants%2C+brains%2C+and+noncoding+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+N+Y+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Emerging topics in epigenetics: ants, brains, and noncoding RNAs.</a> Ann N Y Acad Sci. 1260, 14-23 (2012).</li>
<li>Rinn, J. L., Chang, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+regulation+by+long+noncoding+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">Genome regulation by long noncoding RNAs.</a> Annu Rev Biochem. 81, 145-166 (2012).</li>
<li>Goff, L. A., Rinn, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linking+RNA+biology+to+lncRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Linking RNA biology to lncRNAs.</a> Genome Res. 25 (10), 1456-1465 (2015).</li>
<li>Holoch, D., Moazed, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-mediated+epigenetic+regulation+of+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">RNA-mediated epigenetic regulation of gene expression.</a> Nat Rev Genet. 16 (2), 71-84 (2015).</li>
<li>Chu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+discovery+of+Xist+RNA+binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Systematic discovery of Xist RNA binding proteins.</a> Cell. 161 (2), 404-416 (2015).</li>
<li>McHugh, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Xist+lncRNA+interacts+directly+with+SHARP+to+silence+transcription+through+HDAC3%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The Xist lncRNA interacts directly with SHARP to silence transcription through HDAC3.</a> Nature. 521 (7551), 232-236 (2015).</li>
<li>Minajigi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosomes.+A+comprehensive+Xist+interactome+reveals+cohesin+repulsion+and+an+RNA-directed+chromosome+conformation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Chromosomes. A comprehensive Xist interactome reveals cohesin repulsion and an RNA-directed chromosome conformation.</a> Science. 349 (6245), (2015).</li>
<li>Lunde, B. M., Moore, C., Varani, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-binding+proteins%3A+modular+design+for+efficient+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">RNA-binding proteins: modular design for efficient function.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (6), 479-490 (2007).</li>
<li>Cabili, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+annotation+of+human+large+intergenic+noncoding+RNAs+reveals+global+properties+and+specific+subclasses%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Integrative annotation of human large intergenic noncoding RNAs reveals global properties and specific subclasses.</a> Genes Dev. 25 (18), 1915-1927 (2011).</li>
<li>Castello, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+RNA+biology+from+an+atlas+of+mammalian+mRNA-binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Insights into RNA biology from an atlas of mammalian mRNA-binding proteins.</a> Cell. 149 (6), 1393-1406 (2012).</li>
<li>Baltz, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mRNA-bound+proteome+and+its+global+occupancy+profile+on+protein-coding+transcripts%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">The mRNA-bound proteome and its global occupancy profile on protein-coding transcripts.</a> Mol Cell. 46 (5), 674-690 (2012).</li>
<li>Kwon, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RNA-binding+protein+repertoire+of+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The RNA-binding protein repertoire of embryonic stem cells.</a> Nat Struct Mol Biol. 20 (9), 1122-1130 (2013).</li>
<li>Beckmann, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RNA-binding+proteomes+from+yeast+to+man+harbour+conserved+enigmRBPs%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">The RNA-binding proteomes from yeast to man harbour conserved enigmRBPs.</a> Nat Commun. 6, 10127(2015).</li>
<li>Conrad, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+interactome+capture+of+the+human+cell+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Serial interactome capture of the human cell nucleus.</a> Nat Commun. 7, 11212(2016).</li>
<li>Wilusz, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+triple+helix+stabilizes+the+3%27+ends+of+long+noncoding+RNAs+that+lack+poly%28A%29+tails%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">A triple helix stabilizes the 3' ends of long noncoding RNAs that lack poly(A) tails.</a> Genes Dev. 26 (21), 2392-2407 (2012).</li>
<li>Kim, T. K., Shiekhattar, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Architectural+and+Functional+Commonalities+between+Enhancers+and+Promoters%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Architectural and Functional Commonalities between Enhancers and Promoters.</a> Cell. 162 (5), 948-959 (2015).</li>
<li>Brannan, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SONAR+Discovers+RNA-Binding+Proteins+from+Analysis+of+Large-Scale+Protein-Protein+Interactomes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">SONAR Discovers RNA-Binding Proteins from Analysis of Large-Scale Protein-Protein Interactomes.</a> Mol Cell. 64 (2), 282-293 (2016).</li>
<li>Bonasio, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+with+RNA+direct+the+Polycomb+group+protein+SCML2+to+chromatin+where+it+represses+target+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Interactions with RNA direct the Polycomb group protein SCML2 to chromatin where it represses target genes.</a> Elife. 3, e02637(2014).</li>
<li>Kaneko, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+between+JARID2+and+noncoding+RNAs+regulate+PRC2+recruitment+to+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Interactions between JARID2 and noncoding RNAs regulate PRC2 recruitment to chromatin.</a> Mol Cell. 53 (2), 290-300 (2014).</li>
<li>Kaneko, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorylation+of+the+PRC2+component+Ezh2+is+cell+cycle-regulated+and+up-regulates+its+binding+to+ncRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Phosphorylation of the PRC2 component Ezh2 is cell cycle-regulated and up-regulates its binding to ncRNA.</a> Genes Dev. 24 (23), 2615-2620 (2010).</li>
<li>Saldana-Meyer, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CTCF+regulates+the+human+p53+gene+through+direct+interaction+with+its+natural+antisense+transcript%2C+Wrap53%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">CTCF regulates the human p53 gene through direct interaction with its natural antisense transcript, Wrap53.</a> Genes Dev. 28 (7), 723-734 (2014).</li>
<li>Castello, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+Identification+of+RNA-Binding+Domains+in+Human+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Comprehensive Identification of RNA-Binding Domains in Human Cells.</a> Mol Cell. 63 (4), 696-710 (2016).</li>
<li>He, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Resolution+Mapping+of+RNA-Binding+Regions+in+the+Nuclear+Proteome+of+Embryonic+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">High-Resolution Mapping of RNA-Binding Regions in the Nuclear Proteome of Embryonic Stem Cells.</a> Mol Cell. 64 (2), 416-430 (2016).</li>
<li>Favre, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((4-Thiouridine+photosensitized+RNA-protein+crosslinking+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">4-Thiouridine photosensitized RNA-protein crosslinking in mammalian cells.</a> Biochem Biophys Res Commun. 141 (2), 847-854 (1986).</li>
<li>Hafner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome-wide+identification+of+RNA-binding+protein+and+microRNA+target+sites+by+PAR-CLIP%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Transcriptome-wide identification of RNA-binding protein and microRNA target sites by PAR-CLIP.</a> Cell. 141 (1), 129-141 (2010).</li>
<li>Favre, A., Saintome, C., Fourrey, J. L., Clivio, P., Laugaa, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thionucleobases+as+intrinsic+photoaffinity+probes+of+nucleic+acid+structure+and+nucleic+acid-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Photochem+Photobiol+B%22%5BJournal%5D)">Thionucleobases as intrinsic photoaffinity probes of nucleic acid structure and nucleic acid-protein interactions.</a> J Photochem Photobiol B. 42 (2), 109-124 (1998).</li>
<li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).</li>
<li>Tyanova, S., Temu, T., Cox, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+MaxQuant+computational+platform+for+mass+spectrometry-based+shotgun+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">The MaxQuant computational platform for mass spectrometry-based shotgun proteomics.</a> Nat Protoc. 11 (12), 2301-2319 (2016).</li>
<li>MacLean, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skyline%3A+an+open+source+document+editor+for+creating+and+analyzing+targeted+proteomics+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Skyline: an open source document editor for creating and analyzing targeted proteomics experiments.</a> Bioinformatics. 26 (7), 966-968 (2010).</li>
<li>Kondo, Y., Oubridge, C., van Roon, A. M., Nagai, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+human+U1+snRNP%2C+a+small+nuclear+ribonucleoprotein+particle%2C+reveals+the+mechanism+of+5%27+splice+site+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of human U1 snRNP, a small nuclear ribonucleoprotein particle, reveals the mechanism of 5' splice site recognition.</a> Elife. 4, (2015).</li>
<li>Hafner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PAR-CliP--a+method+to+identify+transcriptome-wide+the+binding+sites+of+RNA+binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">PAR-CliP--a method to identify transcriptome-wide the binding sites of RNA binding proteins.</a> J Vis Exp. (41), (2010).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Biz PRİX-ID içinde mESCs ve 4SU RNA dahil edebilirsiniz herhangi bir hücreye uygun değişiklikler ile gerçekleştirmek için detaylı bir deneysel protokol tanımlamak. Diğer hücre tipleri yeterli bir sinyal-gürültü oranı sağlamak için yaklaşım duruma getirilmesi gerekebilir. Ayrıca, protokol burada odaklanır nükleer RBPs muayenede açıklanan. süre PRİX-ID teknoloji kolayca farklı ayırma kullanımıyla sitozol veya belirli organelleri, gibi farklı hücresel kompartmanlarda için adapte olmalıdır stratejileri. En iyi duruma getirme...

PRİX-ID yöntemin amacı roman RNA bağlanıcı proteinler (RBPs) tanımlamak ve kendi RNA bağlayıcı bölgeleri (RBRs) RNA-bağlama mutantlar tasarımını ve soruşturma biyolojik ve biyokimyasal kolaylaştırmak için peptid düzeyi çözünürlükte harita olmaktır protein-RNA etkileşimlerin işlevleri.
RNA, hem genetik bilgi taşıyan bir haberci olarak hareket hem de aynı zamanda karmaşık üç boyutlu yapılar biyokimyasal fonksiyonları daha fazla benzer-e doğru protein1,2kat biomolecules arasında benzersizdir. Kanıt büyüyen vücut kodlamayan RNA'ların (ncRNA'lar) çeşitli gen düzenleyici ve epigenetik yolları3,4,5 ' te önemli rol oynarlar ve tipik olarak, bu düzenleyici işlevleri konserde aracılı öneriyor proteinler ile özel olarak verilen bir RNA ile etkileşim. Belirli uygunluğu etkileşen proteinler bir dizi son zamanlarda yoğun bir şekilde okudu uzun ncRNA (lncRNA) nasıl bu lncRNA kadın hücreleri6,7 x kromozomu inactivation aracılık eder içine değerli bilgiler sağlayan Xist belirlendi ,8. Özellikle herhangi bir kanonik RNA bağlayıcı etki alanları9içeren birçok Xist etkileşim bu proteinlerin değil ve bu nedenle RNA-bağlama faaliyetlerini öngörülen silico yalnız onların birincil sıralamasına dayanan olamazdı. LncRNAs binlerce herhangi bir belirli hücre10dakika sonra ifade edilir dikkate alındığında, RNA bağlanıcı proteinler (RBPs) olmak keşfetti henüz pek çoğu ile etkileşimleri aracılığıyla hareket varsaymak makul olduğunu. Bu roman RBPs tanımlamak için deneysel bir strateji bu nedenle büyük ölçüde ncRNA'lar biyolojik fonksiyonu dissekan görevini kolaylaştırmak.
RBPs ampirik olarak tanımlamak için önceki girişimleri RNA kütle spektrometresi (MS)11,12,13,14,-15birleştiğinde polyA + seçime yararlanmıştır. Bu deneyler birçok protein, sözde RBPs listesine rağmen tasarım gereği sadece poliadenile transkript bağlı proteinler bulamazlardı. Ancak, çoğu küçük RNA'lar ve birçok lncRNAs poliadenile değildir. 16 , 17 ve onların etkileşen proteinler büyük olasılıkla bu deneylerde cevapsız olurdu. Yeni yapılan bir çalışmada Makine öğrenimi birden çok bilinen RBPs ile birlikte saflaştırılmış ve tekrarlayan RBP ortakları daha RNA-bağlama etkinlikleri18sahip olasılığı olduğunu gösterdi proteinler tanımlamak için protein-protein interactome veritabanlarına uygulanır. Ancak, bu yaklaşım büyük etkileşim veritabanlarında madencilik dayanır ve sadece böylece çözünmez, membran gömülü ve kıt analizinden hariç olmak üzere bilinen RBPs ile sigara denaturing koşullarda ortak saf olabilir proteinler tanımlayabilirsiniz proteinler.
Kimliği ile bir protein bir bona fide RBP kez otomatik olarak protein-RNA etkileşimi biyolojik ve/veya biyokimyasal işlevi hakkında bilgi vermez. Bu noktada adrese, bu etki alanı ve amino asit protein artıkları etkileşimde yer alan ilgili belirli mutantlar RNA bağlama işlevi her roman RBP19, bağlamında test etmek için tasarlanmış böylece tanımlamak için genellikle arzu edilir 20. önceki çabalar grubumuza ve diğerleri tarafından kullanmış rekombinant protein parçaları ve silme mutantlar bölgeleri (RBRs)19,20,21,22; bağlama RNA tanımlamak için Ancak, bu tür yaklaşımlar emek yoğun ve yüksek üretilen iş analizleri ile uyumsuz. Son zamanlarda, bir çalışma RNA-bağlama faaliyetleri kütle spektrometresi23kullanarak yüksek üretilen iş moda eşlemek için deneysel bir strateji tarif; Ancak, bu yaklaşım bir çift polyA + RNA seçime dayanıyordu ve böylece aynı sınırlamaları yukarıda açıklanan RBP kimlik yaklaşımlar olarak taşıdı.
Photocrosslinking protein-RNA ve protein ve RNA yapmadan canlı hücrelerdeki ile etkileşim protein bölgeleri tanımlamak için nicel kütle spektrometresi patlatır RNA bağlama bölge tanımlaması (PRİX ID.) olarak adlandırdığı bir tekniği, Gelişmiş varsayım RNA Poliadenilasyon durum, böylece RBPs de dahil olmak üzere polyA-RNA'ların24için bağlı. Ayrıca, bu yöntem sadece crosslinking dayanır ve protein çözünürlük veya erişilebilirlik şartlar yoktur ve böylece membranlar (örneğin nükleer zarf) veya kötü çözünür bölmeleri (RNA-bağlama etkinliklerine eşlemek uygundur örneğin nükleer matris). Biz PRİX-ID fare embriyonik kök hücreler (mESCs) çekirdekleri için gerçekleştirmek için deneysel adımlar açıklar ama koşuluyla verimli 4SU ile Kültür dahil edebilirsiniz küçük değişiklikler ile bu iletişim kuralı hücre tipleri, çeşitli için uygun olmalıdır Orta.

<table><tbody><tr><td>KnockOut DMEM</td><td>Fisher Scientific</td><td>10829018</td><td></td></tr><tr><td>Fetal sığır serumu, nitelikli, ABD menşeili</td><td>Fisher Scientific</td><td>26140079</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin solüsyonu 200 mM</td><td>Sigma</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin-Streptomisin solüsyonu</td><td>Sigma</td><td>P0781</td><td></td></tr><tr><td>MEM Esansiyel Olmayan Amino Asit Solüsyonu (100 kez;)</td><td>Sigma</td><td>M7145</td><td></td></tr><tr><td>2-Merkaptoetanol</td><td>Sigma</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>ESGRO Lösemi İnhibitör Faktörü (LIF)</td><td>EMD Millipore</td><td>ESG1106</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Tocris</td><td>4423</td><td></td></tr><tr><td>PD0325901</td><td>Sigma</td><td>PZ0162</td><td></td></tr><tr><td>Jelatin çözeltisi, suda %2</td><td>Sigma</td><td>G1393</td><td></td></tr><tr><td>4-tiyouridin</td><td>Sigma</td><td>T4509</td><td>50 mM su stoğu</td></tr><tr><td>Spektrolinker XL-1500</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-992-90</td><td></td></tr><tr><td>Fenilmetansülfonil florür</td><td>Sigma</td><td>78830</td><td></td></tr><tr><td>IGEPAL CO-630</td><td>Sigma</td><td>542334</td><td>Oktil-fenoksi-polietoksi-etanol deterjanın ticari formu</td></tr><tr><td>İyodoasetamid</td><td>Sigma</td><td>I6125</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin, sıralama sınıfı</td><td>Promega</td><td>V5111</td><td></td></tr><tr><td>Empore katı faz ekstraksiyon diski</td><td>3M</td><td>66883</td><td></td></tr><tr><td>OLIGO R3 Ters - Faz</td><td>Reçine Fisher Scientific</td><td>1133903</td><td></td></tr><tr><td>Benzonaz</td><td>Sigma</td><td>E8263</td><td>Yüksek saflıkta nükleaz</td></tr><tr><td>Sonic Dismembrator Model 100</td><td>Fisher Scientific</td><td>durduruldu</td><td>FB505110</td></tr> <tr><td>ile güncellendiHPLC sınıfı asetonitril</td><td>Fisher Chemical</td><td>A955-4</td><td></td></tr><tr><td>HPLC sınıfı su</td><td>Fisher Scientific</td><td>W6 4</td><td></td></tr><tr><td>TFA</td><td>Fisher Scientific</td><td>A11650</td><td></td></tr><tr><td>Amonyum Bikarbonat</td><td>Sigma</td><td>A6141</td><td></td></tr><tr><td>Asetik Asit</td><td>Sigma</td><td>49199</td><td></td></tr><tr><td>Formik Asit</td><td>Sigma</td><td>F0507</td><td></td></tr><tr><td>ReproSil-Pur 18-AQ</td><td>Dr. Maisch GmbH HPLC</td><td>r13.aq.0003</td><td>HPLC kolonu için ambalaj malzemesi</td></tr><tr><td>Nano kolonlar için kılcal damar (75 & mikro; m)</td> <td>Molex</td><td>1068150017</td><td></td></tr><tr><td>MaxQuant yazılımı</td><td>Max Planck Biyokimya</td><td></td> Enstitüsü <td>Birden fazla MS çalışmasının kromatografik hizalamasını gerçekleştirebilir</td></tr></tbody></table>

kütle spektrometresi tabanlı kimlik rna-bağlama bölgelerinin için numune hazırlama

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Kodlamayan RNA'ların gen ekspresyonu, Kromatin yapısı ve DNA tamiri düzenleyen de dahil olmak üzere birkaç nükleer süreçlerinde önemli rol oynarlar. Çoğu durumda, kodlamayan RNA'ların eylem olan işlevleri sırayla kodlamayan RNA'ların ile bu etkileşimler tarafından düzenlenen proteinler tarafından aracılık ettiği. Bununla tutarlı, proteinler nükleer işlevlerinde dahil, giderek artan sayıda RNA bağlamak için bildirilmiştir ve birkaç durumda bu proteinler RNA-bağlama bölgelerinde, kez zahmetli, aday tabanlı yöntemleri ile eşleştirilmiş olan.
Burada, RNA bağlanıcı proteinler ve kendi RNA-bağlama bölgelerinin yüksek üretilen iş, Proteom çapında tarafsız tanımlama gerçekleştirmek için detaylı bir protokol raporu. Photoreactive üridin RNA-çapraz peptidler Proteom içinde ortaya çıkarmak için UV-aracılı protein-RNA crosslinking ve kütle spektrometresi analizleri ardından hücresel RNA, analog birleşme yöntemi kullanır. Her ne kadar biz fare embriyonik kök hücre için açıklayınız, protokol kültürlü hücreler çeşitli için kolayca adapte edilmelidir.

Şekil 1 PRİX-ID iş akışı gösterilmektedir. Bu teknik nispeten düşük crosslinking verimliliği nedeniyle tükenmesi düzeyi ve tutarlılık gözlenen etkisi (P -değeri) arasında biyolojik çoğaltır dikkate almak çok önemlidir. Şekil 2 bir yanardağ arsa PRİX-ID sonuç gösterir. RNA tanıma motifi (RRM) etki alanı üst üste peptidler son derece tutarlı tükenmesi düzey göster. RRM etki olumlu bir denetim PRİX-ID analizi için kullanıla...

Biz RNA bağlanıcı proteinler tanımlamak ve kendi RNA bağlayıcı bölgeleri UV-aracılı photocrosslinking ve kütle spektrometresi kullanılarak canlı hücrelerdeki eşlemek için bir protokol tanımlamak.

Kütle spektrometresi tabanlı kimlik RNA-bağlama bölgelerinin için numune hazırlama

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

Bu prosedürün genel amacı, canlı hücrelerdeki RNA bağlayıcı proteinleri tanımlamak ve UV aracılı fotokroslinkleme ardından kütle spektrometrisi kullanarak bunların RNA bağlanma bölgelerini haritalandırmaktır. Bu yöntem, hangi epigenetik regülatörlerin RNA'ya bağlı olduğu ve etkileşimler için hangi protein bölgelerinin gerekli olduğu gibi epigenetik alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, protein-RNA komplekslerinin saflaştırmasını gerektirmemesi, bu nedenle çok az materyal gerektirmesi ve her türlü RNA'ya bağlı proteinleri tanımlayabilmesidir.Sunulduğu şekliyle bu yöntem, bilimsel ilgi alanımız olduğu için nükleer proteinlere odaklanmaktadır; ancak fraksiyonlama basamaklarında yapılacak küçük modifikasyonlarla, diğer subnükleer kompartmanlardaki RNA ve bağlayıcı proteinleri incelemek için de kullanılabilir. Fare ESC'lerini metin protokolüne uygun olarak kültüre edip genişlettikten sonra, hücreleri gerekli sayıdaki 10 santimetre'lik plaklara aktararak çoğaltın. Plaklar konfluense ulaşmadan önce, ortama doğrudan 500 micro molar final konsantrasyonuna gelecek şekilde dört SU ekleyin.4sU kontrol kaplarını işlem görmemiş olarak bırakın. 4sU'nun besiyeri boyunca homojen bir şekilde dağılması için plakaları nazikçe sallayın, ardından plakaları iki saat boyunca aynı doku kültürü inkübatörüne geri yerleştirin. 4sU inklüzyon verimliliği hücre tipleri arasında farklılık gösterir; bu nedenle, etkili çapraz bağlanmayı sağlamak ve toksisiteyi en aza indirmek için konsantrasyonun ve inkübasyon süresinin optimize edilmesi gerekebilir.Ardından, plakaları bir buz kovasına aktarın ve besiyerini boşaltın. Sonra, plakaları nazikçe durulamak için 5 milliliters buz gibi soğuk PBS kullanın. 2 milliliters buz gibi soğuk PBS ekleyin ve kapakları açık plakaları UV-B yayan ampullere sahip bir çapraz bağlayıcıya yerleştirin.Plakaları santimetrekare başına 1 Joule enerji ayarında ışınlayın. Verimli UV çapraz bağlama kritik öneme sahiptir. UV-B ışığı kullanmanızı öneririz, ancak UV-A da kullanılabilir.Her durumda, kullanılan UV enerjisi miktarı optimize edilmeli ve PAR-CLIP veya ChIRP ile izlenebilir. Hücreleri toplamak için hücre toplayıcılar (cell lifters) kullanın ve hücreleri konik tüplerdeki buz gibi soğuk PBS'ye aktarın. Ardından, hücreleri 2000 ×g ve 4 °C'de beş dakika boyunca santrifüjleyin.Süpernatantı uzaklaştırın ve hücre peletini 2 millimolar EDTA ve 0.2 millimolar PMSF içeren beş mililitre buz gibi soğuk PBS içinde yeniden süspande edin. Hücreleri bir hemositometre ile sayın. Sırasıyla 10 santimetre ve 15 santimetrelik plakalardan beş ila on ve on ila yirmi milyon hücre elde etmeyi bekleyin.Ardından, hücreleri 2000 ×g'de ve 4 °C'de beş dakika boyunca santrifüjleyin. Hücrelerden çekirdekleri izole etmek için, metin protokolünde belirtildiği şekilde buz gibi soğuk tampon A hazırlayın. Kullanmadan önce, istenilen miktardaki tampon A'ya 0.5 mM DTT ve 0.2 mM PMSF ekleyin. Hücreleri yıkamak için üzerlerine 2 mL soğuk tampon ekleyin, ardından hücreleri 2500 ×g'de ve 4 °C'de beş dakika boyunca döndürün.Süpernatantı atın ve %0,2 oranında iyonik olmayan, denatüre etmeyen bir deterjan eklenmiş tampon A ilave edin, ardından örneği 4 °C'de beş dakika boyunca döndürün. Hücreleri 2500 ×g'de beş dakika santrifüj ettikten sonra süpernatantı uzaklaştırın. Pelet, sitoplazmadan arındırılmış bütün çekirdeklerden oluşur.Çekirdekleri liz etmek için tüpe 200 µL liz tamponu ekleyin. Kromatini parçalamak için numuneyi, yüzde 50 amplitüd ayarında beş ila on saniye boyunca 1/8 inçlik bir prob ile sonike edin. Numuneyi 12000 ×g hızında beş dakika santrifüj edin ve peletten kaçınmak için süpernatantın sadece 175 µL'sini toplayın.Ardından, protein konsantrasyonunu Bradford testi veya benzeri bir teknikle ölçün. Daha sonra, farklı örneklerdeki proteinleri 1 mg/mL'ye veya en düşük örnek konsantrasyonuna seyreltmek için lizis tamponu kullanın. Nükleer lizata 5 mM DTT çözeltisi ekleyin ve örneği oda sıcaklığında bir saat boyunca inkübe edin.Ardından, taze stoktan 14 millimolar iodoacetamide ekleyin ve lizatı oda sıcaklığında, karanlıkta 30 dakika boyunca inkübe edin. Lizatı, hacminin beş katı kadar 50 millimolar amonyum bikarbonat ile seyreltin, ardından tripsin ekleyin. Örneği 37 degrees celsius sıcaklıkta gece boyunca inkübe edin.Örnek başına bir adet özel yapım aşama ucu hazırlamak için, bir 200 µL pipet ucunun dibine katı faz ekstraksiyon C18 materyali içeren bir disk yerleştirin. C18 diskinin üzerine 50 µL Oligo R3 ters fazlı reçine ekleyin, ardından aşama ucunu bir santrifüj adaptörünün içine ve adaptörü de 1,5 mL'lik bir mikrofüj tüpünün içine yerleştirin. Uçları yıkamak için içlerine 100 µL %100 asetonitril ekleyin.Ardından, çözücüyü uzaklaştırmak için uçları 1000 ×g'de bir dakika boyunca santrifüjleyin. Uçları 50 µL %0,1 trifloroasetik asit veya TFA ile dengeleyin. Daha sonra, uçları tekrar döndürün.pH değerini 2 ile 3 arasına düşürmek için sindirilmiş protein örneğine %100 formik asit ekleyin. Ardından, örneği özel yapım bir sahne ucuna (stage tip) yükleyin ve örneğin tamamı uçtan geçene kadar bir dakika boyunca 1000 ×g hızında santrifüjleyin. Bağlanan peptitleri 50 µL %0,1 TFA ile yıkayın.Ardından, numuneyi 1000 ×g'de bir dakika boyunca santrifüj ettikten sonra, sahne ucuna 50 µL elüsyon tamponu ekleyerek peptidleri elüye edin ve elüsyon tamponunun uçtan dışarı çıkmasını sağlamak için 1000 ×g'de bir dakika boyunca santrifüjleyin. Numuneyi kurutmak için 150 ×g ve 1 ila 3 kPa değerlerine ayarlanmış bir vakum santrifüjünü bir saat boyunca kullanın. Numunedeki çapraz bağlı RNA'yı uzaklaştırmak için, peleti 50 µL 2x nükleaz tamponunda yeniden süspanse edin.1 mg/mL peptit için A280 değerini 1 kabul ederek, peptit konsantrasyonunu 280 nanometrede ölçün. Tüm örnekleri 1 mg/mL'ye veya en düşük konsantrasyona ayarlamak için 2x nükleaz tamponu kullanın, ardından örnek başına 50 µL su ve 1 µL yüksek saflıkta nükleaz içeren bir master mix hazırlayın. 50 µL peptit örneğini, 50 µL su ve nükleaz içeren master mix ile birleştirin.Ardından, örneği 37 °C'de bir saat boyunca inkübe edin. Son olarak, metin protokolüne uygun olarak nanolikit kromatografi, kütle spektrometrisi ve veri işlemini gerçekleştirin. Bu şekil, fare ESC'lerinden elde edilen bir RBR id sonucunun volkan grafiğini göstermektedir.Bir RNA tanıma motifi alanı ile örtüşen peptitler mavi renktedir ve oldukça tutarlı azalma seviyeleri göstermektedir. HNRNPC'den gelen bir RNA bağlayıcı peptit kırmızı ile vurgulanmıştır. Burada, bir protein bölgesinin RNA bağlama olasılığının tahmini olarak hesaplanan RBR kimlik skorlarının bir ısı haritası gösterilmektedir.Skor, spliceozomal alt birim U1-70k'nın yüzeyine yansıtılmıştır. Kristal yapı ile belirlenen RNA temasının yakınındaki parlak kırmızı renk, protein RNA etkileşiminin doğru şekilde tanımlandığını göstermektedir. Bu şekilde, TET2 yeni bir RBP olarak sunulmuş ve RNA bağlanma aktivitesi, RBR id skoru proteinin primer sekansı boyunca çizilerek bir C terminal bölgesine haritalanmıştır.Son olarak, bu yeni RBR gereksinimi, yabanıl tip sekans kullanılarak PAR-CLIP gerçekleştirilip elde edilen sinyalin, öngörülen RBR'den yoksun olan mutantın sinyaliyle karşılaştırılması yoluyla doğrulanabilir. Uzmanlaşıldığında, bu teknik düzgün bir şekilde uygulandığında iki güne yayılan yedi ila sekiz saat içinde tamamlanabilir. Çapraz bağlamadan önce, farklılaşmanın nasıl başladığı veya hücre döngüsünün RNA protein etkileşimlerini nasıl düzenlediği gibi ek soruları yanıtlamak amacıyla hücreler çeşitli işlemlerle stimüle edilebilir.Bu videoyu izledikten sonra, kütle spektrometrisi ile protein-RNA etkileşim bölgelerini belirlemek için çapraz bağlı protein-RNA kompleksleri içeren ekstraktların nasıl hazırlanacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

sample-preparation-for-mass-spectrometry-based-identification-rna

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Pre-mRNA geçici doğası nedeniyle, izole etmek ve incelemek için zor...

İnsan pre-mRNA üzerinde Haritalama Ribonucleoproteins Hızlı Yüksek verim için Yöntemi (RNPs)

RNA transkript trans etkili RNA bağlayıcı proteinler (RBPs) çok sayıda aracılığı ile geniş posttranskripsiyonel düzenlemeye tabidir. Burada hassas ve transcriptome geniş bir ölçekte RBPs, RNA bağlayıcı siteleri tanımlamak için genellenememektedir bir yöntem mevcut.

PAR-Klip - RNA Cilt Proteinler Transcriptome geniş Cilt Siteleri Belirlemek Amacıyla Bir Yöntem

Bu videoda, ilgilenilen bir hedef protein için spesifik RNA bağlama dizilerini tanımlamak için üstel zenginleştirme (SELEX) yöntemiyle ligandların sistematik evrimini açıklıyoruz. Protein, geniş bir randomize RNA dizileri havuzu ile inkübe edilir ve protein bağlayıcı RNA dizileri izole edilir, PCR ile çoğaltılır ve protein bağlama bölgelerini tanımlamak için dizilenir.

RNA-Protein Etkileşimlerini Tanımlamak için SELEX Tabanlı İn Vitro Bağlanma Testi

Belirli bir doku hücrelerinin bir alt kümesi gen ifade analizi büyük bir sorun teşkil etmektedir. Bu makalede, lazer yakalama mikrodiseksiyon ile hızlı bir immün yöntemi birleştirerek belirli bir hücre popülasyonu yüksek kaliteli toplam RNA izole açıklamaktadır.

Hücre belirli alt gruplar RNA izolasyonu Hızlı immünoyaftalama ile birlikte Lazer yakalama mikrodiseksiyon kullanma

RNA-protein etkileşimleri birçok hücresel sürecin merkezinde yer alır. Burada, spesifik RNA'yı izole etmek ve onunla ilişkili yeni proteinleri tanımlamak için in vivo bir yöntemi açıklıyoruz. Bu, RNA'ların hücrede nasıl düzenlendiğine yeni bir ışık tutabilir.

Rapid Metodoloji tarafından Roman RNA Bağlayıcı Proteinler İzolasyon

Dizi özgüllüğü gen regülasyonu için çok önemlidir. Belirli dizileri tanıyan düzenleyici proteinler gen regülasyonu için önemlidir. Bu tür proteinler için fonksiyonel bağlama alanlarının tanımlanması zorlu bir biyolojik sorundur. RNA bağlayıcı protein için bağlayıcı bir alanın tanımlanması için yinelemeli bir yaklaşım burada açıklanmıştır ve tüm RNA bağlayıcı proteinler için geçerlidir.

Düzenleyici RNA Bağlayıcı Proteinler için Bağlayıcı Siteleri Belirlemek için Sıra Alanını Keşfetmek

Standart yöntemlere göre daha az önyargılı ve 2'-O-metil RNA'lar için artan hassasiyetiçeren ayrıntılı bir küçük RNA kütüphane telafi protokolü saiyoruz. Bu protokol maliyet tasarrufu veya kolaylık sağlamak için kitleri kullanarak ev yapımı reaktifler kullanılarak izlenebilir.

Küçük RNA-seq iyileştirilmesi: Daha Az Önyargı ve 2'-O-Metil RNA'ların Daha İyi Tespiti

Burada, bir cDNA ara ürünü olmadan kısa RNA'yı (çalışma başına &lt;35 nt) dizilemek için doğrudan bir yöntem olarak ve tek bir çalışmada tek baz hassasiyetinde farklı nükleotid modifikasyonlarını dizilemek için genel bir yöntem olarak kullanılabilen LC-MS tabanlı bir dizileme yöntemi için ayrıntılı bir protokol açıklıyoruz.

2D-HELS MS Seq: Farklı Nükleotid Modifikasyonlarına Sahip RNA Karışımlarının Doğrudan ve de novo Dizilimi için Genel LC-MS Tabanlı Bir Yöntem

MAPS teknolojisi, belirli bir düzenleyici RNA in vivo'nun targetom'ını incelemek için geliştirilmiştir. İlgi çekici sRNA, RNA ortaklarının birlikte arındırılmasını ve RNA dizilimi ile tanımlanmasını sağlayan bir MS2 aptamer ile etiketlenmiştir. Bu modifiye protokol özellikle Gram-pozitif bakteriler için uygundur.

MS2-Benzeşim Saflaştırma gram-pozitif bakterilerde RNA Dizilimi ile birleştiğinde

Protokol, mutasyonel profilleme deneyleri için RNA'nın dimetil sülfat ile modifiye edilmesi için talimat sağlar. İki alternatif kütüphane hazırlama yöntemi ile in vitro ve in vivo problama içerir.

RNA Yapısının Dimetil Sülfat Mutasyonel Profillemesi ile İn Vitro ve İn Hücre Dizilimi ile İncelenmesi

Öğrenin, canlı hücrelerde RNA bağlayan proteinleri ve bağlanma bölgelerini kütle spektrometresiyle haritalama yöntemini. Fare embriyonik kök hücrelerinde UV fotokrosbağlama kullanarak epigenetik düzenleyicilerin RNA etkileşimlerini inceleyin.

Kütle spektrometresi tabanlı kimlik RNA-bağlama bölgelerinin için numune hazırlama

Daha fazla video keşfet