IRE / IRP Örnek: RNA-protein Etkileşimleri Çalışmaları elektroforetik hareketlilik Shift Testi (EMSA)

Aşağıdaki deneyin genel amacı, bir elektroforetik hareketlilik kayması testi kullanarak hücre ekstraktlarından RNA protein etkileşimlerini analiz etmektir. Bu, önce hücrelerden veya dokulardan ayrı bir aşamada bir protein ekstraktı hazırlanarak elde edilir, gene özgü radyo etiketli bir RNA probu sentezlenir ve saflaştırılır. Protein özütü daha sonra spesifik RNA protein komplekslerinin oluşumuna izin vermek için etiketli RNA probu ile karıştırılır.

Son olarak, reaksiyon ürünü denatüre olmayan bir poli akrilamid jel üzerine yüklenir ve elektroforez içermeyen RNA probu ile analiz edilir, daha hızlı hareket kabiliyeti sayesinde RNA protein komplekslerinden ayrılır. Elektroforetik hareketlilik kayması testi, RNA protein etkileşimlerini analiz etmek için yaygın olarak kullanılmaktadır. Demir düzenleyici proteinlerin, IRP bir ve IRP iki'nin hedef RNA elementlerine bağlanmasını analiz edebiliriz.

Ancak yöntem, bu prosedürün laboratuvarımdaki Filipin araştırma görevlisi Dr.Kain Philippine ve bulaşıklarda yetiştirilen yapışkan hücreler için doktora sonrası bir araştırmacı olan Dr.Nicole Wilkinson tarafından yapılacağını gösteren diğer RNA bağlayıcı proteinlerin çalışması için de uygulanabilir. Hücreleri buz gibi soğuk PBS ile iki kez yıkayın, ardından bir mililitre buz gibi soğuk PBS ekleyin ve hücreleri plastik bir hücre kazıyıcı ile hasat edin. Gevşek hücre süspansiyonunu 1,5 mililitrelik yeni bir santrifüj tüpüne aktarın.

Tüpü önceden soğutulmuş dört santigrat derece mikro santrifüje yerleştirin. Beş dakika boyunca düşük bir hızda döndürün ve supnatantı aspire edin. Hücreler, tüpün dibinde beyaz bir pelet olarak görünecektir.

Hasat edilen her 10 milyon hücre için 100 mikrolitre buz gibi soğuk sitoplazmik lizis tamponu ekleyin. Birkaç kez yukarı ve aşağı pipetleyerek hücre peletini gevşetin ve ardından süspansiyonu buz üzerinde 20 dakika inkübe edin. Bu, hücresel zarı çözündürecek ve tüm sitozolik içeriği tampona bırakacaktır.

Çözünmüş sitozolik fraksiyonu izole etmek için, tüpü dört santigrat derecelik bir santrifüjde 10 dakika boyunca tam hızda döndürün, arıtılmış snat'ı buz üzerinde yeni bir 1.5 mililitrelik tüpe aktarın ve peleti atın. Daha sonra, Bradford testini kullanarak elde edilen sitoplazmik ekstraktın toplam protein konsantrasyonunu belirleyin. Elde edilen sitoplazmik ekstraktı daha küçük tüplere ayırın ve taze dokulardan sitoplazmik ekstraktlar üretmek için kullanılana kadar eksi 80 santigrat derecede saklayın.

Ötenazi yapılmış hayvanı bir diseksiyon tahtası üzerinde temiz bir ped üzerine koyarak hasat işlemine başlayın. Karnı makasla açın. Makas ve forseps kullanarak karaciğeri ve dalağı çıkarın.

Doku bozulmasını önlemek için her dokuyu yaklaşık 50 mililitre buz gibi soğuk PBS'de durulayın. Dokuları hemen gecikmeden bir neşter ile yaklaşık bir ila iki milimetreküp küçük parçalar halinde kesin. Dokuları yeni bir kriyo tüpüne yerleştirin ve çekin.

Bir numuneyi sıvı nitrojen içinde dondurun. Donmuş dokuları eksi 80 derecede ihtiyaç duyulana kadar saklayın. Önceden donmuş doku örneğini 250 ila 500 mikrolitre buz gibi soğuk lizis tamponu içeren düz tabanlı iki mililitrelik bir tüpe aktararak sitoplazmik ekstraktı yapmaya başlayın.

Tüpe bir doku homojenizatör ucu yerleştirin ve cihazı orta güçte açın. 10 saniye homojenizasyondan sonra, protein denatürasyonunu önlemek için tüpü hemen 20 dakika boyunca buzun üzerine koyun. Sitozolik fraksiyonu izole etmek için, tüpü dört santigrat derece santrifüjde 10 dakika boyunca tam hızda döndürün, arıtılmış süpernatanı buz üzerinde yeni bir 1.5 mililitrelik tüpe aktarın ve peleti atın.

Bradford testini kullanarak elde edilen sitoplazmik ekstraktın toplam protein konsantrasyonunu belirleyin. Elde edilen sitoplazmik ekstraktı daha küçük tüplere akulayın ve ihtiyaç duyulana kadar eksi 80 santigrat derecede saklayın. Protokole devam etmeden önce, pleksiglas kalkan Geiger sayacı ile tamamlanmış radyasyona dayanıklı bir çalışma tezgahı kurun.

Laboratuvar önlükleri ve uygun radyasyona özgü kesici ve keskin olmayan atık kapları üzerindeki sitometri monitör etiketleri yapın. Klonlanmış bir demir yanıt elemanı içeren de doğrusallaştırılmış bir DNA plazmidi ile başlayarak. Bir şablon olarak, şablon reaksiyon tamponunu, kısmen radyoaktif nükleotidleri ve RNA polimerazı oda sıcaklığında bir pipetle karıştırarak 20 mikrolitrelik bir in vitro RNA transkripsiyon reaksiyonu ayarlayın.

RNA sentezini başlatmak için, numuneyi bir saat boyunca 40 santigrat derecede inkübe edin. Bir mikrolitre 0.5 molar EDTA pH 8.0 ekleyerek in vitro transkripsiyon reaksiyonunu sonlandırın. EDTA'yı yukarı ve aşağı pipetleyerek karıştırın.

Şimdi RNA ürününü saflaştırmak için standart bir alkol çökeltme protokolü kullanın. Başlamak için, sentez sonrası karışıma ve girdaba pH 5.2'de 10 mikrolitre TRNA ve 82.5 mikrolitre üç molar sodyum asetat ekleyin. Karıştırmak için, TRNA bir çökeltme taşıyıcısı görevi görecek ve RNA'yı çökeltmek için nihai RNA verimini artıracaktır.

273 mikrolitre %95 ila %100 etanol ekleyin ve girdaplama ile karıştırın. RNA'yı izole etmek için tüpü oda sıcaklığında 10 dakika tezgah üzerinde bırakarak çökeltme reaksiyonunun ilerlemesine izin verin, tüpü oda sıcaklığındaki bir santrifüjde 10 dakika boyunca tam hızda döndürün. Bir pipetle, süpernatanı dikkatlice atın ve peleti rahatsız etmeyin.

Çökelmiş RNA, tüpün dibine yakın küçük beyaz bir pelet olarak bulunabilir veya çıplak gözle görülemeyebilir. 100 ila 500 mikrolitre% 70 etanol ekleyerek peleti yıkayın. Numuneyi oda sıcaklığında 10 dakika boyunca tam hızda döndürün ve ardından snat'ı kapakla boşaltın.

Tüpü tezgahta 10 ila 15 dakika açık bırakarak RNA peletini açın. 100 mikrolitre nükleaz içermeyen su ekleyerek katı radyo etiketli RNA'yı sulandırın. RNA çözeltisini sıvı bir sation Counter Eloqua'ya yerleştirerek radyoaktif nükleotid katılımının kapsamını ölçün.

Radyo etiketli RNA Probunu daha küçük tüplere yerleştirin ve ihtiyaç duyulana kadar eksi 80 santigrat derecede saklayın. Dondurulmuş alikotlar, elektroforetik hareketlilik vardiya testine başlamadan önce üç haftaya kadar kullanılabilir, şerit başına daha büyük numune hacimlerini kolaylaştırmak için en az 16 x 16 santimetre boyutunda standart% 6 denatüre olmayan akrilamid jel hazırlayın. Ve bu boyuttaki bir jelin mekanik stabilitesini arttırmak için.

En az bir milimetre kalınlığında cam ara parçalar ve taraklar kullanın. Elektroforetik hareketlilik vardiya testine başlamak için, deneyin protein bileşeni için önceden donmuş sitoplazmik lizatı ve gözlerdeki radyo etiketli RNA problarını çözün. 25 mikrogram sitoplazmik ekstraktın sitoplazmik lizis tamponu ile toplam 10 mikrolitrelik bir nihai hacme seyreltin.

Gerektiğinde, karışıma bir mikrolitre iki me stok çözeltisi ekleyin ve protein örneğini buz üzerinde tutun. RNA bileşeni için, radyo etiketli RNA probunu nükleaz içermeyen suda mikrolitre ısı başına dakikada 200.000 sayıma kadar seyreltin ve RNA'yı 95 Santigrat derecede bir dakika boyunca doğallaştırın ve çözeltiyi oda sıcaklığında en az beş dakika soğutun. Protein RNA bağlanma reaksiyonunu başlatmak için, protein ekstraktına bir mikrolitre radyo etiketli RNA probu ekleyin, bağlanmanın oda sıcaklığında 20 dakika boyunca gerçekleşmesine izin verin.

Elektroforetik hareketlilik kaydırma testinin özgüllüğünü artırmak için, reaksiyona bir mikrolitre heparin stoğu ekleyin. Radyoaktif işaretli RNA probları 60 nükleotidden daha uzunsa, bir mikrolitre RNA T daha ekleyin. Özgüllüğü daha da artırmak ve RNA protein kompleksinin daha iyi ayrılmasına izin vermek için bağlanma reaksiyonunun oda sıcaklığında 10 dakika daha devam etmesine izin verin.

Üç mikrolitre yükleme tamponu ekleyin ve karıştırmak için yukarı ve aşağı pipetleyin. Daha sonra tüm reaksiyonu %6 akrilamid jele yükleyin ve jeli 60 dakika boyunca santimetre başına beş voltta çalıştırın. Cihazı uygun radyasyon kalkanı ile kapladığınızdan emin olun.

Jel aparatını sökün ve jeli büyük bir filtre kağıdına aktarın. Jeli karanlık bir odada jel kurutma vakum cihazı kullanarak kurutun. Jel ve filtre kağıdı kombinasyonunu bir parçanın üzerine yerleştirin.

Maruz kaldıktan sonra film, filmi geliştirin ve havayla kurutun. Optimum maruz kalma süresi bir saatten bir geceye kadar değişebilir. Değişken demir içerikli doku kültürü hücrelerinde I RRP bir ve I RRP iki'nin radyoaktif IRE problarına demire bağlı bağlanma kapasitesi değerlendirilebilir.

Bu nedenle, IRE bağlanma aktivitesi, daha önce K daha sonra deferoksamin ile muamele edilmiş demir tükenmiş hücrelerde indüklenir. Tersine, IRE bağlanma aktivitesi, daha önce demir yüklü hücrelerde heman ile muamele edilmiş demir yüklü hücrelerde baskılanır. I RRP bir'in IRE bağlanma aktivitesi, bir demir kükürt kümesinin montajını takiben kaybolurken, I RRP iki demire bağlı bozunmaya uğrar.

IRP'nin demir hücre kümesi, hücre ekstraktlarının %2 iki me ile işlenmesiyle yok edilebilir, bu da hareketsiz IRE bağlanma aktivitesinin izlenmesine izin verir. I RRP iki'nin aktivitesi iki ben tarafından kurtarılmaz. Bu sonraki deneyde, hücresel demir konsantrasyonunun bir fonksiyonu olarak I RRP bir ve IRP iki'nin IRE bağlanma aktiviteleri, vahşi tip I RRP bir nakavt ve I RRP iki nakavt farenin taze karaciğer dokuları bağlamında değerlendirilmiştir.

Burada veriler, hepatik demir yükünü arttırdığı bilinen yüksek demir diyetine sahip farelerin beslenmesinin, yabani tip farelerden elde edilen karaciğer ekstraktlarında I RRP bir ve IRP iki'nin IRE bağlanma aktivitelerinde bir azalmayı teşvik ettiğini göstermektedir. I rrp iki IRE kompleksi, I RRP birinin varlığı ile çarpıktır. I RRP bir nakavt farenin karaciğer ekstraktlarında kolayca görselleştirilirler.

Burada, yüksek demir diyeti IRP iki'nin tamamen inaktivasyonuna yol açar. Bu videoyu izledikten sonra, elektroforetik hareketlilik kayması testi ile RNA protein etkileşimlerinin nasıl analiz edileceğini iyi anlamış olmalısınız. RNA probunun kalitesinin başarı için kritik olduğunu unutmayın.