RNA ile İlgili Kromatin DNA-DNA Etkileşim Yöntemi

Belirli RNA molekülleri tarafından organize edilen kromatin temasını haritalamak için RNA ile ilişkili kromatin DNA-DNA etkileşim yöntemini veya RDD yöntemini geliştirdik. RDD, RNA-spesifik kromatin bantlamasını ve endojen ve dıştan RNA'lar arasında uzun menzilli etkileşimi sağlam şekilde haritalar. Başlangıç olarak, Drosophila S2 çift çapraz bağlı hücrelerden türetilen permeabilize çekirdek pelletini, Triton X-100 içeren %0,1 FA lizin tamponunda 15 mililitre yeniden süzülerek hale getirin.

Aliquot 1,5 mililitre nükleer süspansiyonu 14 mililitrelik yuvarlak tabanlı bir test tüpüne yerleştirerek balon oluşumunu önledi. Süspansiyonu %38 genlikle 4,5 dakika boyunca 30 saniyelik açık ve 30 saniyelik kapalı döngülerle sonikle alın. Sonikasyonlu kromatini 15 mililitrelik bir tüpe toplayın ve oda sıcaklığında 20 dakika boyunca 3,200g santrifüj yapın.

Yaklaşık 13 mililitre süpernatantı yeni bir 15 mililitrelik tüpe aktarın. Şimdi, soniklenmiş kromatin içeren tüpe 100 mikrolitre hazırlanmış streptavidin C1 boncukları ekleyin ve oda sıcaklığında 20 dakika döndürün. Sonra, tüpü bir dakika boyunca manyetik bir rafa koyup önceden temizlenmiş kromatini içeren süpernatantı yeni bir 50 mililitrelik tüpe aktarın.

10 mikrolitre aliquotu analiz için eksi 20 derece Celsius sıcaklıkta saklayın. 26 mililitre taze hazırlanmış hibritleşme tamponunu 13 mililitre önceden temizlenmiş kromatin ile bir rotator üzerinde oda sıcaklığında 30 dakika kuluçka yapın. Sonra, hibritizasyon karışımını üç 15 mililitrelik tüplere aliquot yapın ve her numuneye altı mikrolitre 100 mikromolar biyotinillenmiş prob ekleyin.

Tüp kapaklarını film ile mühürledikten sonra, tüpleri gece boyunca 37 derece Celsius'ta döndürün. Streptavidin C1 boncuklarını blokledikten sonra, bloklama tamponu çıkarılır ve boncukları 400 mikrolitre hibridizasyon tamponunda yeniden askıya alın. Şimdi, önceden hazırlanan ilgili hibritize kromatine bloklama tamponu ile işlenmiş streptavidin C1 boncuklarını ekleyin.

Karışımı oda sıcaklığında 2,5 saat döndürün. Üst tamponu atıp boncukları 1,5 mililitrelik bir tüpe aktardıktan sonra, boncukları 800 mikrolitre yıkama tamponuyla beş kez, ardından TE tamponuyla iki kez yıkayın. Son yıkamadan sonra, süpernatantı atın ve boncukları oda sıcaklığında 1X proteaz inhibitörü içeren 1.000 mikrolitre TE tamponunda yeniden askıya alın.

Prob-kromatin kompleksine bağlı streptavidin C1 boncuklarında boş bölgeleri engellemek için, boncuklara 220 mikrolitre denatüre IPB ekleyin ve tüpü oda sıcaklığında 15 dakika döndürün. İnkubasyondan sonra, streptavidin C1 boncuklarını TE tamponu ile beş kez yıkayın. Sonra, streptavidin C1 boncuklarındaki kromatine 693 mikrolitre son onarım karışımı ekleyin ve iyi karıştırın.

Sonra, yedi mikrolitre T4 DNA polimeraz ekleyin. Karışımı termomikserde dakikada 800 devir ve 12 derece Celsius sıcaklıkta 30 dakika boyunca inkübe edin. Sonra örneği 16 derece Celsius sıcaklıkta bir mikserde 15 dakika kuluçka yapın.

Boncukları 800 mikrolitre buz gibi soğuk ChIA-PET tamponu ile üç kez yıkayın ve ardından bir kez TE tamponu ile yıkayın. Sonra, streptavidin C1 boncuklarındaki kromatine 693 mikrolitre A-tailing karışımı ekleyin ve iyi karıştırın. Sonra, yedi mikrolitre Klenow parçasından üç asal ile beş asal eksonukleaz minus ekleyin.

Tüpü mikserde dakikada 12 devir ve 37 derece Celsius sıcaklıkta 50 dakika boyunca kuluçkaya geçirin. Boncukları 800 mikrolitre buz gibi soğuk ChIA-PET tamponu ile üç kez, ardından nazik pipetlemeyle bir kez elution tamponu ile yıkayın. Şimdi, streptavidin C1 boncuklarındaki kromatine 1.390 mikrolitre yakınlık ligasyon karışımı ekleyin ve oda sıcaklığında beş dakika boyunca bir mikserde inkübe yapın.

Karışıma 10 mikrolitre T4 DNA ligaz ekleyin ve oda sıcaklığında dakikada 20 devirde dönüşümle beş dakika boyunca kuluçka yapın, ardından oda sıcaklığında dakikada 12 devirde 50 dakika geçirin ve kuluçkaya gece boyunca 16 derece Celsius'ta devam edin. Sonrasında boncukları 800 mikrolitre buz gibi soğuk ChIA-PET tamponu ile üç kez, ardından TE tamponuyla iki kez yıkayın. Kromatin salımı için, streptavidin C1 boncuklarındaki kromatine 480 mikrolitre LC ChIP elution tamponu ekleyin ve iyi karıştırın.

Çapraz bağlama için 20 mikrolitre 20 miligram/miligram proteinaz K ekleyin. Tüpü bir termomikserde dakikada 950 devir ve 65 derece Celsius ile gece boyunca kuluçkalayın, ardından yakınlık bağlantılı DNA'yı fenol:kloroform:izoamil alkol reaktifiyle arıtın. Tn5 etiketleme testi için gerekli tüm bileşenleri, buz üzerinde PCR tüpünde toplam 50 mikrolitre reaksiyon hacminde toplayın.

Etiketleme reaksiyonunu kapağı 70 derece Celsius'a ayarlayarak bir termosiklerde 55 derece Celsius'ta 10 dakika kuluçka yapın ve ardından dört derece Celsius'ta tutulun. Etiketlenmiş DNA'ya 50 mikrolitre ChIP elusyon tamponu ve bir mikrolitre proteinaz K ekleyin. Çözeltiyi karıştırın ve termomikserde 65 derece Celsius ve dakikada 900 devirde 30 dakika kuluçka yapın.

DNA'yı bir DNA arıtma kiti ile arındırın ve otomatik kapiller elektroforez sistemi ile DNA'yı nicelikle ölçün. Tüm parçalanmış ligasyonlu DNA'yı bloklayıcı tampon ve genomik DNA ile önceden bloklanmış M280 boncuklarına ekleyin ve süspansiyonu karıştırın. Tüpü oda sıcaklığında bir mikserde 45 dakika döndürün.

Kısa bir dönüşten sonra, tüpü manyetik bir rafın üzerine koyup üst yüzeyi at. Yıkama adımlarını takip ederek, boncuklara karıştırmadan 30 mikrolitre elusiyon tamponu ekleyin. PCR karışımını DNA kütüphanesi hazırlık kitine göre hazırlayın.

PCR tüplerini bir PCR makinesine aktarın ve amplifikasyon programını kurun. Son olarak, PCR ürünü manyetik boncuklarla arıttıktan sonra, örnek dizileme için hazırlanmak için nüklein asit niceleyici kullanarak 10 ila 30 nanogram kütüphane DNA'sı ölçülür. Soniklenmiş kromatin parçaları yaklaşık 1.000 ila 3.000 baz çifti arasında değişiyordu ve bu da başarılı parçalanmaya işaret ediyordu.

RNA ile ilişkili kromatin, yaklaşık 1.000 ila 3.000 bazı çift arasında bir parça boyutu aralığı gösterdi. Tn5 ile etiketlenmiş kromatin, kromatin etiketleme etkinliğine işaret eden bir parça dağılımı göstermiştir. Amplifikasyondan sonra dizileme kütüphanesi, yaklaşık 180 ile 1.000 baz çifti arasında değişen bir parça boyutu dağılımı göstermiştir.

Boyut seçiminden sonra, dizileme kütüphanesi parçaları ağırlıklı olarak yaklaşık 250 ila 600 baz çifti aralığında zenginleştirildi. RNA ile ilişkili kromatin DNA-DNA etkileşimi veya RDD yöntemi, NC RNA roX2 ve 7SK bağlanmasının genomik konumlarını ve ilgili uzak kromatin etkileşim döngülerini tespit etti. RNA polimeraz II ChIA-PET'ten elde edilen veriler, bu NC RNA'ları ile gen ekspresyonları arasında net bir düzenleyici ilişki ortaya koymakta olup, zirveler etkileşim gücünü gösterir.

Çok boyutlu analiz, RDD bağlantılı etkileşimlerin Hi-C genom çapında kromatin konformasyon haritaları ve epigenomik işaretler, yeni başlayan transkripsiyon ve RNA polimeraz II ChIA-PET verileriyle entegre edilmesiyle gerçekleştirilmiştir. Bu bölgelerde, topolojik olarak ilişkilendiren alanlar net şekilde görselleştirildi; RNA rehberli kromatin döngüleri genellikle sınırlarında veya birden fazla bu alanı kapsıyordu. Ayrıca, RNA merkezli düzenleyici merkezler belirlendi.

RDD yöntemi ve 3D genom organizasyonunda RNA bağlanma noktalarını ve ilişkili DNA-DNA etkileşimlerini ortaya koyan sabitlenmiş kromatin etkileşimleri. Ana öğretiler, doğru prob, linker ve kromatin oranlarını korumak ve polimeraz ligasyonu öncesi doğal biotinle sınırsız streptavidin bölgelerini bloklamaktır. Gelecekteki çalışmalar, RNA'nın gelişim, bozulmalar ve enfeksiyonlar boyunca kromatin etkileşimlerini dinamik olarak nasıl sardığını keşfedebilir.