Een high-throughput-methode voor zebravis sperma cryopreservatie en In Vitro Bevruchting

Hallo, ik ben Bruce Draper van de University of California Davis, afdeling Molecular and Cellular Biology, en ik ben Cecilia Moans van de Division of Basic Science bij het Fred Hutchinson Cancer Research Center in Seattle. Vandaag gaan Cecilia en ik het protocol voor de cryoconservering van zebravisperma demonstreren, wat een modificatie is van het oorspronkelijke Brian Harvey-protocol. We zullen laten zien dat het, door in teams van twee te werken, mogelijk is om sperma van 100 individuele mannetjes in minder dan twee uur te cryoconserveren.

Hoewel er een breed scala aan fertiliteit is na het ontdooien, is de fertiliteit gemiddeld 25%, en dit is afkomstig uit een bibliotheek die meer dan zeven jaar is cryogepreserveerd. Laten we beginnen. Voordat u deze procedure uitvoert, maakt u eerst de spermavriesoplossingen.

De Ginsburg Fish ringer-oplossing wordt elke drie dagen vers bereid, en het vriesmedium wordt dagelijks vers gemaakt, zowel met als zonder methanol. De samenstelling van deze oplossingen is te vinden in de online aanvullende informatie bij dit protocol. De materialen die bij deze procedure worden gebruikt, kunnen de vries- en dooisnelheid beïnvloeden, wat op zijn beurt de fertiliteit van bevroren sperma kan beïnvloeden.

Om deze reden wordt er ook een lijst met aanbevolen materialen verstrekt als aanvullende online informatie. Het is raadzaam om het sperma te invriezen op fijngecrushte droogijs in plaats van op droogijspellets. Een eenvoudige manier om droogijs te crushen is door het in een handdoek te wikkelen en met een hamer te vermalen.

Een efficiëntere methode is het gebruik van een droog-ijs grinder, zoals een claws model RE two, om zebravisperma te bevriezen. Markeer eerst capillaire buisjes van 10 µL met een laboratoriumstift op het niveau van 3,33 µL of ongeveer 16,7 mm vanaf de bodem. Om de mannetjes te anestheseren, plaatst u twee tot vier mannetjes in een bekerglas met verdunde trica in viswater. Het recept hiervoor kan worden gevonden in het zebravisboek.

Zodra de vis is verdoofd, tilt u deze met een plastic lepel uit het verdovingsmiddel en dep u de vis voorzichtig droog met een papieren handdoek. Besteed speciale aandacht aan het drogen van de ventrale zijde. Water activeert sperma, dus het is cruciaal om rond de ika grondig te drogen.

Positioneer de vis met de ventrale zijde naar boven op de sponshouder. Als het gebied rond de buikvinnen nog vochtig is, droog dit dan voorzichtig af met een Kim wipe. Plaats de gemarkeerde capillaire buis in een rubberen mondpipetadapter die bij de capillaire buizen is geleverd.

De adapter is een rubberen slang met een mondstuk aan het ene uiteinde en een capillairhouder aan het andere uiteinde. Alternatief kan de capillaire buis worden aangesloten op een Hamilton-spuit van 50 µL. Plaats het mannetje met behulp van een kort stukje tigon-slang van de juiste diameter onder de microscoop en leg de urogenitale opening bloot door de pelvicvinnen voorzichtig uit elkaar te spreiden.

Gebruik het uiteinde van de capillaire buis om het sperma te laten ontsnappen door voorzichtig over de flanken van de vis te strijken met gladde pincetten, of door de flanken van de vis voorzichtig samen te knijpen met de wijsvinger en duim; verzamel het sperma in een capillaire buis terwijl het wordt uitgestoten door middel van zachte zuigkracht. Vermijd feces die samen met het sperma kunnen worden uitgestoten. Het streefvolume van het sperma is 3.3 microliters.

De minimale acceptabele hoeveelheid sperma varieert afhankelijk van de kwaliteit van het sperma. Goed sperma is wit en opaak, terwijl arm sperma er waterig uitziet. Over het algemeen is de minimale acceptabele hoeveelheid sperma 1 µL van goed sperma of een derde van het streefdoel, en 2 µL van arm sperma of twee derde van het streefdoel.

Indien het spermavolume het doelvolume van 3,3 microliter niet bereikt, dient het volume tot de markering op de pen te worden genormaliseerd met vriesmedium zonder methanol. Indien het volume van het sperma de markering op de capillaire buis reeds bereikt of overschrijdt, kan worden doorgegaan naar de volgende stap. Voeg nu de cryoprotectant toe aan het sperma.

Zuig vriesmedium met methanol op tot aan de oranje markering. Het totale volume is nu ongeveer 20 microliters. Breng het mengsel van sperma en cryoprotectant voorzichtig over op een schoon oppervlak van een horlogeglas en meng dit door het ongeveer vier keer op te zuigen en weer uit te stoten via pipetteren, waarbij moet worden voorkomen dat er luchtbellen ontstaan.

Verdeel het sperma in twee cryovials door 10 µL van de cryoprotectant-oplossing voor sperma in de bodem van elke gelabelde vial te pipetteren. Sluit de vials snel af en plaats elke cryovial in een aparte Falcon-buis van 15 ml. Sluit de Falcon-buizen bij kamertemperatuur af en plaats ze in fijngepoederd droogijs.

De buisjes moeten diep genoeg worden ingevoerd, zodat alleen de doppen zichtbaar blijven om de falcon-buisjes te kunnen volgen. Nummeer ze en noteer het tijdstip waarop elk buisje in het droogijs wordt geplaatst. Laat het sperma 20 minuten lang invriezen in het droogijs.

Nadat het sperma is ingevroren, worden de twee cryovials overgebracht naar een Dewar-fles met vloeibare stikstof voor tijdelijke opslag. Plaats de vriesdoos in een bad van vloeibare stikstof zodat de monsters niet opwarmen.

Gebruik een lange metalen tang om de vials uit de Dewar-kolf te halen en hanteer deze met cryohandschoenen. Alternatief kunnen cryovials direct van het droogijs naar de vriezer worden overgebracht. Als de vriesdoos voor langdurige bewaring in een piepschuimcontainer is ondergedompeld in vloeibare stikstof, plaats de cryovials dan in een cryogene vloeibare stikstofvriezer.

Om de levensvatbaarheid van het sperma te behouden, is het cruciaal dat de vials ondergedompeld in vloeibare stikstof worden bewaard; vials die in de dampfase worden bewaard, kunnen na verloop van tijd hun levensvatbaarheid verliezen. Snelheid is eveneens van kritiek belang voor het behoud van de levensvatbaarheid van het sperma. De tijd tussen het toevoegen van het cryobeschermingsmiddel en het plaatsen van de spermavials op droogijs mag niet langer dan 30 seconden bedragen. In vitro fertilisatie.

Het gebruik van cryogepreserveerd sperma verloopt het beste met twee personen. Eén persoon perst de eitjes uit de vrouwtjes, terwijl de andere persoon het sperma ontdooit. Stel een waterbad in op 33 °C.

Haal een cryovial uit de vloeibare stikstofvriezer en breng deze over naar een vat of fles met vloeibare stikstof totdat deze klaar is om te ontdooien. Knijp eitjes uit geanestheseerde vrouwtjes in een plastic Petrischaal van 35 millimeter. Dit wordt in detail beschreven in het JoVE-protocol met de titel Making Gyno Genetic deployed zebrafish by early pressure, waarin een gedetailleerde beschrijving van zebravissen wordt gegeven.

Bij in vitro fertilisatie bevat een goede clutch meer dan 150 eieren die uniform en gelig van kleur zijn. Elk wit residu duidt op degradatie. Probeer, indien mogelijk, drie clutches eieren te verkrijgen en deze in één schaal samen te voegen.

Als er binnen één minuut na de eerste clustering geen drie goede clusters zijn verkregen, ga dan door naar de volgende stap. Houd de schaal afgedekt terwijl het sperma wordt ontdooid. Verwijder ondertussen de vial uit de vloeibare stikstof en verwijder de dop.

Dompel het vial snel tot de helft onder in een waterbad van 33 °C gedurende acht tot 10 seconden. Voeg snel 70 µL Hank's gebufferde zoutoplossing op kamertemperatuur toe aan het vial en meng door herhaaldelijk op te zuigen en uit te stoten met de pipet; voeg dit onmiddellijk toe aan de eitjes in de Petrischaal en meng voorzichtig met de pipetpunt. Activeer vervolgens onmiddellijk de sperma en eitjes door 750 µL viswater toe te voegen, wervel om te mengen en incubeer vijf minuten op kamertemperatuur.

Vul na vijf minuten de schaal met vissen en water en incubeer bij 28 graden Celsius. Tel na twee tot drie uur de levensvatbare embryo's en breng deze over naar schalen van 100 millimeter, met 50 embryo's per schaal. Tel daarnaast ook de bevruchte eieren, zodat de fertiliteit van het spermaproefmonster kan worden bepaald.

Spermafertiliteit is de ratio van levensvatbare embryo's ten opzichte van het totaal aantal eicellen dat is gebruikt voor de in vitro fertilisatie. Eicellen kunnen op elk moment tussen twee en zes uur na de in vitro fertilisatie worden gesorteerd. Wanneer infertiele eicellen gemakkelijk te onderscheiden zijn van levensvatbare embryo's, zijn de infertiele eicellen helder en ongedeeld.

Wanneer bekeken met trans-illuminatie op een stereomicroscoop, varieert de gemiddelde fertiliteit van cryopreservatieve sperma sterk. Het zou echter mogelijk moeten zijn om een gemiddelde fertiliteit van 25% te bereiken die gedurende meerdere jaren stabiel blijft. Deze grafiek toont het gemiddelde fertiliteitspercentage van sperma dat is ingevroren tussen 2001 en 2003 en is ontdooid tot recent in 2008.

We hebben zojuist een methode met een hoge doorvoersnelheid gedemonstreerd voor de cryopreservatie van zebravisperma. Bij het uitvoeren van dit protocol is het belangrijk om alle aanbevolen kunststofmaterialen en apparatuur te gebruiken, en om gepulveriseerd, gekrushed droogijs te gebruiken in plaats van droogijspellets. Het is cruciaal om sperma en eicellen van zeer hoge kwaliteit te gebruiken; in het geval van de eicellen bij de in vitro fertilisatie na het ontdooien van het sperma, is het belangrijk om een zo groot mogelijk aantal eicellen te gebruiken om het aantal vruchtbare embryo's aan het einde te verhogen, wat mogelijk drie tot vier vrouwtjes vereist.

Een ander cruciaal onderdeel van het protocol is de snelheid. Het mag nooit langer dan ongeveer een minuut duren vanaf het moment dat het sperma van het mannetje wordt uitgedrukt tot het in het droogijs wordt geplaatst. Nou, ik denk dat dit alles is.

Veel succes met uw experimenten.