Sequentiële immunofluorescentie en immunohistochemie op Gecryode zebravis-embryo's

Dit protocol toont een nieuwe procedure aan voor sequentiële immunofluorescentie en immunohistochemie op cryosections van vroege fase zebrafish embroys, die nauwkeurige colokalisatieanalyses in specifieke celpopulaties mogelijk maakt. Het belangrijkste voordeel van dit protocol is de flexibiliteit. Het combineert immunofluorescentie en immunohistochemie technieken met behulp van een enkele cryosection om weefselmorfologie, co-lokalisatie van expressie en antilichaam compatibiliteit te maximaliseren.

Dit protocol kan worden toegepast op andere vissen of amfibische modellen, omdat deze onderzoekers vaak te maken hebben met vergelijkbare complicaties met de beschikbaarheid van antilichamen en vaak vergelijkbare soorten experimenten uitvoeren. Werken met een vroeg stadium embryo cryosections kan lastig zijn, omdat ze klein zijn en cryosectioning kan een uitdaging zijn, maar geavanceerde voorbereiding en praktijk zal helpen verlichten eventuele strijd in deze methode. Er zijn meerdere stappen in ons protocol die specifieke behandeling en zorg vereisen en kan moeilijk te beheersen zijn zonder iemand te zien tonen van de technieken.

Om te beginnen, overdracht vorige vaste en bereid achtenveertig uur na bevruchting chimeric zebrafish embryo's van een buis met 15 25 OKT mengsel naar een plastic mal met behulp van tangen minimaliseren van elke overdracht van het mengsel. Vul de mal ongeveer de helft met OCT medium en meng de embryo's er voorzichtig in. Bereid gelabelde plastic mallen en breng de gewenste embryo's in de lege gelabelde plastic mallen, het minimaliseren van overdracht van OCT medium.

Vul vervolgens voorzichtig met OCT medium tot de bovenkant van de mallen met embryo's. Werken onder een licht stereo microscoop voor visualisatie, gebruik naalden om embryo's te regelen in de gewenste oriëntatie. Plaats vervolgens de bereide mallen in een geïsoleerde container met een metalen platform en vries ze op droogijs.

Plaats een ijsemmer voorzichtig over het metalen platform om een koude kamer te creëren en bevries ongeveer 30 minuten. Met behulp van een cryostat ingesteld op min 20 graden Celsius, snijd de ingebedde embryo's in 10 tot 12 micrometer dikke cryosections terwijl het controleren van de diepte van de sectie periodiek op een microscoop om de locatie en weefsel te controleren. Plaats de secties op geladen glazen platen en de lucht droog ze op kamertemperatuur 's nachts.

Was de glijbanen drie keer gedurende vijf minuten in 1X PBS in een geschikte container. Leg de glijbanen op een vlakke ondergrond in een vochtige kamer. Gebruik een barrièrepen om de secties te schetsen om vloeistof op de dia's te houden.

Pipette 200 microliters blokbuffer per sectie en incubeer in blokbuffer gedurende twee uur bij kamertemperatuur. Bereid de primaire antilichaamverdunning en blok buffer en meng goed door pipetting. Tip de glijbanen voorzichtig om de blokbuffer af te voeren en terug te keren naar de vochtige kamer.

Pipette 200 microliter van primaire antilichaamoplossing per sectie op de glijbanen en 200 microliter blokbuffer op de juiste secties als controle. Incubeer de glijbanen op vier graden Celsius 's nachts in een vochtige kamer gevuld met gedeïmiseerd water ervoor te zorgen dat de randen van de kamer te verzegelen om te helpen vocht vast te houden. Was de glijbanen drie keer gedurende vijf minuten in 1X PBS en in een geschikte container.

Bereid de secundaire antilichaamverdunning tijdens het wassen en blok buffer en meng goed door pipetting. Nadat u de glijbanen op een vlak oppervlak in een vochtige kamer hebt gelegd, voegt u 200 microliters secundaire antilichaamoplossing per sectie toe. Incubeer de glijbanen in secundaire antilichaamoplossing bij kamertemperatuur in het donker gedurende 30 minuten.

Was de glijbanen drie keer gedurende vijf minuten in 1X PBS in een geschikte container. Na het plaatsen van de glijbanen op een vlakke ondergrond, voeg de nucleaire kleuroplossing op elke sectie en incubbate bedekt gedurende 10 minuten. Na het aftappen van de nucleaire kleuroplossing, monteer de glijbanen met niet-verhardende tl-bevestigingsmedia en een glazen afdekbrief.

Zorg ervoor dat ze in het donker te houden op vier graden Celsius tot beeldvorming. Plaats de glijbanen in afzonderlijke containers met 1X PBS en berg plat op vier graden Celsius 's nachts, terwijl zachtjes roeren om de cover slips genoeg los te maken, zodat ze zullen komen uit wanneer geagiteerd. Zorg ervoor dat u niet op de afdekstrook drukt of probeer de afdekbrief handmatig te verwijderen, maar wacht tot ze er met minimale geforceerde beweging vandoor gaan.

Nadat de afdekslipjes zijn verwijderd, breng je de glijbanen voorzichtig over in een container met verse 1X PBS. Verwijder de 1X PBS en incubaal de dia's in 1X tris-gebufferde zoutoplossing met 0,1% van een niet-ionische oppervlakteactieve agent drie keer gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Incubeer de dia's in 3%waterstofperoxide oplossing bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten.

Leg vervolgens de dia plat en voeg blok buffer drop verstandig aan het oppervlak. Tip de glijbanen voorzichtig om de blokbuffer af te voeren. Droog het gebied rond de secties en plaats de glijbanen plat in een vochtige kamer.

Voeg 200 microliter primaire antilichaamoplossing per sectie toe aan de dia's en broeder 's nachts in vochtige kamer bij vier graden Celsius. Tip de glijbanen voorzichtig om de primaire antilichaamoplossing af te voeren en was twee keer gedurende vijf minuten in 1X TBST. Breng vervolgens gebruiksklaar achtergrond verminderen blokkeren reagens drop verstandig om elke sectie, en uitbroeden in vochtige kamer bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten.

Tip de glijbanen voorzichtig om de blokbuffer af te voeren. Droog het gebied rond de secties voorzichtig af en plaats de glijbanen plat in een vochtige kamer. Breng een kant-en-klare secundaire antilichaamoplossing aan op elke sectiedruppel en incubeer gedurende 30 minuten in vochtige kamer bij kamertemperatuur.

Tip de glijbanen voorzichtig om de secundaire antilichaamoplossing af te voeren en was twee keer gedurende vijf minuten in 1X TBST. Na het drogen van het gebied rond de secties, plaats de dia's op een vlakke ondergrond en voeg 200 microliters van de HRP chromogene substraat aan elke sectie. Start een timer wanneer het substraat is aangebracht op de eerste dia en uitbroeden bij kamertemperatuur gedurende drie minuten.

Giet de substraatoplossing af. Spoel de glijbanen kort in een geschikte container met 1X PBS en was ze twee keer vijf minuten in gedeïioneerd water met zachte agitatie. Verdring de glijbanen door ze tot 30 seconden in hematoxylin-kleuroplossing te plaatsen en drie keer gedurende vijf minuten in gedeïsatiseerd water te wassen.

Broed de glijbanen in een container met Scott's Tapwater voor een minuut en dan weer wassen drie keer gedurende vijf minuten in gedeïsized water. Dehydrateer de glijbanen door een reeks ethanolsoorten verdund in gedeïoniseerd water en xyleen in een chemische kap. Na het verwijderen van de dia's uit xyleen onmiddellijk tolueen gebaseerd montagemedium toe te voegen en plaats een cover slip.

Om succes te garanderen tijdens het afglijden, is het belangrijk om van de ene kant van de dia naar de andere te werken en tegelijkertijd de afdekslip langzaam te verlagen om bubbels te voorkomen die het weefsel zouden verduisteren. Tot slot, visualiseren en beeld van de dia's met behulp van een samengestelde lichtmicroscoop en digitale camera op 100X vergroting. Specifieke antilichamen die hier worden gebruikt om tegelijkertijd zich vermenigvuldigende cellen en donorcellen te detecteren die geïdentificeerde en gekwantificeerde donorcellen hebben die zich actief vermenigvuldigen.

Na zowel immunofluorescentie als immunohistochemie is het essentieel om beelden van hoge kwaliteit te genereren om individuele cellen nauwkeurig te identificeren. Een beeldanalyseprogramma werd gebruikt om beeldoverlay uit te voeren. Bij een poging tot deze procedure is het het belangrijkste om voldoende vlekken en tegen vlekken dia's tijdens immunohistochemie.

Na deze procedure kunnen aanvullende methoden worden uitgevoerd als wijzigingen in het oorspronkelijke protocol, zoals het gebruik van verschillende antilichaamcombinaties, weefseltypen of soorten. Afbeeldingen kunnen ook op verschillende manieren worden geanalyseerd om relevante gegevens te verkrijgen. Deze techniek stelde ons in staat om te kijken naar co-lokalisatie en meerdere genetische achtergronden als een manier om cel-tot celinteracties te onderzoeken en kon op dezelfde manier worden toegepast als andere technieken die een gedetailleerde colokalisatieanalyse vereisen.

Veel van de reagentia in de immunohistochemie zijn gevaarlijk en moeten dienovereenkomstig worden behandeld. Werk met ethanol, xyleen, en montage stijf moet worden uitgevoerd in de kap. DAB-afval moet worden verwijderd als gevaarlijk afval en na DAB-wasbeurten moeten worden gebleekt.