Visualiseren van Multiciliated cellen in de zebravis via een gecombineerde Protocol van hele Mount fluorescentie In Situ hybridisatie en immunofluorescentie
18 november 2017
Cilia ontwikkeling is essentieel voor goede organogenese. Dit protocol beschrijft een geoptimaliseerde methode om te etiketteren en ciliated cellen van de zebravis visualiseren.
Het algemene doel van dit protocol is om multiciliaire cellen van de zebravis in situ te labelen en visualiseren. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in de ontwikkelingsbiologie, zoals welke factoren multiciliaire sulfaten in de embryonale nier van de zebravis reguleren? Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat zowel eiwitten als RNA-transcripten gelijktijdig kunnen worden gelabeld, wat handig is in afwezigheid van zebravis-specifieke antilichamen.
We hadden eerst het idee voor deze methode toen we multiciliaire cellen in het pronefros gingen labelen terwijl we de aanwezigheid van cilia analyseerden na het aanbrengen van wijzigingen in het embryo. Begin door de zebravis-embryo's 24 uur na bevruchting in vijf milliliter 4% paraformaldehyde gedurende twee tot vier uur op kamertemperatuur te fixeren zonder agitatie. Was vervolgens de embryo's twee keer in PBS met 0,1% Tween 20 of PBST gevolgd door één wassing met vijf milliliter 100% methanol.
Incubeer vervolgens de embryo's in vijf milliliter verse 100% ethanol gedurende minimaal 20 minuten bij minuus 20 graden Celsius. Om de embryo's voor hybridisatie voor te bereiden, rehydrateer de neonaten in vijf milliliter 50% methanol en PBST gedurende vijf minuten gevolgd door vijf minuten in vijf milliliter 30% methanol en PBST. Was de embryo's twee keer gedurende vijf minuten elk in vijf milliliter PBST en incubeer de embryo's in vijf milliliter van een oplossing van 1 op 1000 proteinase K en PBST gedurende twee minuten, onmiddellijk gevolgd door twee extra wasbeurten in vijf milliliter PBST.
Fixeer de embryo's in vijf milliliter 4% paraformaldehyde gedurende ten minste 20 minuten op kamertemperatuur, gevolgd door twee wasbeurten in vijf milliliter PBST 20. Om interacties tussen de embryo's en de hybridisatieoplossing te vergemakkelijken, breng de embryo's over in vijf milliliter PBST in rechtopstaande vlakke bodem microcentrifugebuisjes in een microcentrifuge-rek en was de embryo's twee keer gedurende vijf minuten elk in 1,5 milliliter hybridisatieoplossing. Na de tweede wassing, incubeer de embryo's in 1,5 milliliter verse hybridisatieoplossing op 70 graden Celsius in een hybridisatieoven gedurende vier tot zes uur.
Vervolgens vervang de hybridisatieoplossing door 10 microliter RNA-sonde van belang en 500 microliter hybridisatieoplossing voor een overnachtsonde-hybridisatie bij 70 graden Celsius. De volgende ochtend, was de embryo's twee keer in 1,5 milliliter 50% formamide en 2X saline-natriumcitraatbuffer of SSC gedurende 20 tot 30 minuten per wassing bij 70 graden Celsius. Was vervolgens de embryo's één keer in 1,5 milliliter 2X SSC alleen bij 70 graden Celsius gedurende 15 minuten gevolgd door twee wasbeurten in 1,5 milliliter 0,2X SSC bij 70 graden Celsius gedurende 20 tot 30 minuten per wassing.
Na de tweede wassing, vervang de 0,2X SSC door 1,5 milliliter blokkeringsreagens voor een overnachtelijke incubatie bij vier graden Celsius. De volgende ochtend, vervang het blokkeringsreagens door 0,2 milliliter anti-digoxine in mierikswortelperoxidase en blokkeringsreagens in een verhouding van 1 op 1000 voor een drie uur durende incubatie op kamertemperatuur beschermd tegen licht. Was vervolgens de embryo's twee tot vier keer in 1,5 milliliter appelzuurbuffer gedurende 10 tot 15 minuten per wassing, gevolgd door een overnachtelijke incubatie bij vier graden Celsius in 1,5 milliliter verse appelzuurbuffer.
De volgende ochtend, vervang de appelzuurbuffer door 1,5 milliliter PBS en was de embryo's twee keer in 1,5 milliliter PBS gedurende vijf minuten per wassing. Incubeer de embryo's in 0,2 milliliter Si3 fluorescente staande oplossing gedurende 60 minuten, gevolgd door vier opeenvolgende wasbeurten van 10 minuten in 1,5 milliliter stijgende methanolconcentraties. Na de laatste incubatie, incubeer de embryo's op kamertemperatuur in 1,5 milliliter 1% waterstofperoxide en methanol gedurende 30 minuten.
Was vervolgens de embryo's gedurende 10 minuten per wassing in 1,5 milliliter dalende methanoloplossingen, gevolgd door twee wasbeurten van vijf minuten in 1,5 milliliter PBS. Was vervolgens de embryo's in 1,5 milliliter dubbel gedestilleerd water gedurende vijf minuten, gevolgd door een wasbeurt van zeven minuten in 1,5 milliliter minuus 20 graden Celsius aceton. Was de embryo's in nog eens 1,5 milliliter dubbel gedestilleerd water gedurende vijf minuten, gevolgd door een wasbeurt van vijf minuten in 1,5 milliliter PBST met 1% DMSO of PBDT.
Incubeer de embryo's op kamertemperatuur in 1,5 milliliter PBDT met 10% FBS op een rocker gedurende twee uur. Vervolgens, vervang de PBDT en FBS door 1,5 milliliter van de primaire antilichamen voor een overnachtelijke incubatie bij vier graden Celsius. De volgende ochtend, was de embryo's in 1,5 milliliter PBDT, FBS en 0,1 molair natriumchloride gedurende één minuut met schudden gevolgd door vijf 30 minuten durende schuddende wasbeurten in 1,5 milliliter PBDT, FBS en natriumchloride.
Na de laatste wassing, was de embryo's één keer in 1,5 milliliter PBDT en FBS gedurende 30 minuten met schudden gevolgd door een overnachtelijke incubatie in 200 microliter van de geschikte secundaire antilichamen bij vier graden Celsius beschermd tegen licht. De volgende ochtend, was de embryo's snel twee keer in 1,5 milliliter PBDT, gevolgd door een 15 minuten durende incubatie in 1,5 milliliter DAPI op een rocker. Was vervolgens de embryo's drie keer in 1,5 milliliter PBDT met FBS en natriumchloride gedurende 15 tot 20 minuten per wassing en bewaar de embryo's in 1,5 milliliter PBDT bij vier graden Celsius beschermd tegen omgevingslicht.
Om de nieren van de zebravis te beeldvormen, leg de embryo's lateraal op glazen platen in ongeveer 10 microliter PBDT. Gebruik een paar fijne pincetten en een dissectiemicroscoop om de eerste embryo achter de ogen te knijpen om het hoofd en een deel van de dooierbal te verwijder
Overzicht
Dit protocol beschrijft een methode voor het labelen en visualiseren van multicilieerde cellen in zebravis, wat essentieel is voor het begrijpen van de cilia-ontwikkeling en organogenese.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Ontwikkelingsbiologie
- Celbiologie
- Neurowetenschappen
Achtergrond
- Cilia spelen een cruciale rol bij de ontwikkeling van organen.
- Inzicht in multiciliale cellen kan leiden tot nieuwe inzichten in de nierontwikkeling bij zebravisjes.
- De methode maakt gelijktijdige labeling van eiwitten en RNA-transcripten mogelijk.
- Het biedt een oplossing voor het gebrek aan zebravis-specifieke antilichamen.
Doel van de studie
- Om multiciliaire cellen in de embryonale nier van de zebravis te visualiseren.
- Om factoren te onderzoeken die multiciliaire sulfaten reguleren.
- Om het begrip van de rol van cilia bij de organogenese te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Fixatie van zebravissembryo's in paraformaldehyde.
- Hybridisatie met RNA-sondes bij verhoogde temperaturen.
- Simultane labeling van eiwitten en RNA-transcripten.
- Imaging van embryo's om de aanwezigheid en ontwikkeling van cilia te beoordelen.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle labeling van multiciliere cellen in situ.
- Aangetoonde mogelijkheid om zowel RNA als proteïne te visualiseren.
- Inzichten verschaft in de ontwikkelingsbiologie van zebravisnieren.
- Een betrouwbare methode vastgesteld voor toekomstige studies naar cilia.
Conclusies
- Het protocol is effectief voor het bestuderen van cilia in zebravis.
- Het opent nieuwe wegen voor onderzoek naar ontwikkelingsbiologie en organogenese.
- Simultane labeling verbetert het begrip van cellulaire mechanismen.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Management
Dit protocol maakt gelijktijdige visualisatie van RNA-transcripten en eiwitten in zebravisembryo's mogelijk, wat een belangrijke uitdaging bij targetvalidatie oplost waarbij de beschikbaarheid van antilichamen beperkt is. Door een methode te bieden om genexpressie en eiwitlokalisatie te co-lokaliseren, ondersteunt het mechanische risicoreductie in vroege ontdekkingsprogramma's die gericht zijn op cilia-gerelateerde pathways en renale ontwikkeling. De aanpak verhoogt het voorspellende vertrouwen in fenotypische screening-assays door directe correlatie van transcriptionele regulatie met functionele ciliogenese mogelijk te maken.
Strategische toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt onderzoek naar transcriptionele regulatoren van de ontwikkeling van multiciliaire cellen mogelijk via directe RNA-eiwit co-lokalisatie.
- Operationele waarde: Biedt een alternatieve methode voor doelwitvalidatie in modellen waarin soortspecifieke antilichamen ontbreken, waardoor het aantal bruikbare modelsystemen wordt uitgebreid.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt hypothesetoetsing van lineage-factoren bij ciliopathieën door genexpressie te koppelen aan het cellulaire fenotype.
Screening & Assayontwikkeling
- Klaarheid van de assay: Genereert gestandaardiseerde, reproduceerbare whole-mount preparaten die geschikt zijn voor screening op basis van beeldvorming met een hoge resolutie.
- Kwantitatieve output: Maakt meting van co-expressiepatronen van transcripten en eiwitten mogelijk als functionele readout voor de effecten van verbindingen op ciliogenese.
- Schaalbaarheid: Het protocol maakt gebruik van gangbare laboratoriumreagentia en apparatuur, wat aanpassing over verschillende screeningscampagnes vergemakkelijkt.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Relevantie voor ziekten: Modelleert direct de organogenese van de gewervelde nier en ciliopathie-mechanismen die relevant zijn voor menselijke nierziekten.
- Translationele continuïteit: Slaat een brug tussen bevindingen over genregulatie in de ontdekkingsfase en de preklinische validatie van cilia-afhankelijke fenotypes.
- Mechanistische risicoreductie: Vermindert onduidelijkheid over het doelmechanisme door zowel transcriptionele activatie als eiwitlokalisatie in multiciliere cellen te bevestigen.
Pipeline- en workflowintegratie
De methode past binnen het vroege ontdekkingscontinuüm en ondersteunt de validatie van target-hypotheses voorafgaand aan de lead-identificatie in programma's die gericht zijn op cilia. Het maakt mechanistische follow-up mogelijk nadat fenotypische hits zijn geïdentificeerd in screeningsassays die gericht zijn op ciliogenese of pathways voor nierontwikkeling.
- Discovery Biology: Test transcriptionele regulatie van ciliogene programma's door RNA-transcripten te visualiseren naast structurele eiwitten zoals geacetyleerd alfa-tubuline.
- Screening: Produceert beeldbewerkingsklaare monsters voor geautomatiseerde of handmatige analyse van het aantal, de lengte en de lokalisatie van cilia als fenotypische eindpunten.
- Analytics: Genereert co-lokalisatiegegevens die gekwantificeerd kunnen worden om de overeenkomst tussen genexpressie en eiwitaccumulatie te beoordelen.
- Translational Research: Verbindt bevindingen uit de pronefros van zebravis met mammaliaanse nier-ciliopathie-modellen via geconserveerde transcriptionele regulatoren.
- Enterprise Reuse: Vestigt een herbruikbaar platform voor het bestuderen van elk RNA-eiwit co-lokalisatie-event in embryonale zebravistissues.
Operationele en organisatorische impact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt de betrouwbaarheid van het target door zowel transcriptionele als translationele niveaus van genexpressie in de natuurlijke weefselcontext te valideren.
- Operationele waarde: Verbetert de reproduceerbaarheid door gestandaardiseerde stappen voor fixatie, hybridisatie en immunofluorescentie die compatibel zijn met multi-user core facilities.
- Strategische waarde: Vermindert de afhankelijkheid van antilichaamgeneratie, waardoor de kosten en tijdlijnen voor targetvalidatie in niet-traditionele modellen worden verlaagd.
- Impact op portfolio: Verbetert de kwaliteit van go/no-go-beslissingen door mechanisch bewijs te leveren over target engagement in ziekte-relevante celtypen.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in whole-mount in situ hybridisatietechnieken en immunofluorescentie.
- Afhankelijk van toegang tot hybridisatieovens, confocale microscopen en standaard reagentia voor moleculaire biologie.
- Vraagt om consistente embryonale stadiëring en fixatietiming om reproduceerbare resultaten over verschillende experimenten te waarborgen.
- Vereist optimalisatie van blokkerings- en wascondities bij aanpassing aan verschillende RNA-probes of antilichaamparen.
- Beperkt door weefselpermeabiliteit in latere ontwikkelingsstadia, waardoor optimaal gebruik beperkt is tot embryonale stadia tot 48 hpf.
Biopharma Veelgestelde Vragen
Chapters in this video
0:05
Title
0:50
Embryo Fixation and Hybridization
3:05
Hot Washes, Blocking, Antibody Incubation, and Maleic Acid Buffer Washes
4:27
Probe Detection, Peroxidase Removal, and Immunofluorescence
7:19
Zebrafish Pronephros Mounting and Imaging
8:23
Results: Representative Zebrafish Pronephros and Multiciliated Cell (MCC) Imaging
9:09
Conclusion
