Name: Visualiseren van Multiciliated cellen in de zebravis via een gecombineerde Protocol van hele Mount fluorescentie In Situ hybridisatie en immunofluorescentie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 33 s
Description: Leer multiciliaire cellen visualiseren in de zebravis voor ontwikkelingsbiologie met een gecombineerde in situ-hybridisatie- en immunofluorescentieprotocol.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door de toekenning van R01DK100237 aan R.A.W. en de National Science Foundation Graduate onderzoek Fellowship nr. DGE-1313583 naar A.N.M. Wij danken ook de College van wetenschap zomer Undergraduate Research Fellowship-programma voor steun aan M.U. We bedank het centrum voor Zebrafish onderzoek aan de Universiteit van Notre Dame voor hun specifieke verzorging van onze zebrafish. Wij zouden ook willen bedanken de afdeling biologische wetenschappen, alsmede de leden van ons lab voor al hun steun en waardevolle inzichten.

Het volgende protocol gebruikt zebrafish volwassenen onderhouden en verzorgd door het centrum voor Zebrafish onderzoek aan de Universiteit van Notre Dame. Alle methoden voor het werken met volwassenen van de zebravis en embryo's zijn door de institutionele Animal Care en gebruik Comité goedgekeurd.
1. de embryo fixatie
<ol><li>Verzamelen zebrafish embryo's met behulp van de eerder beschreven methoden39,40. Op 24 hpf, voeg 500 µL van aspecifieke protease mengsel oplossing (50 mg/mL) van de E3 in een embryo schotel Incubate bij kamertemperatuur (RT).</li>
	<li>Zodra embryo's begint uit te breken van de chorion, verwijder alle vloeistof uit de embryo schotel.</li>
	<li>Het wassen van de embryo's 2 - 3 keer met verse E3 door toevoeging van ongeveer 20 mL E3, wervelende zachtjes de E3 in de schotel en vervolgens de vloeistof decanteren in een vloeibare afvalstoffen vergaarbak.</li>
	<li>Om te euthanaseren de embryo's vóór de vaststelling, voeg toe 2 mL 0,2% tricaïne op de E3.</li>
	<li>Breng de embryo's in een 5 mL glazen ampul met behulp van een plastic pipet van Pasteur. Verwijder allermeest naar de oplossing van de tricaïne/E3 met behulp van de pipet nadat de embryo's hebben geregeld naar de onderkant van de flacon.</li>
	<li>Fix 24 hpf embryo's met 4% paraformaldehyde (PFA) 5 mL voor 2-4 h op RT, zonder agitatie. Let op: PFA is giftig en PFA oplossingen moeten worden behandeld onder een chemische motorkap, terwijl de onderzoeker is het dragen van een veiligheidsbril, handschoenen en een laboratoriumjas. Voorbereiding van de PFA-fixeerspray uit de gekorrelde PFA poeder moet worden uitgevoerd met uitzonderlijke zorg, zoals de gekorrelde PFA neigt te verspreiden door middel van statische lading. Opmerking: Embryo's kunnen oplossen in 4% PFA overnacht bij 4 ° C. Bereiden van 4% PFA door verwarming van 1 x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) aan de kook terwijl het voortdurend roeren de oplossing te ontbinden volledig de gekorrelde PFA. Zodra de oplossing is afgekoeld terug naar RT, de 4% PFA filter gesteriliseerd is door het passeren van een wegwerp systeem van 0,45 µm voor vacuüm filtratie, dan en aliquoted in 15 mL of 50 mL porties voor opslag bij-20 ° C.</li>
	<li>Verwijderen van de 4% PFA en wassen embryo's tweemaal met 1 X fosfaatgebufferde zoutoplossing met 0,1% Tween-20 (PBST) op RT. wassen de embryo's keer met 5 mL 100% methanol (MeOH) op RT. Voeg 5 mL vers 100% MeOH op de embryo's en Incubeer bij-20 ° C gedurende ten minste 20 minuten. Opmerking: Embryo's kunnen worden opgeslagen in 100% MeOH bij-20 ° C tot klaar voor de voorbereiding van het embryo.</li>
</ol>2. de embryo voorbereiding en kruising
<ol><li>Hydrateren van de embryo's door het wassen eenmaal in 5 mL 50% MeOH in 1 x PBST voor 5 min op RT. doorgaan rehydratie door het wassen van de embryo's in 5 mL 30% MeOH in 1 x PBST voor 5 min op RT. wassen de embryo's in 5 mL 1 x PBST tweemaal voor elke 5 min op RT.</li>
	<li>Permeabilize van de embryo's door ze aan het broeden in 5 mL van een oplossing van 1:1,000 proteïnase K (pK) (10 mg/mL) in 1 x PBST voor 2 min op RT. Opmerking: Oudere embryo's langer dan 2 min van de concentratie van de pK hierboven vermeld, maar een concentratie van 5 mg/mL en incubatie tijd minder dan 2 min voor embryo's jonger dan 24 wordt voorgesteld kunnen worden geïncubeerd hpf.</li>
	<li>Verwijder pK oplossing en wassen onmiddellijk in 5 mL 1 x PBST tweemaal op RT. Fix de embryo's in 5 mL 4% PFA op RT voor minstens 20 min. Opmerking: Embryo's kunnen oplossen in 4% PFA overnacht bij 4 ° C.</li>
	<li>Verwijder PFA en wassen tweemaal in 5 mL van de 1 x PBST op RT.</li>
	<li>Transfer van de embryo's in 5 mL 1 x PBST in platte bodem microcentrifuge buizen rechtop geplaatst in een microcentrifuge rack op RT om interacties tussen elk embryo en de daaropvolgende hybridisatie oplossing.</li>
	<li>De embryo's twee keer in 1,5 mL hybridisatie oplossing (Hyb +) op RT. Voeg 1,5 mL verse Hyb + wassen en embryo's bij 70 ° C in een kruising oven voor 4-6 h uit te broeden.</li>
	<li>De 1,5 mL Hyb + vervangen met een volume van sonde oplossing (10 µL RNA sonde/500 µL Hyb +) voldoende om de embryo's volledig te dekken. Opmerking: Synthetiseren antisense RNA sonde met eerder beschreven methoden39.</li>
	<li>De sonde 's nachts in de oven van de kruising bij 70 ° C met de afzonderlijke buizen geplaatst rechtop in de microcentrifuge rek, te vermengen zonder schudden.</li>
</ol>3. warme wast en blokkeren
Opmerking: Hot wast zijn uitgevoerd door de passende oplossing zetten de embryo's en vervolgens aan het broeden in de oven van de kruising bij 70 ° C. Plaatsen om te houden de wassen oplossingen bij 70 ° C, 50 mL buizen van elke oplossing in de kruising oven wanneer de sonde / Hyb + mengsel wordt toegevoegd.
<ol><li>Het verwijderen van de sonde. Het wassen van de embryo's tweemaal bij 70 ° C in 1,5 mL 50% formamide/2 x saline-Natriumcitraat (SSC) buffer voor elke 20-30 min. Opmerking: De sonde kan worden opgeslagen in Hyb + bij-20 ° C en opnieuw gebruikt op een later tijdstip.</li>
	<li>Wassen van de embryo's eens bij 70 ° C in 1,5 mL 2 x SSC voor 15 min. wassen de embryo's tweemaal bij 70 ° C in 1,5 mL 0,2 X SSC voor elke 20-30 min. Vervangen 0.2 x SSC met 1,5 mL blokkerende reagens en na een nacht bebroeden bij 4 ° C. Opmerking: Het is mogelijk om te broeden blokkerende reagens op RT voor 4 uur in plaats van de overnachting.</li>
</ol>4. antilichaam-incubatie en maleïnezuur Buffer wast
Opmerking: Houd embryo's beschermd tegen omgevingslicht.
<ol><li>Vervang de blokkerende reagens met 0,2 mL anti-DIG-POD in blokkerende reagens bij een verhouding van 1:1,000 en incubeer gedurende 3U onder aluminiumfolie of een andere licht-blokkerende dekking op RT. Opmerking: U kunt ook het antilichaam kan na een nacht bebroeden bij 4 ° C.</li>
	<li>Na 3U, door de embryo's te wassen in 1,5 mL maleïnezuur buffer 2 - 4 keer gedurende 10-15 minuten, elk op RT. Incubate de embryo's 's nachts bij 4 ° C in 1,5 mL verse maleïnezuur buffer. Opmerking: Het is niet nodig om na een nacht bebroeden in maleïnezuur buffer, maar doen dus vermindert sonde achtergrond.</li>
</ol>5. sonde detectie en verwijdering van Peroxidase
Opmerking: Houd embryo's beschermd tegen omgevingslicht.
<ol><li>Maleïnezuur buffer te verwijderen en te vervangen met 1,5 mL 1 x PBS. Wassen van embryo's twee keer in 1,5 mL 1 x PBS voor 5 minuten elk op RT. Incubate embryo's in 0,2 mL van Cy3 fluorescerende kleurstofoplossing gedurende 60 minuten op RT. Opmerking: Incubatietijd kan variëren voor verschillende sondes.</li>
	<li>Wassen van de embryo's keer met 1,5 mL van het volgende percentage MeOH in 1 X PBS voor 10 min op RT: 30% MeOH, 50% MeOH, 75% MeOH en 100% MeOH.</li>
	<li>Incubeer de embryo's met 1,5 mL voor 1% H2O2 in MeOH voor 30 min op RT. Wash de embryo's keer met 1,5 mL van de volgende oplossingen van de MeOH in 1 x PBS voor 10 min op RT: 75% MeOH 50% MeOH en 30% MeOH. Het wassen van de embryo's tweemaal voor elke 5 min op RT in 1,5 mL 1 x PBS. Opmerking: Embryo's kunnen worden opgeslagen in PBS's nachts bij 4° C.</li>
</ol>6. immunofluorescentie
Opmerking: Houd embryo's beschermd tegen omgevingslicht.
<ol><li>Wassen van de embryo's 1,5 mL van ddH2O voor 5 min op RT. Wash de embryo's in 1,5 mL pre gekoeld aceton (opgeslagen bij-20 ° C) 7 min op RT. de embryo's eenmaal in 1,5 mL ddH2O gedurende 5 minuten wassen op RT. Wash de embryo's eenmaal in 1.5 mL 1 x PBST met 1% DMSO (PBDT) voor 5 min op RT.</li>
	<li>Incubeer de embryo's in 1,5 mL PBDT + 10% foetale runderserum (FBS) op een rocker op RT gedurende 2 uur.</li>
	<li>PBDT + FBS verwijderen en te vervangen met 1,5 mL primaire antilichamen, anti-geacetyleerd tubuline (geproduceerd van muis) en anti-γ-tubuline (geproduceerd van konijn), samen op 1:400 PBDT + 1% verdund FBS. Incubeer de embryo's 's nachts bij 4 ° C. Opmerking: Incubatie tijden kunnen variëren afhankelijk van het primaire antilichaam. Testen van verschillende tijdsintervallen mogelijk moet optimaliseren labeling.</li>
</ol>7. secundair antilichaam
Opmerking: Houd embryo's beschermd tegen omgevingslicht.
<ol><li>Schakel overtollige unbound antilichaam van de embryo's, wassen in 1,5 mL PBDT + 1% FBS + 0,1 M NaCl voor 1 min op RT op een rocker.</li>
	<li>Wassen van de embryo's 5 keer in 1,5 mL van PBDT + 1% wassen FBS + 0,1 M NaCl gedurende 30 minuten op een rocker op RT. de embryo's in 1,5 mL PBDT + 1% FBS gedurende 30 minuten op RT op een rocker.</li>
	<li>Incubeer de embryo's 's nachts bij 4 ° C in 200 µL van de secundaire antilichamen, Alexa 488 geit anti-muis IgG en Alexa 647 geit anti-konijn IgG, verdund samen in PBDT op 1:500.</li>
</ol>8. DAPI kleuring
Opmerking: Houd embryo's beschermd tegen omgevingslicht.
<ol><li>Wassen de embryo's snel op RT in 1,5 mL PBDT twee keer. Vervang PBDT met 1,5 mL DAPI, 1:15000 in 1 X PBST wordt verdund en incubeer 15 min op RT op een rocker.</li>
	<li>Wassen van de embryo's in 1,5 mL PDBT + 1% FBS + 0,1 M NaCl drie keer op RT gedurende 15-20 minuten elk. Het bewaren van embryo's in 1,5 mL van PBDT bij 4 ° C tot klaar om te monteren en afbeelding.</li>
</ol>9. montage- en Imaging voor Zebrafish Pronephros
<ol><li>Lag embryo laterale op glasplaatje in een klein volume, ongeveer 10 µL, PBDT.</li>
	<li>Knijp het embryo achter de ogen met een paar fijne pincet voor het verwijderen van het hoofd en enkele van de dooier-bal.</li>
	<li>Gebruik de fijne pincet voorzichtig schrapen weg de resterende dooier bal uit het lichaam van het embryo. Verwijder de gedissocieerde dooier en extra vloeistof van de dia met een dun weefsel.</li>
	<li>Voeg een druppel montage media aan de resterende staart van het embryo en plaats zodat de staart zijwaarts wordt gelegd. Plaats een dekglaasje aan op de top van de staart aan het afvlakken van de steekproef, dan plaats in een overdekte glijbaan-vak.</li>
	<li>Beeld van nier cilia bij 60 X vergroting op een confocal microscoop met behulp van de volgende kanalen: DAPI in blauw (laser instellen op 408.0 nm), FITC in het groen (laser instellen op 488.0 nm), Cy3 kleurstof-geëtiketteerden in het rood (laser instellen op 561.0 nm), en Alexa 680 in wit (laser instellen op 637.0 nm).</li>
</ol>

<ol><li>Lieschke, G. J., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+human+disease%3A+zebrafish+swim+into+view%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Animal models of human disease: zebrafish swim into view.</a> Nat Rev Genet. 8, 353-367 (2007).</li>
<li>Goldsmith, J. R., Jobin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Think+small%3A+zebrafish+as+a+model+system+of+human+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Think small: zebrafish as a model system of human pathology.</a> J Biomed Biotechnol. 2012, 817341(2012).</li>
<li>Howe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+reference+genome+sequence+and+its+relationship+to+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome.</a> Nature. 496, 498-503 (2013).</li>
<li>Drummond, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kidney+development+and+disease+in+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Soc+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Kidney development and disease in the zebrafish.</a> J Am Soc Nephrol. 16, 299-304 (2005).</li>
<li>Wingert, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cdx+genes+and+retinoic+acid+control+the+positioning+and+segmentation+of+the+zebrafish+pronephros%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">The cdx genes and retinoic acid control the positioning and segmentation of the zebrafish pronephros.</a> PLoS Genet. 3, 1922-1938 (2007).</li>
<li>Wingert, R. A., Davidson, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+pronephros%3A+a+model+to+study+segmentation%5BTitle%5D)+AND+%22Kindey+Int%22%5BJournal%5D)">The zebrafish pronephros: a model to study segmentation.</a> Kindey Int. 73 (10), 1120-1127 (2008).</li>
<li>Wingert, R. A., Davidson, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+nephrogenesis+involves+dynamic+spatiotemporal+expression+changes+in+renal+progenitors+and+essential+signals+from+retinoic+acid+and+irx3b%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Zebrafish nephrogenesis involves dynamic spatiotemporal expression changes in renal progenitors and essential signals from retinoic acid and irx3b.</a> Dev Dyn. 240, 2011-2027 (2011).</li>
<li>Chambers, B. E., Wingert, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Renal+progenitors%3A+roles+in+kidney+disease+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22World+J+Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Renal progenitors: roles in kidney disease and regeneration.</a> World J Stem Cells. 8 (11), 367-375 (2016).</li>
<li>Drummond, B. E., Wingert, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+kidney+stem+cell+development+and+regeneration+using+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22World+J+Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Insights into kidney stem cell development and regeneration using zebrafish.</a> World J Stem Cells. 8 (2), 22-31 (2016).</li>
<li>Poureetezadi, S. J., Wingert, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Little+fish%2C+big+catch%3A+zebrafish+as+a+model+for+kidney+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+Int%22%5BJournal%5D)">Little fish, big catch: zebrafish as a model for kidney disease.</a> Kidney Int. 89 (6), 1204-1210 (2016).</li>
<li>Kramer-Zucker, A. G., Olale, F., Haycraft, C. J., Yoder, B. K., Schier, A. F., Drummond, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cilia-driven+fluid+flow+in+the+zebrafish+pronephros%2C+brain+and+Kupffer%27s+vesicle+is+required+for+normal+organogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Cilia-driven fluid flow in the zebrafish pronephros, brain and Kupffer's vesicle is required for normal organogenesis.</a> Development. 132, 1907-1921 (2005).</li>
<li>Liu, Y., Narendra, P., Kramer-Zucker, A., Drummond, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch+signaling+controls+the+differentiation+of+transporting+epithlelia+and+multiciliated+cells+in+the+zebrafish+pronephros%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Notch signaling controls the differentiation of transporting epithlelia and multiciliated cells in the zebrafish pronephros.</a> Development. 134, 1111-1122 (2007).</li>
<li>Ma, M., Jiang, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Jagged2a-Notch+signaling+mediates+cell+fate+choice+in+the+zebrafish+pronephric+duct%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Jagged2a-Notch signaling mediates cell fate choice in the zebrafish pronephric duct.</a> PLoS Genetics. 3, e18(2007).</li>
<li>Li, Y., Cheng, C. N., Verdun, V. A., Wingert, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+nephrogenesis+is+regulated+by+interactions+between+retinoic+acid%2C+mecom%2C+and+Notch+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Zebrafish nephrogenesis is regulated by interactions between retinoic acid, mecom, and Notch signaling.</a> Dev Biol. 386 (1), 111-122 (2014).</li>
<li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miR-34b+regulates+multiciliogenesis+during+organ+formation+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">miR-34b regulates multiciliogenesis during organ formation in zebrafish.</a> Development. 140, 2755-2764 (2013).</li>
<li>Marra, A. N., Wingert, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+cell+fate+in+the+nephron+tubule+is+mediated+by+the+ETS+transcription+factors+etv5a+and+etv4+during+zebrafish+development%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Epithelial cell fate in the nephron tubule is mediated by the ETS transcription factors etv5a and etv4 during zebrafish development.</a> Dev Biol. 411 (2), 231-245 (2016).</li>
<li>Marra, A. N., Li, Y., Wingert, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antennas+of+organ+morphogenesis%3A+the+roles+of+cilia+in+vertebrate+kidney+development%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Antennas of organ morphogenesis: the roles of cilia in vertebrate kidney development.</a> Genesis. 54 (9), 457-469 (2016).</li>
<li>Duffy, J. L., Suzuki, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ciliated+human+renal+proximal+tubular+cells.+Observations+in+three+cases+of+hypercalcemia%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Ciliated human renal proximal tubular cells. Observations in three cases of hypercalcemia.</a> Am J Pathol. 53, 609-616 (1968).</li>
<li>Katz, S. M., Morgan, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cilia+in+the+human+kidney%5BTitle%5D)+AND+%22Ultrastruct+Pathol%22%5BJournal%5D)">Cilia in the human kidney.</a> Ultrastruct Pathol. 6, 285-294 (1984).</li>
<li>Hassan, M. O., Subramanyan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ciliated+renal+tubular+cells+in+crescentic+glomerulonephritis%5BTitle%5D)+AND+%22Ultrastruct+Pathol%22%5BJournal%5D)">Ciliated renal tubular cells in crescentic glomerulonephritis.</a> Ultrastruct Pathol. 19, 201-203 (1995).</li>
<li>Ong, A. C., Wagner, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+proximal+tubular+motile+cilia+in+a+patient+with+renal+sarcoidosis+associated+with+hypercalcemia%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Kidney+Dis%22%5BJournal%5D)">Detection of proximal tubular motile cilia in a patient with renal sarcoidosis associated with hypercalcemia.</a> Am J Kidney Dis. 45, 1096-1099 (2005).</li>
<li>Worthington, W. C., Cathcart, R. S. III <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ependymal+cilia%3A+distribution+and+activity+in+the+adult+human+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Ependymal cilia: distribution and activity in the adult human brain.</a> Science. 139, 221-222 (1963).</li>
<li>Cowan, M. J., Galdwin, M. T., Shelhamer, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disorders+of+ciliary+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Med+Sci%22%5BJournal%5D)">Disorders of ciliary motility.</a> Am J Med Sci. 321, 3-10 (2001).</li>
<li>Jain, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+relationship+between+primary+and+motile+ciliogenesis+in+airway+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Cell+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Temporal relationship between primary and motile ciliogenesis in airway epithelial cells.</a> Am J Respir Cell Mol Biol. 43, 731-739 (2010).</li>
<li>Stubbs, J. L., Vladar, E. K., Axlerod, J. D., Kitner, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicilin+promotes+centriole+assembly+and+ciliogenesis+during+multiciliate+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Multicilin promotes centriole assembly and ciliogenesis during multiciliate cell differentiation.</a> Nat Cell Biol. 14, 140-147 (2012).</li>
<li>Tan, F. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myb+promotes+centriole+amplification+and+later+steps+of+the+multiciliogenesis+program%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Myb promotes centriole amplification and later steps of the multiciliogenesis program.</a> Development. 140, 4277-4286 (2013).</li>
<li>Zhou, F., Narasimhan, V., Shboul, M., Chong, Y. L., Reversade, B., Roy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gmnc+is+a+master+regulator+of+the+multiciliated+cell+differentiation+program%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Gmnc is a master regulator of the multiciliated cell differentiation program.</a> Curr Biol. 25, 3267-3273 (2015).</li>
<li>Jowett, T. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0091679X0861821X">Analysis of Protein and gene expression.</a> Methods Cell Biol. 59, 63-85 (1999).</li>
<li>Schulte-Merker, S. <a target="_blank" href="https://books.google.com/books?id=zS-5CKOjCIgC&pg=PA39&lpg=PA39&dq=Looking+at+Embryos+Schulte&source=bl&ots=mqm0o5OPaM&sig=usQ4HF0pGM7oova5E5Vwx0RBACw&hl=en&sa=X&ved=0ahUKEwji3oiZ7LjUAhXk8YMKHXJYDVkQ6AEIJjAA#v=onepage&q=Looking%20at%20Embryos%20Schulte&f=false">Chapter 2: Looking at Embryos.</a> Zebrafish: A practical approach. 261, 39-58 (2002).</li>
<li>Brend, T., Holley, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+whole+mount+high-resolution+double+fluorescent+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Zebrafish whole mount high-resolution double fluorescent in situ hybridization.</a> J Vis Exp. (25), (2009).</li>
<li>Lauter, G., Soll, I., Hauptmann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-color+fluorescent+in+situ+hybridization+in+the+embryonic+zebrafish+brain+using+differential+detection+systems%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Two-color fluorescent in situ hybridization in the embryonic zebrafish brain using differential detection systems.</a> BMC Dev Biol. 11, (2011).</li>
<li>Drummond, B. E., Li, Y., Marra, A. N., Cheng, C. N., Wingert, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tbx2a%2Fb+transcription+factors+direct+pronephros+segmentation+and+corpuscle+of+Stannius+formation+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">The tbx2a/b transcription factors direct pronephros segmentation and corpuscle of Stannius formation in zebrafish.</a> Dev Biol. 421 (1), 52-66 (2017).</li>
<li>Jaffe, K. M., Thiberge, S. Y., Bisher, M. E., Burdine, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+cilia+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Imaging cilia in zebrafish.</a> Methods Cell Biol. 97, 415-435 (2010).</li>
<li>Lauter, G., Soll, I., Hauptmann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicolor+fluorescent+in+situ+hybridization+to+define+abutting+and+overlapping+gene+expression+in+the+embryonic+zebrafish+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Dev%22%5BJournal%5D)">Multicolor fluorescent in situ hybridization to define abutting and overlapping gene expression in the embryonic zebrafish brain.</a> Neural Dev. 6, (2011).</li>
<li>Sorrells, S., Toruno, C., Stewart, R. A., Jette, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+apoptosis+in+zebrafish+embryos+by+whole-mount+immunofluorescence+to+detect+activated+caspase+3%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Analysis of apoptosis in zebrafish embryos by whole-mount immunofluorescence to detect activated caspase 3.</a> J Vis Exp. (82), e51060(2013).</li>
<li>Schumacher, J. A., Zhao, E. J., Kofron, M. J., Sumanas, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-color+fluorescent+in+situ+hybridization+using+chromogenic+substrates+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Bio+Techniques%22%5BJournal%5D)">Two-color fluorescent in situ hybridization using chromogenic substrates in zebrafish.</a> Bio Techniques. 57, 254-256 (2014).</li>
<li>Julich, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((beamter%2FdeltaC+and+the+role+of+Notch+ligands+in+the+zebrafish+somite+segmentation%2C+hindbrain+neurogenesis+and+hypochord+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">beamter/deltaC and the role of Notch ligands in the zebrafish somite segmentation, hindbrain neurogenesis and hypochord differentiation.</a> Dev Biol. 286, 391-404 (2005).</li>
<li>Gross-Thebing, T., Paksa, A., Raz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+high-resolution+detection+of+multiple+transcripts+combined+with+localization+of+proteins+in+whole-mount+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biology%22%5BJournal%5D)">Simultaneous high-resolution detection of multiple transcripts combined with localization of proteins in whole-mount embryos.</a> BMC Biology. 12, (2014).</li>
<li>Cheng, C. N., Li, Y., Marra, A. N., Verdun, V., Wingert, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flat+Mount+Preparation+for+Observation+and+Analysis+of+Zebrafish+Embryo+Specimens+Stained+by+Whole+Mount+In+situ+Hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Flat Mount Preparation for Observation and Analysis of Zebrafish Embryo Specimens Stained by Whole Mount In situ Hybridization.</a> J Vis Exp. (89), e51604(2014).</li>
<li>Poureetezadi, S. J., Donahue, E. K., Wingert, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Manual+Small+Molecule+Screen+Approaching+High-throughput+Using+Zebrafish+Embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A Manual Small Molecule Screen Approaching High-throughput Using Zebrafish Embryos.</a> J Vis Exp. (93), e52063(2014).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Het protocol hierboven is geoptimaliseerd voor het labelen van MCCs in de pronephros met odf3b transcripties en α-tubuline in 24 hpf zebrafish embryo's. Voor de beste resultaten, is het aanbevolen om het gebruik van vers vaste en bereid embryo's. Embryo's die zijn vastgesteld en in MeOH of Hyb + opgeslagen bij-20 ° C gedurende langer dan één week kunnen worden gebruikt, maar de kans op ongewenste achtergrond kleuring neemt toe met de tijd dat de embryo's worden bewaard in opslag.
Wijzigingen en het oplossen van deze techniek zijn noodzakelijk voor het afstemmen van deze methode voor andere suites van bepaald merkers, bijvoorbeeld andere antisense riboprobes en andere antistoffen. Veel methoden voor het aanpassen van de parameters van de stappen in het proces van hele berg in situ hybridisatie geweest eerder gedocumenteerd door onze fractie en anderen31,34,36,,38, 39. Ook elk eiwit antilichaam vergt een aantal controles op het gebied van de kleuring van tijden en geschatte reeksen van verdunningen en incubatie tijden voor elke primair antilichaam worden best geschat door evaluatie van gedocumenteerde resultaten28, 35. voor embryo's jonger dan 24 hpf, pK behandeling moet korter zijn dan 2 min, waar embryo's ouder dan 24 hpf pK langer dan 2 min moet worden behandeld. Ook embryo's ouder dan 24 hpf van pigment vóór de pK behandeling moet worden gebleekt.
Na kleuring met de fluorescerende kleurstofoplossing, is het van cruciaal belang voor het verwijderen van alle resterende vlek, antilichaam en Peroxidasen door het uitvoeren van de reeks van methanol en waterstofperoxide wast. De PBS wast onmiddellijk na zijn essentieel voor het verwijderen van overtollige methanol uit de embryo's. Nog belangrijker is, voordat u verdergaat met de IF-antistoffen, hebben we vonden de aceton en gedeïoniseerd water wast dat de embryo's minder kans zich te houden aan elkaar en/of de centrifuge buizen. In onze ervaring, antilichamen voor specifieke transcriptiefactoren en andere genen, hoewel zij efficiënt kunnen werken westelijke vlekken, werken niet goed voor als in de zebravis. Echter werken zeer geconserveerde en overvloedige eiwitten, zoals α-tubuline en β-catenine, goed in de zebravis voor als16,37.
Met vis is het mogelijk om te visualiseren van RNA transcripties van genen die nog geen specifieke antistoffen in de zebravis. Door het combineren van vissen met als, zoals blijkt uit dit protocol, kan co lokalisatie van afschriften van RNA en eiwit worden gezien in vivo (Figuur 2). De flexibele aard van het protocol kan snelle oplossing voor de visualisatie van verschillende afschriften van RNA en eiwitten in vele weefsels en tijd punten. Wanneer gecombineerd met de al gerespecteerde trekken van zebravis embryo's, biedt dit protocol van vis + als een ander hulpmiddel voor het verkennen van de expressie van genen en eiwitten belangrijk bij verordening van de ontwikkelingsdoelen traject.

In de afgelopen decennia, heeft de zebravissen (Danio rerio) ontpopt als een eersteklas modelorganisme te bestuderen van de ontwikkelingsbiologie. De embryo's ontwikkelen buiten de moeder en optisch transparant zijn. Ook de vorming van vitale organen zoals de ogen, nieren en reukkolf treedt snel op met structuren gevormd door gewoon 24u plaatsen bevruchting (hpf). De zebravis genoom is bovenal zeer geconserveerd met zoogdieren1,2,3. Daarnaast, hebben zebravis en zoogdieren organen soortgelijke anatomie en fysiologie. De zebravis embryonale nier-, of pronephros, toont de waarde van de modelsysteem voor de behandeling van de genfunctie tijdens de vroege nephrogenesis en bepaling van het lot van geconserveerde epitheliale cel populaties van de gewervelde Nefron4, 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10. ook geworden de zebravis embryo steeds belangrijker bij de behandeling van de ontogenie MCCs11,12,13,14,15, 16 , 17.
Zoals hun naam al doet vermoeden, zijn MCCs epitheliale cellen gekenmerkt door een bundel van motile cilia gelegen aan de apicale oppervlakte17. In de zebravis, MCCs functioneren in vloeistofstromen en zijn gedispergeerd in een "peper" zoals wijze over het gehele van het midden van elke Nefron van de pronephros door 24 hpf11,12,13,14, 15 , 16 , 17. Hoewel ze hebben slechts opgemerkt in een handvol van menselijke nier ziekte gevallen18,19,20,21, MCCs heersen in andere zoogdieren weefsels zoals de hersenen en luchtpijp22,23,24, die een groot aantal uitdagingen voor experimenteel design vormt. Elegante studies in verschillende gewervelde modellen, met inbegrip van de zebravis hebben aangetoond dat een geconserveerde traject van MCC lot, met de inkeping signalering traject als een inhibitor van de omwenteling van MCC ontwikkeling12,17,25 ,26,27. Dus, de zebravis pronephros biedt een gemakkelijk toegankelijk model voor het bestuderen van de genetische mechanismen van MCC ontwikkeling in vivo11,12,13,14, 15 , 16 , 17.
Zowel de transparantie en de gemakkelijke genetische manipulatie van zebravis embryo's hebben bewezen te zijn van onschatbare kenmerken bij de studie van de genetische en moleculaire trajecten die lot van de cel, weefsel groei en ontwikkeling van de vroege embryo1,2 regelen ,3. Als dergelijke, traditionele technieken te visualiseren van eiwitten en gene afschriften, zoals in situ hybridisatie en hele mount als, zijn toegepast op en geoptimaliseerd voor de zebravis16,28,29, 30,31,32,33,34,35,,36,,37,38. Door het combineren van populaire protocollen voor vis en als, is het mogelijk label te analyseren MCCs in vivo16,28,37,38.

<table><tbody><tr><td>non-specific protease mixture solution</td><td>Roche</td><td>11459643001, pronase from Streptomyces griseus</td><td>Verdunn in E3 zonder methyleenblauw om een stockoplossing van 50mg/mL te maken; bewaar bij -20&deg;C</td></tr><tr><td>E3 oplossing</td><td></td><td></td><td>Verdun 50X E3 (250 mM NaCl, 8,5 mM KCl, 16,5 mM CaCl2, 16,5 mM MgSO4 in gedistilleerd water) in gedistilleerd water; voeg 1 x 10-5 M methyleenblauw (sigma M9140) toe om besmetting te remmen</td></tr><tr><td>tricaine (ethyl 3-aminobenzoate methaansulfonaat)</td><td>Fluka</td><td>A5040-250G</td><td>Om een stockoplossing van 0,2% te maken, los 1 g tricainepoeder op in 10 mL Tris, pH 9,5 en gedistilleerd water tot 500 mL</td></tr><tr><td>embryo schotels</td><td>VWR</td><td>351029</td><td></td></tr><tr><td>5 mL glazen flacons</td><td>Wheaton</td><td>225012</td><td></td></tr><tr><td>wegwerpbare plastic Pasteur pipetten</td><td>VWR</td><td>414004-004</td><td></td></tr><tr><td>4% paraformaldehyde (PFA) oplossing</td><td>Electron Microscopy Services</td><td>19210</td><td>Los 4% PFA op in 1X PBS en breng onder een afzuigkap aan de kook. Koel en verdeel in porties, bewaar dan bij -20&deg;C. Niet opnieuw invriezen na ontdooien voor gebruik.</td></tr><tr><td>10X PBS</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB11072</td><td>Verdun in gedistilleerd water om een 1X stock te maken</td></tr><tr><td>Tween-20 stock</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB02038</td><td>Maak een 0,1% Tween-20 stock door te verdunnen in gedistilleerd water.</td></tr><tr><td>1X fosfaat gebufferde zoutoplossing met 0,1% Tween 20 (PBST)</td><td>Sigma</td><td>P9416</td><td>0,1% Tween-20 in 1X PBS</td></tr><tr><td>methanol (MeOH)</td><td>Sigma</td><td>34860-4L</td><td></td></tr><tr><td>proteinase K</td><td>Roche</td><td>3115879001</td><td>Los op in gedistilleerd water om een stock van 10 mg/mL te maken; verdeel in porties en bewaar bij -20&deg;C</td></tr><tr><td>microcentrifugebuisjes met platte bodem</td><td>VWR</td><td>87003-300; 87003-298</td><td></td></tr><tr><td>formamide</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB00600</td><td>bewaar bij -20&deg;C</td></tr><tr><td>hybridisatieoplossing (HYB+)</td><td></td><td></td><td>50% formamide, 5X SSC, 0,1% Tween-20, 5 mg/mL gist torula RNA, 50 &mu;g/&/;L heparine; bewaar bij -20&deg;C</td></tr><tr><td>hybridisatieoven</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-247-10Q</td><td></td></tr><tr><td>20X saline-sodiumcitraat (SSC) bufferoplossing</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB13156</td><td>verdun in gedistilleerd water om 2X en 0,2X stocks te maken</td></tr><tr><td>blokkerende reagentioplossing</td><td>Roche</td><td>11096176001</td><td>verdun in maleïnezuurbuffer om een stockoplossing van 10% te maken; bewaar bij 4&deg;C</td></tr><tr><td>maleïnezuurbufferoplossing</td><td>Sigma</td><td>M0375 en S7653</td><td>150mM maleïnezuur, 100mM NaCl (pH 7,5)</td></tr><tr><td>anti-Digoxigenin-POD, Fab-fragmenten</td><td>Roche</td><td>11207739910</td><td>bewaar bij 4&deg;C</td></tr><tr><td>Cy3 fluorescente kleuringsoplossing</td><td>PerkinElmer, Inc.</td><td>NEL744001KT, TSA Plus Cyanin3 systeem</td><td>bewaar bij 4&deg;C; bereid verse kleuringsoplossing door een 1:50 verdunning van TSA-reagens (opgelost in 60 uL DMSO) in de kitbuffer te maken</td></tr><tr><td>Waterstofperoxide (H2O2)</td><td>Sigma</td><td>H1009-500mL</td><td>bewaar bij 4&deg;C</td></tr><tr><td>moleculair gezuiverd gedistilleerd water (ddH2O)</td><td>Mediatech</td><td>25-055-CM</td><td></td></tr><tr><td>aceton</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB00636-01000</td><td>bewaar een portie bij -20&deg;C</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB00435-01000</td><td></td></tr><tr><td>foetaal bovien serum (FBS)</td><td>Gibco</td><td>10438-034</td><td>verdeel in porties en bewaar bij -20&deg;C</td></tr><tr><td>monoklonaal anti-acetyleerd tubuline klon 6-11B-1</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6793</td><td>verdeel in porties en bewaar bij -20&deg;C</td></tr><tr><td>anti-γ-tubuline antilichaam geproduceerd in konijn</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5192</td><td>verdeel in porties en bewaar bij -20&deg;C</td></tr><tr><td>odf3b cDNA klon MGC:63985</td><td>OpenBiosystems</td><td>IMAGE:6792478</td><td>bewaar bacteriële glycerolstock bij -80&deg;C</td></tr><tr><td>NaCL</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB01915-05000</td><td></td></tr><tr><td>Alexa flour 647 geit anti-konijn IgG</td><td>Life Technologies</td><td>A21245</td><td>bewaar bij 4&deg;C; bescherm tegen licht</td></tr><tr><td>Alexa fluor 488 geit anti-muis IgG</td><td>Life Technologies</td><td>A11029</td><td>bewaar bij 4&deg;C; bescherm tegen licht</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Life Technologies</td><td>D1306</td><td>verdeel in porties en bewaar bij -20&deg;C</td></tr><tr><td>glas plaatje</td><td>Thermo-Fisher</td><td>4445</td><td></td></tr><tr><td>glas dekglas</td><td>Thermo-Fisher</td><td>12-540A</td><td>18 x 18 mm</td></tr><tr><td>fijne pincetten</td><td>Roboz</td><td>RS-1050</td><td>Dumont Pincetjes Model #55</td></tr><tr><td>montage medium</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>18606, Aqua-Poly/Mount</td><td>bewaar bij 4&deg;C</td></tr><tr><td>confocale microscoop en bijbehorende software</td><td></td><td></td><td>We gebruiken een Nikon C2plus Confocale Microscoop met NIS-elements AR software</td></tr><tr><td>slinger</td><td>Bio-Rad</td><td>1660710EDU</td><td></td></tr></tbody></table>

visualiseren van multiciliated cellen in de zebravis via een gecombineerde protocol van hele mount fluorescentie in situ hybridisatie en immunofluorescentie

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

In de afgelopen jaren heeft de zebravis embryo ontpopt als een populair model te bestuderen van de ontwikkelingsbiologie als gevolg van eigenschappen zoals ex utero embryo-ontwikkeling en optische transparantie. In het bijzonder de zebravis embryo is uitgegroeid tot een belangrijke organisme te bestuderen gewervelde nier organogenese, alsmede multiciliated cel (MCC) ontwikkeling. Om te visualiseren MCCs in de embryonale zebrafish nier, wij hebben ontwikkeld, een gecombineerde protocol van geheel-mount fluorescente in situ -hybridisatie (FISH) en hele monteren immunofluorescentie (IF) waarmee de hoge resolutie beeldvorming. Dit manuscript beschrijft onze techniek voor samen het lokaliseren van afschriften van RNA en eiwitten als een instrument om de regulering van de ontwikkelings programma's via de uitdrukking van verschillende afkomst factoren beter te begrijpen.

Wild-type zebrafish embryo's werden vastgesteld op 24 hpf en onmiddellijk bereid zoals hierboven beschreven. Figuur 1 toont een experimentele workflow samen met geselecteerde geïllustreerde stadia. De workflow beschreven in stappen 1-8 omvat de processen van monster inkoop, fixatie en manipulatie van de vaste weefsel aan endogene afschriften van een label met antisense riboprobes gevolgd door immunofluorescentie naar label expressie gebrachte eiwitten van belang. Stap 9 in de werkstroom wordt verwezen naar de montage en beeldvormende technieken specifiek ontworpen voor het optimaliseren van de visualisatie van de zebravis embryonale kofferbak. In de tekeningen die gepaard gaan met stap 9, illustreren we de methode voor de manipulatie van de positionering van het weefsel op een glasplaatje. In deze stap worden de embryo's hoofd en dooier bal verwijderd, verlaten van de staart kunnen lateraal worden gepositioneerd tussen een glasplaatje en dekglaasje aan. Verwijdering van de dooier bal en het hoofd wordt voorgesteld voor de beste beeldvorming van de bevolking van de MCC in de pronephros, zoals de eidooier bal auto-licht en de montage proces belemmert.
Representatieve beelden verkregen met behulp van een confocal microscoop vindt u in Figuur 2, waaruit het dezelfde wild-type embryo bij 60 X vergroting en een digitale zoom op de dezelfde vergroting blijkt. De bovenste panelen bieden beelden van elk individueel kanaal, terwijl de onderste twee panelen de samengestelde overlay van deze beeldvorming gegevens zijn. Het witte vak (in de linker kolom afbeelding) schetst het gebied dat is de focus van de digitale zoom (de rechterkolom afbeelding). Gemarkeerd in het laatste deelvenster van de digitale zoom, kernen in de DAPI waren gelabeld en MCCs geconstateerd op basis van een antisense riboprobe ontworpen te herkennen odf3b, antilichamen tegen γ-tubuline duiden de basale organen waarbij α-tubuline duidt de cilia. In de digitale zoom van de samengestelde overlay, de gele onderbroken rondje geeft aan dat de omtrek van een MCC, die werd geïdentificeerd als gevolg van het bezit van odf3b afschriften, meerdere basale organen en cilia. De aangrenzende mono-ciliated cel, gemarkeerd met een gele gestippelde cirkel, werd geïdentificeerd op basis van het fenotype van het bezitten van een enkele basale lichaam en een enkele cilium.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56261/56261fig1.jpg"> Figuur 1: schematische van experimentele stroomdiagram. Dit stroomdiagram toont een experimentele workflow, gepaard met illustraties van kritieke fasen waarbij de sneeuwvlok koude incubatie aangeeft, de drie gebogen lijnen geven de warmte en de klok vertegenwoordigt lange incubatie tijden. De werkstroom kan worden uitgevoerd in een minimum van 6 dagen (Zie dagnummer in de hogere juiste hoek van elke stap in het proces), hoewel sommige stappen kunnen worden uitgevoerd over langere perioden, zoals vermeld in het protocol. Een gedetailleerde beschrijving van de montage proces is getrokken uit, tonen de laatste gemonteerde embryo staart tussen het glasplaatje en dekglaasje aan. Een zwarte onderbroken doos schetst het gebied dat is beeld bij 60 X vergroting. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56261/56261fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56261/56261fig2.jpg"> Figuur 2: vertegenwoordiger resultaten voor het visualiseren van MCCs van de zebravis pronephros. Maximale beeld projecties van een 24 hpf wild-type zebrafish embryo op 60 X vergroting evenals een digitale zoom op de confocal bij 60 X vergroting van de dezelfde embryo. De witte vakken geven aan het gebied gericht op voor de zoom. Individuele vlekken van de DAPI (kernen), odf3b (MCCs), γ-tubuline (basale instanties) en α-tubuline (cilia) zijn gemarkeerd en vervolgens samengevoegd in de onderste twee panelen. In de digitale zoom, wij bieden benaderingen van de cellocaties als volgt: een MCC is geschetst door de onderbroken gele cirkel, en de gele gestippelde cirkel schetst een mono-ciliated cel. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56261/56261fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>

Cilia ontwikkeling is essentieel voor goede organogenese. Dit protocol beschrijft een geoptimaliseerde methode om te etiketteren en ciliated cellen van de zebravis visualiseren.

Visualiseren van Multiciliated cellen in de zebravis via een gecombineerde Protocol van hele Mount fluorescentie In Situ hybridisatie en immunofluorescentie

In recent years, the zebrafish embryo has emerged as a popular model to study developmental biology due to traits such as ex utero embryo development and ...

Het algemene doel van dit protocol is om multiciliële cellen van de zebravis in situ te labelen en te visualiseren. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het veld van de ontwikkelingsbiologie, zoals welke factoren de multiciliële sulfaten in de embryonale nier van de zebravis reguleren? Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat zowel eiwitten als RNA-transcripten gelijktijdig gelabeld kunnen worden, wat nuttig is bij afwezigheid van zebravis-specifieke antilichamen.We kregen het idee voor deze methode toen we multiciliële cellen in de pronefros wilden labelen tijdens het analyseren van de aanwezigheid van cilia na het aanbrengen van wijzigingen in het embryo. Begin met het fixeren van de zebravissenembryo's op 24 uur na bevruchting in vijf milliliters 4%paraformaldehyde gedurende twee tot vier uur bij kamertemperatuur zonder agitatie. Was daarna de embryo's twee keer in PBS met 0,1%Tween 20 of PBST, gevolgd door één wasbeurt met vijf milliliters 100%methanol.Incubeer de embryo's vervolgens in vijf milliliter verse 100% ethanol gedurende ten minste 20 minuten bij min 20 graden Celsius. Om de embryo's voor te bereiden op hybridisatie, worden de neonaten gerehydrateerd in vijf milliliter 50% methanol en PBST gedurende vijf minuten, gevolgd door vijf minuten in vijf milliliter 30% methanol en PBST. Was de embryo's twee keer gedurende vijf minuten per keer in vijf milliliter PBST en incubeer de embryo's in vijf milliliter van een 1:1.000 proteïnase K- en PBST-oplossing gedurende twee minuten, direct gevolgd door nog twee wasbeurten in vijf milliliter PBST.Fixeer de embryo's in vijf milliliter 4% paraformaldehyde gedurende ten minste 20 minuten bij kamertemperatuur, gevolgd door twee wasbeurten in vijf milliliter PBST 20. Om de interacties tussen de embryo's en de hybridisatie-oplossing te vergemakkelijken, brengt u de embryo's over naar vijf milliliter PBST in rechtopstaande microcentrifugebuisjes met een vlakke bodem in een microcentrifuge-rek en wast u de embryo's twee keer gedurende vijf minuten per keer in 1,5 milliliter hybridisatie-oplossing. Na de tweede wasbeurt worden de embryo's vier tot zes uur geincubeerd in 1,5 milliliter verse hybridisatie-oplossing bij 70 °C in een hybridisatieoven.Vervang vervolgens de hybridisatie-oplossing door 10 µL van de gewenste RNA-sonde en 500 µL hybridisatie-oplossing voor een overnachtige sonde-hybridisatie bij 70 °C. Was de embryo's de volgende ochtend twee keer in 1,5 mL van 50% formamide en 2X saline-sodium citrate buffer (SSC) gedurende 20 tot 30 minuten per wasbeurt bij 70 °C. Was de embryo's daarna één keer in 1,5 mL own 2X SSC bij 70 °C gedurende 15 minuten, gevolgd door twee wasbeurten in 1,5 mL 0,2X SSC bij 70 °C gedurende 20 tot 30 minuten per wasbeurt.Vervang na de tweede wasbeurt de 0,2X SSC door 1,5 milliliters blokkeringsreagens voor een incubatie gedurende de nacht bij vier graden Celsius. Vervang de volgende ochtend het blokkeringsreagens door 0,2 milliliters anti-digoxine gekoppeld aan mierikswortelperoxidase en blokkeringsreagens in een verhouding van 1:1.000 voor een incubatie van drie uur bij kamertemperatuur, beschermd tegen licht. Was de embryo's vervolgens twee tot vier keer in 1,5 milliliters appelzuurbuffer gedurende 10 tot 15 minuten per wasbeurt, gevolgd door een incubatie gedurende de nacht bij vier graden Celsius in 1,5 milliliters verse appelzuurbuffer.Vervang de volgende ochtend de appelzuurbuffer door 1,5 milliliters PBS en was de embryo's twee keer in 1,5 milliliters PBS gedurende vijf minuten per wasbeurt. Incubeer de embryo's gedurende 60 minuten in 0,2 milliliters Si3 fluorescentie-oplossing, gevolgd door vier opeenvolgende wasbeurten van 10 minuten in 1,5 milliliters methanol met toenemende concentraties. Incubeer de embryo's na de laatste incubatie gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur in 1,5 milliliters 1% waterstofperoxide en methanol.Was daarna de embryo's gedurende 10 minuten per wasbeurt in aflopende methanoloplossingen van 1,5 milliliter, gevolgd door twee wasbeurten van vijf minuten in 1,5 milliliter PBS. Was de embryo's vervolgens gedurende vijf minuten in 1,5 milliliter dubbel gedestilleerd water, gevolgd door een wasbeurt van zeven minuten in 1,5 milliliter aceton van -20 °C. Was de embryo's opnieuw gedurende vijf minuten in 1,5 milliliter dubbel gedestilleerd water, gevolgd door een wasbeurt van vijf minuten in 1,5 milliliter PBST met 1% DMSO of PBDT.Incubeer de embryo's gedurende twee uur op een rocker bij kamertemperatuur in 1,5 milliliters PBDT met 10% FBS. Vervang vervolgens de PBDT en FBS door 1,5 milliliters van de primaire antilichamen voor een incubatie gedurende de nacht bij vier graden Celsius. Was de embryo's de volgende ochtend gedurende één minuut met rocken in 1,5 milliliters PBDT, FBS en 0,1 molar natriumchloride, gevolgd door vijf wasbeurten van 30 minuten met rocken in 1,5 milliliters PBDT, FBS en natriumchloride.Na de laatste wasbeurt worden de embryo's één keer gewassen in 1,5 milliliter PBDT en FBS gedurende 30 minuten onder schudden, gevolgd door een incubatie overnacht in 200 microliters van de geschikte secundaire antilichamen bij vier graden Celsius, beschermd tegen het licht. De volgende ochtend worden de embryo's snel twee keer gewassen in 1,5 milliliter PBDT, gevolgd door een incubatie van 15 minuten in 1,5 milliliter DAPI op een schudder. Was vervolgens de embryo's drie keer in 1,5 milliliter PBDT met FBS en natriumchloride gedurende 15 tot 20 minuten per wasbeurt en bewaar de embryo's in 1,5 milliliter PBDT bij vier graden Celsius, beschermd tegen omgevingslicht.Om de nieren van de zebravis te beelden, legt u de embryo's zijdelings op glazen objectglaasjes in ongeveer 10 µL PBDT. Verwijder met een fijne pincet en een dissectiemicroscoop de kop en een deel van de dooier door het eerste embryo vlak achter de ogen samen te knijpen. Schraap vervolgens voorzichtig de resterende dooier van het lichaam van het embryo weg.Wees bij het verwijderen van de dooierbol voorzichtig om de uitlopers van de dooierzak niet aan te raken, aangezien het weefsel van belang gemakkelijk scheurt en zich direct boven de uitlopers bevindt. Gebruik een dun stuk weefsel om de gedissocieerde dooier en overtollige vloeistof van de objectglas te verwijderen. Voeg vervolgens een druppel monteermiddel toe aan de overgebleven staart en positioneer de staart zijwaarts.Vlak de staart af met een dekglas en plaats depreparaat in een gesloten objectglaskasje. Gebruik vervolgens de 60X objectief van een confocale microscoop om de cilia van de nier te beelden op de juiste fluorescentiekanalen. In de volgende representatieve beelden van een zebravissembyrio, gekleurd zoals zojuist gedemonstreerd, kunnen multiciliaire cellen worden geïdentificeerd op basis van visualisatie van de antisense riboprobe die wordt gebruikt om de expressie van het ODF3B-transcript te herkennen, de met gamete tubuline gelabelde basale lichaampjes en de met geacetyleerde alpha tubuline gelabelde cilia.Inderdaad, bij deze vergroting van de embryonale pronefros kan een multicilieerde cel met ODF3B-transcripten, meerdere basale lichaampjes en cilia worden waargenomen. De aangrenzende monocilieerde cel kan worden onderscheiden aan zijn fenotype met een enkel basaal lichaampje en een enkele cilium. Tijdens deze procedure is het belangrijk om vers gefixeerde embryo's te gebruiken en de monsters te beschermen tegen omgevingslicht nadat het eerste antilichaam is toegevoegd.

visualizing-multiciliated-cells-zebrafish-through-combined-protocol

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

In deze video, demonstreren we een methode om de ontwikkeling van gewervelde hersenen te analyseren in levende zebravis embryo's bij enkele cel resolutie door confocale microscopie. Dit omvat de methode waarmee we injecteren van de single-cell zebravis embryo en vervolgens monteren en het imago van de zich ontwikkelende hersenen.

Live-Imaging van de zebravis embryonale Brain door confocale microscopie

Hele monteren in situ hybridisatie is een van de meest gebruikte technieken in de ontwikkelingsbiologie. Hier presenteren wij een hoge resolutie dubbele fluorescente in situ hybridisatie protocol voor de analyse van de precieze expressiepatroon van een enkel gen en voor het bepalen van de overlap van de expressie-domeinen van twee genen. We nemen een propidiumjodide nucleair anti-vlek weefsel organisatie te markeren.

Zebravis hele Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridisatie

Dit protocol beschrijft beeldvorming van individuele neuronen of neurale cellen in levende zebravis embryo's. Deze methode wordt gebruikt om cellulaire gedrag en actine lokalisatie met behulp van fluorescentie confocal time-lapse microscopie bestuderen.

Live-Imaging van celbeweeglijkheid en actine cytoskelet van individuele neuronen en neurale cellen in de zebravis embryo&#39;s

De sleutel tot het begrijpen van de morfogenetische processen die de vroege embryo vorm is de mogelijkheid om beeld-cellen met een hoge resolutie. We beschrijven hier een techniek voor het etiketteren van enkele cellen of kleine clusters van cellen in zijn geheel zebravis embryo's met membraan-gerichte Green Fluorescent Protein.

Etikettering en Imaging Cellen in de zebravis achterhersenen

Hier beschreven is een protocol voor de semi-geautomatiseerde beeldvorming van weefsel-specifieke fluorescentie in zebravis embryo's.

Semi-geautomatiseerde beeldvorming van Tissue-specifieke fluorescentie in zebravis embryo&#39;s

Het in beeld brengen van het dynamisch gedrag van organellen en andere subcellulaire structuren in vivo kan licht werpen op hun functie in fysiologische en ziektecondities. Hier presenteren we methoden voor het genetisch markeren van twee organellen, centrosomen en mitochondriën, en het in beeld brengen van hun dynamiek in levende zebravis-embryo's met behulp van breedveld- en confocale microscopie.

Beeldvorming Subcellulaire Structuren in het Living zebravis embryo

Technieken worden beschreven aan fosfo-epitopen geheel zebravis embryo immunostain en voert vervolgens twee kleuren fluorescerende confocale lokalisatie in cellulaire structuren zo klein als primaire cilia. De technieken voor de vaststelling en beeldvorming kan de locatie en de kinetiek van het uiterlijk of interactie met specifieke eiwitten te bepalen.

Immunokleuring Phospho-epitopen in gecilieerde Organen van Whole Mount zebravis embryo&#39;s

Dit protocol toont sequentiële immunofluorescentie en immunohistochemie op cryosecties van in het beginstadium zebravis-embryo's die precieze colokalisatie analyses in specifieke celpopulaties mogelijk maken.

Sequentiële immunofluorescentie en immunohistochemie op Gecryode zebravis-embryo's

Hier presenteren we een protocol voor fluorescerende antilichaamgemedieerde detectie van eiwitten in hele preparaten van zebravissen embryo's en larven.

Hele mount immunohistochemie in zebravissen embryo's en larven

Dit protocol beschrijft hoe beelden kunnen worden verkregen door in situ hybridisatie en immunohistochemie van embryonale secties van zebravissen te combineren. In situ hybridisatie werd uitgevoerd voorafgaand aan cryosectie, gevolgd door antilichaamkleuring. Het is nuttig om de expressiepatronen van twee genen in zebravissen te detecteren als er een tekort aan antilichamen is.

Ter plaatse Hybridisatie gecombineerd met immunohistochemie in cryosectie zebravisembryo's

Leer multiciliaire cellen visualiseren in de zebravis voor ontwikkelingsbiologie met een gecombineerde in situ-hybridisatie- en immunofluorescentieprotocol.

Visualiseren van Multiciliated cellen in de zebravis via een gecombineerde Protocol van hele Mount fluorescentie In Situ hybridisatie en immunofluorescentie (Video) | JoVE Journal

Visualiseren van Multiciliated cellen in de zebravis via een gecombineerde Protocol van hele Mount fluorescentie In Situ hybridisatie en immunofluorescentie

Meer video's verkennen