Visualiseren van Multiciliated cellen in de zebravis via een gecombineerde Protocol van hele Mount fluorescentie In Situ hybridisatie en immunofluorescentie
November 18th, 2017
Cilia ontwikkeling is essentieel voor goede organogenese. Dit protocol beschrijft een geoptimaliseerde methode om te etiketteren en ciliated cellen van de zebravis visualiseren.
Het algemene doel van dit protocol is om multiciliaire cellen van de zebravis in situ te labelen en visualiseren. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in de ontwikkelingsbiologie, zoals welke factoren multiciliaire sulfaten in de embryonale nier van de zebravis reguleren? Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat zowel eiwitten als RNA-transcripten gelijktijdig kunnen worden gelabeld, wat handig is in afwezigheid van zebravis-specifieke antilichamen.
We hadden eerst het idee voor deze methode toen we multiciliaire cellen in het pronefros gingen labelen terwijl we de aanwezigheid van cilia analyseerden na het aanbrengen van wijzigingen in het embryo. Begin door de zebravis-embryo's 24 uur na bevruchting in vijf milliliter 4% paraformaldehyde gedurende twee tot vier uur op kamertemperatuur te fixeren zonder agitatie. Was vervolgens de embryo's twee keer in PBS met 0,1% Tween 20 of PBST gevolgd door één wassing met vijf milliliter 100% methanol.
Incubeer vervolgens de embryo's in vijf milliliter verse 100% ethanol gedurende minimaal 20 minuten bij minuus 20 graden Celsius. Om de embryo's voor hybridisatie voor te bereiden, rehydrateer de neonaten in vijf milliliter 50% methanol en PBST gedurende vijf minuten gevolgd door vijf minuten in vijf milliliter 30% methanol en PBST. Was de embryo's twee keer gedurende vijf minuten elk in vijf milliliter PBST en incubeer de embryo's in vijf milliliter van een oplossing van 1 op 1000 proteinase K en PBST gedurende twee minuten, onmiddellijk gevolgd door twee extra wasbeurten in vijf milliliter PBST.
Fixeer de embryo's in vijf milliliter 4% paraformaldehyde gedurende ten minste 20 minuten op kamertemperatuur, gevolgd door twee wasbeurten in vijf milliliter PBST 20. Om interacties tussen de embryo's en de hybridisatieoplossing te vergemakkelijken, breng de embryo's over in vijf milliliter PBST in rechtopstaande vlakke bodem microcentrifugebuisjes in een microcentrifuge-rek en was de embryo's twee keer gedurende vijf minuten elk in 1,5 milliliter hybridisatieoplossing. Na de tweede wassing, incubeer de embryo's in 1,5 milliliter verse hybridisatieoplossing op 70 graden Celsius in een hybridisatieoven gedurende vier tot zes uur.
Vervolgens vervang de hybridisatieoplossing door 10 microliter RNA-sonde van belang en 500 microliter hybridisatieoplossing voor een overnachtsonde-hybridisatie bij 70 graden Celsius. De volgende ochtend, was de embryo's twee keer in 1,5 milliliter 50% formamide en 2X saline-natriumcitraatbuffer of SSC gedurende 20 tot 30 minuten per wassing bij 70 graden Celsius. Was vervolgens de embryo's één keer in 1,5 milliliter 2X SSC alleen bij 70 graden Celsius gedurende 15 minuten gevolgd door twee wasbeurten in 1,5 milliliter 0,2X SSC bij 70 graden Celsius gedurende 20 tot 30 minuten per wassing.
Na de tweede wassing, vervang de 0,2X SSC door 1,5 milliliter blokkeringsreagens voor een overnachtelijke incubatie bij vier graden Celsius. De volgende ochtend, vervang het blokkeringsreagens door 0,2 milliliter anti-digoxine in mierikswortelperoxidase en blokkeringsreagens in een verhouding van 1 op 1000 voor een drie uur durende incubatie op kamertemperatuur beschermd tegen licht. Was vervolgens de embryo's twee tot vier keer in 1,5 milliliter appelzuurbuffer gedurende 10 tot 15 minuten per wassing, gevolgd door een overnachtelijke incubatie bij vier graden Celsius in 1,5 milliliter verse appelzuurbuffer.
De volgende ochtend, vervang de appelzuurbuffer door 1,5 milliliter PBS en was de embryo's twee keer in 1,5 milliliter PBS gedurende vijf minuten per wassing. Incubeer de embryo's in 0,2 milliliter Si3 fluorescente staande oplossing gedurende 60 minuten, gevolgd door vier opeenvolgende wasbeurten van 10 minuten in 1,5 milliliter stijgende methanolconcentraties. Na de laatste incubatie, incubeer de embryo's op kamertemperatuur in 1,5 milliliter 1% waterstofperoxide en methanol gedurende 30 minuten.
Was vervolgens de embryo's gedurende 10 minuten per wassing in 1,5 milliliter dalende methanoloplossingen, gevolgd door twee wasbeurten van vijf minuten in 1,5 milliliter PBS. Was vervolgens de embryo's in 1,5 milliliter dubbel gedestilleerd water gedurende vijf minuten, gevolgd door een wasbeurt van zeven minuten in 1,5 milliliter minuus 20 graden Celsius aceton. Was de embryo's in nog eens 1,5 milliliter dubbel gedestilleerd water gedurende vijf minuten, gevolgd door een wasbeurt van vijf minuten in 1,5 milliliter PBST met 1% DMSO of PBDT.
Incubeer de embryo's op kamertemperatuur in 1,5 milliliter PBDT met 10% FBS op een rocker gedurende twee uur. Vervolgens, vervang de PBDT en FBS door 1,5 milliliter van de primaire antilichamen voor een overnachtelijke incubatie bij vier graden Celsius. De volgende ochtend, was de embryo's in 1,5 milliliter PBDT, FBS en 0,1 molair natriumchloride gedurende één minuut met schudden gevolgd door vijf 30 minuten durende schuddende wasbeurten in 1,5 milliliter PBDT, FBS en natriumchloride.
Na de laatste wassing, was de embryo's één keer in 1,5 milliliter PBDT en FBS gedurende 30 minuten met schudden gevolgd door een overnachtelijke incubatie in 200 microliter van de geschikte secundaire antilichamen bij vier graden Celsius beschermd tegen licht. De volgende ochtend, was de embryo's snel twee keer in 1,5 milliliter PBDT, gevolgd door een 15 minuten durende incubatie in 1,5 milliliter DAPI op een rocker. Was vervolgens de embryo's drie keer in 1,5 milliliter PBDT met FBS en natriumchloride gedurende 15 tot 20 minuten per wassing en bewaar de embryo's in 1,5 milliliter PBDT bij vier graden Celsius beschermd tegen omgevingslicht.
Om de nieren van de zebravis te beeldvormen, leg de embryo's lateraal op glazen platen in ongeveer 10 microliter PBDT. Gebruik een paar fijne pincetten en een dissectiemicroscoop om de eerste embryo achter de ogen te knijpen om het hoofd en een deel van de dooierbal te verwijder
Overzicht
Dit protocol beschrijft een methode voor het labelen en visualiseren van multiciliaire cellen in zebravis, wat cruciaal is voor het begrijpen van cilia-ontwikkeling en organogeneze.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Ontwikkelingsbiologie
- Celbiologie
- Neurowetenschappen
Achtergrond
- Cilia spelen een vitale rol in orgaanontwikkeling.
- Het begrijpen van multiciliaire cellen kan inzichten geven in de ontwikkeling van nieren bij zebravis.
- De methode maakt het mogelijk om eiwitten en RNA-transcripten gelijktijdig te labelen.
- Het lost de uitdaging op van het ontbreken van zebravis-specifieke antilichamen.
Doel van de studie
- Om multiciliaire cellen in de embryonale zebravis-nier te visualiseren.
- Om factoren te onderzoeken die multiciliaire sulfaten reguleren.
- Om het begrip van de rol van cilia in organogeneze te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Fixatie van zebravis-embryo's in paraformaldehyde.
- Hybridisatie met RNA-probes bij verhoogde temperaturen.
- Gelijktijdig labelen van eiwitten en RNA-transcripten.
- Beeldvorming van embryo's om de aanwezigheid en ontwikkeling van cilia te beoordelen.
Belangrijkste resultaten
- Succesvol labelen van multiciliaire cellen in situ.
- Het vermogen aangetoond om zowel RNA als eiwitten te visualiseren.
- Inzichten gegeven in de ontwikkelingsbiologie van zebravis-nieren.
- Een betrouwbare methode vastgesteld voor toekomstige studies over cilia.
Conclusies
- Het protocol is effectief voor het bestuderen van cilia in zebravis.
- Het opent mogelijkheden voor onderzoek naar ontwikkelingsbiologie en organogeneze.
- Gelijktijdig labelen verbetert het begrip van cellulaire mechanismen.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
This protocol enables simultaneous visualization of RNA transcripts and proteins in zebrafish embryos, addressing a key challenge in target validation where antibody availability is limited. By providing a method to co-localize gene expression and protein localization, it supports mechanistic de-risking in early discovery programs focused on cilia-related pathways and renal development. The approach enhances predictive confidence in phenotypic screening assays by allowing direct correlation of transcriptional regulation with functional ciliogenesis.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of transcriptional regulators of multiciliated cell development through direct RNA-protein co-localization.
- Operational Value: Provides a workaround for target validation in models lacking species-specific antibodies, expanding usable model systems.
- Predictive Value: Supports hypothesis testing of lineage factors in ciliopathies by linking gene expression to cellular phenotype.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized, reproducible whole-mount preparations suitable for high-resolution imaging-based screening.
- Quantitative Output: Enables measurement of transcript and protein co-expression patterns as a functional readout for compound effects on ciliogenesis.
- Scalability: Protocol uses common laboratory reagents and equipment, facilitating adaptation across screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Directly models vertebrate kidney organogenesis and ciliopathy mechanisms relevant to human renal disease.
- Translational Continuity: Bridges discovery-phase gene regulation findings with preclinical validation of cilia-dependent phenotypes.
- Mechanistic De-risking: Reduces ambiguity in target mechanism by confirming both transcriptional activation and protein localization in multiciliated cells.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the early discovery continuum, supporting target hypothesis validation prior to lead identification in cilia-focused programs. It enables mechanistic follow-up after phenotypic hits are identified in screening assays targeting ciliogenesis or kidney development pathways.
- Discovery Biology: Tests transcriptional regulation of ciliogenic programs by visualizing RNA transcripts alongside structural proteins like acetylated alpha-tubulin.
- Screening: Produces imaging-ready samples for automated or manual analysis of cilia number, length, and localization as phenotypic endpoints.
- Analytics: Generates co-localization data that can be quantified to assess concordance between gene expression and protein accumulation.
- Translational Research: Connects zebrafish pronephros findings to mammalian kidney ciliopathy models through conserved transcriptional regulators.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for studying any RNA-protein co-localization event in embryonic zebrafish tissues.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases target confidence by validating both transcriptional and translational levels of gene expression in native tissue context.
- Operational Value: Enhances reproducibility through standardized fixation, hybridization, and immunofluorescence steps compatible with multi-user core facilities.
- Strategic Value: Reduces reliance on antibody generation, lowering cost and timelines for target validation in non-traditional models.
- Portfolio Impact: Improves go/no-go decision quality by providing mechanistic evidence on target engagement in disease-relevant cell types.
Implementation Considerations
- Requires expertise in whole-mount in situ hybridization and immunofluorescence techniques.
- Dependent on access to hybridization ovens, confocal microscopes, and standard molecular biology reagents.
- Necessitates consistent embryo staging and fixation timing to ensure reproducible results across experiments.
- Requires optimization of blocking and wash conditions when adapting to different RNA probes or antibody pairs.
- Limited by tissue permeability in later developmental stages, restricting optimal use to embryonic stages up to 48 hpf.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:50
Embryo Fixation and Hybridization
3:05
Hot Washes, Blocking, Antibody Incubation, and Maleic Acid Buffer Washes
4:27
Probe Detection, Peroxidase Removal, and Immunofluorescence
7:19
Zebrafish Pronephros Mounting and Imaging
8:23
Results: Representative Zebrafish Pronephros and Multiciliated Cell (MCC) Imaging
9:09
Conclusion
