Esgotamento das populações de células específicas de Esgotamento Complemento

A depleção do complemento é um método rápido, eficaz e barato para purificar as populações de células imunológicas. A depleção do complemento começa quando anticorpos monoclonais IGM ou IgG são adicionados a uma população de células, que têm como alvo um tipo específico de célula. Neste exemplo, vamos direcionar as células T para depleção.

O sistema complemento é então adicionado, iniciando uma cascata proteolítica, que resulta na morte das células T. A população de células é então lavada e filtrada por centrifugação para eliminar células mortas e detritos. Este método de depleção do complemento normalmente resulta na eliminação de 95 a 100% da população de células alvo.

Olá, sou Bonnie Dittle. Sou investigador do Instituto de Pesquisa de Sangue do Hemocentro de Wisconsin, localizado em Milwaukee. Hoje vou mostrar a vocês a técnica depleção de complemento, um método rápido e barato para o esgotamento de populações celulares específicas.

Usamos essa técnica em meu laboratório para enriquecer altamente as populações de células imunológicas que usamos para vários bioensaios, incluindo aqueles que envolvem ativação celular e análise de expressão de proteínas. Então vamos começar. Antes de iniciar o experimento, prepare alíquotas de 0,5 ou um mililitro de complemento de coelho e armazene em um freezer de 20 ou 80 graus negativos.

Certifique-se de que titula o complemento para uma diluição óptima entre um a 10 e um a 20. Uma excelente fonte comercial de complemento que usamos rotineiramente é a Pereze biologicals para este procedimento, anticorpos monoclonais de camundongo e rap são geralmente eficazes na ativação do complemento, mas nem todos os anticorpos serão adequados. Os anticorpos IgM são geralmente os mais eficientes para a lise celular induzida pelo complemento.

Os anticorpos IgG são os segundos mais eficientes e são normalmente usados porque a maioria dos anticorpos monoclonais são titulados por IgG cada anticorpo para uso ideal em uma densidade celular de 10 elevado a sétimo células por mililitro, que é determinada empiricamente. A maioria dos anticorpos é usada na faixa de 0,1 a 10 microgramas por mililitro. Para a depleção de células T esplênicas, usamos um anticorpo monoclonal específico para TH.

Para iniciar a depleção do complemento, dilua as células em meio de cultura de células contendo 5% de soro fetal de bezerro inativado por calor, de modo que a população de células iniciais seja duas vezes 10 elevado a sétima células por mililitro. Por exemplo, cinco vezes 10 elevado à sétima células devem ser diluídas em 2,5 mililitros de meio. Esse volume de células é metade do volume final e, portanto, o dobro da concentração de células usada durante a depleção, que será de uma vez 10 elevado a sete células por mililitro.

Neste momento, salve até uma vez 10 para as seis células para que a depleção possa ser quantificada no final do experimento. Além disso, descongele a quantidade necessária de complemento à temperatura ambiente. Descobrimos que uma diluição de um a 15 é apropriada ao usar o complemento de coelho pereze biologicals por cinco vezes 10 a sete células, 1,5 mililitro de Eloqua congelado é suficiente.

Agora adicione a quantidade apropriada de anticorpo à suspensão celular e misture. Para esterilizar o complemento, use um filtro de ponta de seringa de baixa ligação às proteínas. Encha a seringa com um a dois mililitros de meio.

Antes de adicionar o complemento por cinco vezes 10 às sete células, precisaremos de 340 mililitros de complemento para uma diluição de um a 15. Em seguida, filtre o complemento diretamente no tubo que contém as células e o anticorpo. Agora ajuste o volume final no tubo para que as células estejam em uma concentração de uma vez 10 elevado à sétima célula por mililitro.

Em seguida, deixe as células incubarem a 37 graus Celsius em banho-maria por uma hora. Lembre-se de misturar as células a cada 15 minutos por inversão suave. Após a incubação, centrifugue as células a uma velocidade que não afete a viabilidade.

Então, de volta ao capô, descarte o sobrenadante. Em seguida, lave as células duas vezes com 10 mililitros de meio. Observe como os detritos celulares se acumulam com alguns grudados nas laterais dos tubos de poliestireno.

Após a última lavagem, filtre as células através de um dreno de células de nylon estéril de 70 mícrons. Por fim, verifique a pureza da célula. Comparando a população de células de interesse antes e depois do fluxo de depleção.

A citometria e a imuno-histoquímica são os métodos preferidos usados para determinar a pureza celular antes da experimentação. Ao usar um anticorpo monoclonal altamente eficiente na ativação do complemento, a primeira rodada de depleção do complemento esgotará as células em mais de 95% Como exemplo, usando citometria de fluxo para medir a porcentagem de células T alfa beta em uma preparação de células ple cyte de camundongo, descobrimos que elas continham 32,2% de células T alfa beta após a depleção do complemento com anti cinco um, que é expresso por todas as células T, mas não por outros leucócitos. A população beta do TCR foi reduzida em 95% para uma concentração final de 1,56% enviado.

Acabei de mostrar a você um método rápido e eficaz de esgotar populações de células específicas usando anticorpos específicos de antígenos na depleção do complemento. Ao fazer este procedimento, lembre-se de testar a eficácia de cada anticorpo e de titular seu complemento em um experimento piloto antes de começar. É isso.

Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.