Métodos para a detecção quantitativa de anticorpos induzida pela ativação do complemento no Glóbulos Vermelhos

O objetivo geral do experimento a seguir é avaliar a ativação do complemento por anticorpos contra glóbulos vermelhos ou hemácias no soro do paciente. Isso é obtido incubando glóbulos vermelhos com soro do paciente na presença de anticorpo anti C cinco bloqueador para induzir a deposição de C quatro e C3 na superfície das hemácias. Em seguida, as hemácias são coradas com anticorpos anti C quatro e anti C3 marcados com fluorescência, e a quantidade de deposição de complemento nas hemácias pode então ser analisada por citometria de fluxo em um método alternativo.

As hemácias são incubadas com soro do paciente na ausência de anti C cinco para induzir a lise mediada pelo complemento. A porcentagem de hemácias lisadas pode então ser determinada medindo a quantidade de hemoglobina liberada pelas células por espectrometria. A principal vantagem dessa nova técnica sobre os métodos existentes, como a hemólise ou o teste de antiglobulina usados em diagnósticos de rotina, é que ela é de natureza quantitativa e podemos detectar diferenças abaixo do ideal na ativação do complemento.

O pós-doutorado de Elizabeth Brook em nosso laboratório demonstrará procedimentos Comece lavando glóbulos vermelhos zero tipados três vezes com PBS, depois incube o pellet em solução de pista Roma a 0,5% na proporção de um para dois por 10 minutos a 37 graus Celsius após lavar as células mais três vezes, armazene-as como uma solução a 3% em PBS fresco a quatro graus Celsius para analisar a deposição de complemento nas hemácias por citometria de fluxo. Primeiro, aqueça inativar a quantidade desejada de soro do paciente por 30 minutos a 56 graus Celsius enquanto o soro está sendo tratado termicamente. Lave os glóbulos vermelhos tratados com brola três vezes em tampão Roal após a lavagem final.

Resus suspenda o pellet em vbg plus plus a uma diluição de 0,5%. Em seguida, em uma pérola de vidro, 25 microlitros de 0,5% de hemácias, 37,5 microlitros de soro AB fresco e 37,5 microlitros de 200 microgramas por mililitro, anti C cinco para cada poço de uma placa inferior redonda de 96 poços. Em seguida, adicione o soro do paciente inativado pelo calor a cada poço na concentração apropriada, complementando com soro AB inativado pelo calor conforme necessário e incluindo também um controle negativo.

Use VBG plus plus para levar cada poço a um volume final de 150 microlitros e, em seguida, incube a placa coberta com folha E IA por uma hora e meia a duas horas a 37 graus Celsius com agitação após a incubação. Lave as células três vezes com PBS suplementado com 0,5% BSA e, em seguida, marque as células com um micrograma por mililitro. Um anti C3 e anti C quatro anticorpos monoclonais marcados com fluorescência incubam as células por 30 a 45 minutos à temperatura ambiente com agitação suave e, depois de lavar a placa três vezes, ressuspendem as hemácias em 150 microlitros de PBS mais 0,5% BSA por.

Transfira as suspensões de células para uma nova placa inferior redonda de 96 poços e, em seguida, carregue a placa no citômetro de fluxo, separe as células individuais dos dupletos usando um gráfico de dispersão direta. Defina a porta nas hemácias individuais e selecione o canal de detecção apropriado para os sinais fluorescentes. Quantifique os resultados usando a intensidade média de fluorescência para análise hemolítica quantitativa, aqueça e ative o soro do paciente e lave as hemácias tratadas com alface romana conforme demonstrado.

Então, depois de incubar as hemácias com complemento e soro do paciente, como acabamos de demonstrar, mas sem o anti C cinco, gire as células por cinco minutos a 664 GS com desaceleração reduzida. Em seguida, transfira cuidadosamente 90 microlitros de sobrenadante para uma nova placa de microtitulação, tomando cuidado para não transferir as células intactas e evitar a criação de bolhas de ar e, em seguida, meça a absorção em quatro 14 a seis 90 em um espectrofotômetro expresso. A hemólise como porcentagem da lise de uma amostra de hemácias incubadas em água pura.

Nesta primeira figura, gráficos de dispersão representativos para hemácias tratadas com brola são mostrados gating adequado para hemácias únicas podem ser vistos aqui. Normalmente, cerca de 95% das hemácias se enquadram nesse único portão celular. Nestes histogramas resultados representativos para o efeito da anemia hemolítica autoimune ou aha.

O soro do paciente na deposição de C quatro e C3 é mostrado conforme o esperado, mais soro do paciente leva a mais deposição de complemento. Curiosamente, a deposição de complemento ocorre em dois picos positivos distintos. Isso provavelmente não é causado pela heterogeneidade na população de hemácias, uma vez que as hemácias são retiradas de um único doador, embora a causa desse fenômeno ainda esteja sendo investigada, as intensidades médias de fluorescência das amostras são plotadas nesses gráficos de linhas para mostrar a reprodutibilidade dos ensaios de deposição de C quatro e C3.

Observe a grande variação na deposição das várias amostras de pacientes com AH H. Finalmente, dados de um ensaio hemolítico de uma amostra de soro de paciente ahha contendo autoanticorpos para hemácias podem ser observados nesses gráficos. A titulação com a amostra de soro produz uma curva clara e reprodutível com um inibidor de complemento adequado, como anti C cinco.

O sinal hemolítico pode ser titulado conforme demonstrado neste gráfico. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como medir a ativação do complemento por anticorpos específicos de glóbulos vermelhos, seja por análise citométrica de fluxo de deposição de C3 ou C quatro ou por ensaio hemolítico quantitativo.