Métodos para a detecção quantitativa de anticorpos induzida pela ativação do complemento no Glóbulos Vermelhos
29 de janeiro de 2014
Aqui nós descrevemos dois ensaios para medir a ativação do complemento induzida por anticorpos contra células vermelhas do sangue. A vantagem principal sobre os ensaios actuais é a sua natureza quantitativa e fácil de interpretar.
O objetivo geral do experimento a seguir é avaliar a ativação do complemento por anticorpos contra hemácias ou glóbulos vermelhos (RBCs) no soro de pacientes. Isso é realizado incubando hemácias com soro de pacientes na presença de anticorpo bloqueador anti-C5 para induzir a deposição de C4 e C3 na superfície das hemácias. Em seguida, as hemácias são coradas com anticorpos anti-C4 e anti-C3 marcados com fluoróforo, e a quantidade de deposição de complemento nas hemácias pode então ser analisada por citometria de fluxo em um método alternativo.
Os eritrócitos são incubados com soro do paciente na ausência de anti C5 para induzir lise mediada pelo complemento. A porcentagem de eritrócitos lisados pode então ser determinada pela medição da quantidade de hemoglobina liberada pelas células por espectrometria. A principal vantagem dessa nova técnica em relação aos métodos existentes, como o teste de hemólise ou o teste da antiglobulina utilizado em diagnósticos de rotina, é que ela é de natureza quantitativa e permite detectar diferenças subótimas na ativação do complemento.
Elizabeth Brook, pós-doutoranda em nosso laboratório, demonstrará os procedimentos. Comece lavando os eritrócitos do tipo zero três vezes com PBS, depois incube o pellet em solução de Roma lane 0,5% na proporção de um para dois, durante 10 minutos a 37 graus Celsius. Após lavar as células mais três vezes, armazene-as como uma solução a 3% em PBS fresco a quatro graus Celsius. Para analisar a deposição de complemento nos eritrócitos por citometria de fluxo, primeiramente inative em banho-maria o volume desejado de soro do paciente por 30 minutos a 56 graus Celsius enquanto o soro está sendo tratado pelo calor. Lave os eritrócitos tratados com brola três vezes em tampão Roal após a lavagem final.
Resuspenda o pellet em vbg plus plus em uma diluição de 0,5%. Em seguida, em cada poço de uma placa de fundo redondo de 96 poços, adicione 25 microlitros de hemácias a 0,5%, 37,5 microlitros de soro AB fresco e 37,5 microlitros de 200 microgramas por mililitro de anti-C cinco. Em seguida, adicione o soro do paciente inativado pelo calor a cada poço na concentração apropriada, complementando com soro AB inativado pelo calor conforme necessário, e incluindo também um controle negativo.
Utilize VBG mais mais para ajustar cada poço a um volume final de 150 microlitros e, em seguida, incubar a placa coberta com filme de alumínio E IA por uma hora e meia a duas horas a 37 graus Celsius com agitação. Após a incubação, lave as células três vezes com PBS suplementado com 0,5% de BSA e, em seguida, marque as células com um micrograma por mililitro de anticorpos monoclonais anti-C3 e anti-C4 marcados com fluoróforo. Incube as células por 30 a 45 minutos à temperatura ambiente com agitação suave e, após lavar a placa três vezes, reconstitua os eritrócitos em 150 microlitros de PBS com 0,5% de BSA por poço.
Transferiremos as suspensões celulares para uma nova placa de fundo redondo de 96 poços e, em seguida, carregaremos a placa no citômetro de fluxo, separando as células individuais dos dupletos utilizando um gráfico de dispersão para a frente. Definiremos o gate nas hemácias individuais e, então, selecionaremos o canal de detecção apropriado para os sinais fluorescentes. Quantificaremos os resultados utilizando a intensidade mediana de fluorescência para análise hemolítica quantitativa, aquecendo e ativando o soro do paciente e lavando as hemácias tratadas com romana conforme demonstrado anteriormente.
Em seguida, após incubar os eritrócitos com complemento e soro do paciente conforme acabou de ser demonstrado, mas sem o anti C5, centrifugar as células por cinco minutos a 664 ×g com desaceleração reduzida. A seguir, transferir cuidadosamente 90 microlitros do sobrenadante para uma nova placa de microtitulação, tomando cuidado para não transferir as células intactas e para evitar a formação de bolhas de ar, e então medir a absorção entre 414 e 690 nm em um espectrofotômetro Express. A hemólise é expressa como porcentagem da lise de uma amostra de eritrócitos incubada em água pura.
Nesta primeira figura, são apresentados gráficos de dispersão representativos para hemácias tratadas com brola, nos quais pode ser observada uma seleção adequada para hemácias individuais. Normalmente, cerca de 95% das hemácias se enquadram nesta janela de célula única. Nestes histogramas, são mostrados resultados representativos para o efeito da anemia hemolítica autoimune ou AHA.
O soro do paciente sobre a deposição de C4 e C3 é mostrado conforme esperado: maior quantidade de soro do paciente leva a maior deposição do complemento. Curiosamente, a deposição do complemento ocorre em dois picos positivos distintos. Isso provavelmente não é causado por heterogeneidade na população de hemácias, já que as hemácias são obtidas de um único doador; embora a causa desse fenômeno ainda esteja sendo investigada, as intensidades de fluorescência mediana das amostras são representadas nesses gráficos lineares para demonstrar a reprodutibilidade dos ensaios de deposição de C4 e C3.
Observe a grande variação no depósito das diversas amostras de pacientes com AH H. Por fim, os dados de um ensaio hemolítico de uma amostra de soro de paciente ahha contendo autoanticorpos contra hemácias podem ser observados nestes gráficos. A titulação com a amostra de soro fornece uma curva clara e reprodutível com um inibidor de complemento adequado, como anti C cinco.
O sinal hemolítico pode ser titulado, conforme demonstrado neste gráfico. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como medir a ativação do complemento por anticorpos específicos para hemácias, seja por meio de análise citométrica de fluxo do depósito de C3 ou C4, ou por ensaio hemolítico quantitativo.
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Visão Geral
Este artigo descreve dois ensaios para medir a ativação do complemento induzida por anticorpos contra hemácias (RBCs). Os ensaios são quantitativos e fáceis de interpretar, oferecendo vantagens em relação aos métodos existentes.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Imunologia
- Hematologia
- Citometria de Fluxo
Contexto
- A ativação do complemento é crucial nas respostas imunes.
- Anticorpos contra hemácias podem levar a diversas condições clínicas.
- Ensaios atuais podem apresentar falta de precisão quantitativa.
- Novos métodos visam aprimorar a detecção da ativação do complemento.
Objetivo do Estudo
- Avaliar a ativação do complemento por anticorpos contra hemácias.
- Desenvolver um ensaio quantitativo para melhor interpretação dos resultados.
- Comparar novas técnicas com métodos diagnósticos existentes.
Métodos Utilizados
- Incubação de hemácias com soro de paciente e anticorpos bloqueadores.
- Marcação de hemácias com anticorpos marcados fluorescentemente.
- Análise do depósito de complemento por citometria de fluxo.
- Medição da liberação de hemoglobina para determinar a lise de hemácias.
Resultados Principais
- Os novos ensaios fornecem dados quantitativos sobre a ativação do complemento.
- Diferenças subótimas na ativação podem ser detectadas.
- Os resultados mostram sensibilidade aprimorada em comparação com métodos tradicionais.
- A análise por citometria de fluxo permite uma interpretação detalhada.
Conclusões
- Os novos ensaios aprimoram a compreensão da ativação do complemento.
- Eles oferecem uma alternativa confiável aos testes diagnósticos existentes.
- Aplicações futuras podem melhorar o diagnóstico e o tratamento dos pacientes.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A avaliação quantitativa da ativação do complemento induzida por anticorpos em hemácias é fundamental para avaliar a eficácia de inibidores do complemento e compreender os mecanismos hemolíticos em distúrbios autoimunes e aloimunes. Os ensaios descritos de citometria de fluxo e espectrofotometria fornecem leituras quantitativas e reprodutíveis que permitem detectar diferenças subótimas na ativação do complemento, apoiando a redução de riscos mecanicistas no desenvolvimento terapêutico. Esses métodos aumentam a confiança preditiva na validação de alvos ao transformar observações qualitativas em biomarcadores mensuráveis e transponíveis para tomadas de decisão pré-clínicas e clínicas.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas mediante a quantificação do depósito de complemento (C3/C4) induzido por autoanticorpos ou aloanticorpos em hemácias.
- Valor Operacional: Oferece validação funcional do alvo por meio da medição direta da atividade efetora mediada por anticorpos, reduzindo a ambiguidade mecanicista na seleção de alvos.
- Valor Preditivo: Apoia a triagem de portfólios ao gerar dados quantitativos sobre a potência da ativação do complemento, orientando decisões de avançar ou não avançar no desenvolvimento de terapêuticas moduladoras do complemento.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Prontidão do ensaio: Gera saídas padronizadas e quantitativas (intensidade de fluorescência mediana, liberação de hemoglobina) adequadas para triagem em alta produtividade de inibidores do complemento ou anticorpos terapêuticos.
- Reprodutibilidade: Demonstra baixa variabilidade entre amostras de soro de pacientes, permitindo avaliação confiável de compostos e padronização entre laboratórios.
- Utilidade da plataforma: Utiliza instrumentação acessível (citômetro de fluxo, espectrofotômetro) para criar ensaios reutilizáveis destinados à medição de bioatividade dependente do complemento em etapas de descoberta.
Pesquisa Translacional e Pré-Clinica
- Relevância para Doenças: Modela mecanismos fisiopatológicos na anemia hemolítica autoimune (AHAI) e na hemólise aloimune, associando o engajamento do alvo à ativação funcional do complemento.
- Continuidade Translacional: Conecta a descoberta científica à validação pré-clínica ao fornecer biomarcadores quantitativos (depósito de C3/C4, hemólise) que se correlacionam com o potencial hemolítico clínico.
- Avanço Ajustado ao Risco: Permite a redução de riscos mecanicistas ao quantificar a lise mediada pelo complemento, fornecendo subsídios para avaliações de segurança e modelagem dose-resposta em estudos pré-clínicos.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Os ensaios integram-se ao continuum de descoberta, desde a validação do alvo até a identificação de compostos líderes e a avaliação pré-clínica de segurança, oferecendo leituras quantitativas da ativação do complemento que orientam a desmistificação biológica e a avaliação do índice terapêutico.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses mediante a quantificação de vias de ativação do complemento induzidas por anticorpos, esclarecendo o mecanismo de ação de candidatos imunomoduladores.
- Triagem: Fornece saídas quantitativas prontas para ensaio (intensidade de fluorescência, hemólise espectrofotométrica) que permitem comparação confiável de compostos em teste ou amostras de soro.
- Análises: Gera leituras mensuráveis (intensidade mediana de fluorescência, liberação de hemoglobina) que facilitam a análise estatística e a comparação entre condições em estudos de resposta à dose.
- Pesquisa Translacional: Conecta-se à continuidade pré-clínica por meio de saídas relevantes para a doença que refletem a ativação do complemento observada em casos de AHAI e em situações de transfusão.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma padronizada e escalável para avaliação da atividade dependente do complemento em terapêuticos com anticorpos, biossimilares e inibidores do complemento.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva na validação de alvos ao converter ensaios qualitativos do complemento em medições quantitativas e transponíveis.
- Valor Operacional: Melhora a reprodutibilidade e padronização por meio de protocolos definidos para o preparo de hemácias, incubação com soro e detecção por citometria de fluxo ou espectrometria.
- Valor Estratégico: Melhora a eficiência do capital ao permitir a detecção precoce de riscos de ativação do complemento, reduzindo o risco de falhas em estágios avançados de programas imunomoduladores.
- Impacto sobre o Portfólio: Orienta a priorização ajustada ao risco ao quantificar o potencial de ativação do complemento, apoiando decisões objetivas de avanço no desenvolvimento terapêutico.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em imunologia, citometria de fluxo e manipulação de ensaios espectrofotométricos para medições precisas de deposição de complemento e hemólise.
- Depende do acesso a citômetros de fluxo com canais de fluorescência apropriados e espectrofotômetros para quantificação de hemoglobina em 414/690 nm.
- Necessita padronização da preparação de hemácias (por exemplo, tipo zero, tratadas com bromelina) e inativação térmica do soro para garantir consistência do ensaio entre diferentes usuários e locais.
- Requer considerações de adaptação ao ser aplicado a diferentes espécies de hemácias, densidades de antígenos ou fontes de complemento além do soro AB humano.
- Limitações práticas incluem a necessidade de transferência cuidadosa do sobrenadante para evitar arraste celular e bolhas de ar, o que poderia afetar a precisão da quantificação da hemólise.
