Bereiding van metabolieten uit een koraalholobiet, gescheiden koraalgastheerweefsel en symbiodinaiaceae-cellen voor gaschromatografie-massaspectrometrie-analyse

Om intracellulaire metabolieten uit gevriesdroogde holobiont te extraheren, voegt u 400 microliter 100% koude methanol met interne standaarden toe aan de gevriesdroogde holobiont. Voeg vervolgens 10 milligram zuurgewassen glasparels toe en plaats de tube in een voorgekoelde kralenmolen. Inbrengen op 50 hertz gedurende drie minuten.

Voeg na lysis 600 microliter koude methanol toe en vortex gedurende één minuut. Plaats de buis gedurende 30 minuten op een rotisserie-shaker bij vier graden Celsius. Om metabolieten te extraheren uit gescheiden gevriesdroogde symbiodiniacae-cellen, voegt u 200 microliter koude methanol met interne standaarden toe aan de gedroogde symbiodiniacae-cellen.

Voeg vervolgens zuurgewassen glaskralen toe en plaats de buis in een voorgekoelde kralenmolen op 50 hertz. Voeg na drie minuten 800 microliter methanol toe en vortex gedurende 30 seconden. Voor metabolietextractie uit gescheiden gevriesdroogd gastheerweefsel, voeg een milliliter koude methanol met interne standaarden toe aan het gedroogde gastheermateriaal en draai gedurende 20 seconden.

Plaats de buis vervolgens gedurende 30 minuten in een drijvende buishouder voor sonicatie bij vier graden Celsius. Centrifugeer vervolgens voor de zuivering van het metabolietextract alle monsters op 3000 G gedurende 30 minuten bij vier graden Celsius. Breng het supernatans voorzichtig over in een nieuwe microcentrifugebuis van twee milliliter zonder de pellet te verstoren.

Resuspendeer de pellet in een milliliter 50% koude methanol en draai krachtig gedurende één minuut. Centrifugeer opnieuw, verzamel en bundel de polaire extracten supernatans met de semi-polaire extracten van hetzelfde monster. Centrifugeer de gepoolde extracten op 16, 100G gedurende 15 minuten om neerslag te verwijderen.

Voor analyse aliquot 50 microliter van elk extract in een glazen inzetstuk en concentreer het met behulp van een vacuümconcentrator gedurende 30 minuten bij 30 graden Celsius. GCMS-analyse onthulde 107 geannoteerde metabolieten voor alle behandelingen, waaronder een reeks aminozuren, organische zuren, koolhydraten, vetzuren en steriel. K betekent clustering geïdentificeerd drie verschillende clusters van monsters.

De holobiont-monsters waren intermediair tussen de gescheiden gastheer- en symbiontenfracties. Hoewel K clusterverdelingen, parallelle coördinaten en heatmap-visualisatie in de relatieve overvloed van metabolieten betekent, gaven ze aan dat het holobiont-profiel beter overeenkwam met het gastheerfractieprofiel dat significant verschilde van zowel het gastheer- als het symbiontenprofiel. De gastheer- en symbiontprofielen waren significant verschillend van elkaar met 100 individuele metabolieten, significant verschillend tussen de gastheer- en symbiontfracties.