Isolierung von Maus respiratorischen Epithelzellen und der Exposition gegenüber Experimental Zigarettenrauch bei Air Liquid-Interface

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, Epithelzellen der Atemwege zu isolieren, um die toxischen Wirkungen der Exposition gegenüber Zigarettenrauch zu untersuchen. Dies wird erreicht, indem zuerst die Luftröhren der Maus präpariert und dann die Luftröhren in Pronaselösung verdaut werden. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, Epithelzellen zu sammeln und die Quid-Kultur zu vermehren.

Der dritte Schritt besteht darin, die Kulturen an einer Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche zu differenzieren. Der letzte Schritt des Verfahrens besteht darin, Epithelzellen apikalem Zigarettenrauch an der Grenzfläche zwischen Luft und Flüssigkeit auszusetzen. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die durch Immunfluoreszenzmikroskopie eine vollständig differenzierte Monoschicht von Epithelzellen zeigen.

Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen im Bereich der chronisch obstruktiven Lungenerkrankungen zu beantworten, wie z. B. die Auswirkungen der Exposition gegenüber Zigarettenrauch auf die CLIA-Morphologie und die durch Zigarettenrauch induzierten biochemischen Marker für Zellverletzungen. Beginnen Sie mit den Vorbereitungen für dieses Verfahren einen Tag vor der Dissektion, indem Sie Schinken vorbereiten. Medien F 12, die Antibiotika enthalten, Schinken, F 12 Medien, die Antibiotika enthalten, und 20 %F-B-S-M-T-E-C, Basismedium, das Antibiotika enthält.

MTEC-Medium mit 5%FBS-DNA, einer Lösung, Retinsäure-Stammlösungen und MTEC-Proliferationsmedium gemäß den Anweisungen im schriftlichen Protokoll. Sterilisieren Sie alle chirurgischen Instrumente, die bei der Dissektion verwendet werden sollen, am Tag der Dissektion. Stellen Sie sicher, dass der Sezierbereich sauber ist und dass alle Sezierwerkzeuge griffbereit sind.

Sterilisieren Sie die Gewebekulturhaube. Dann arbeiten Sie in der Gewebekulturhaube. Bereiten Sie eine Lösung von 0,15 % Pronase vor.

Fügen Sie 15 Milligramm Pronase zu 10 Millilitern Schinken hinzu. F 12 Medien, die Antibiotika enthalten, in einem konischen 50-Milliliter-Röhrchen. Bis zur Verwendung auf Eis legen.

Luftröhren von Mäusen werden präpariert Mit chirurgischen Standardverfahren desinfizieren Sie den Schlauch mit den Luftröhren und legen Sie ihn in die Gewebekulturhaube. Übertragen Sie das Luftröhrengewebe in eine 100 Millimeter große Petrischale mit Schinken F 12 Medien, die Antibiotika enthalten. Verwenden Sie eine sterile chirurgische Pinzette, um das Bindegewebe aus den Luftröhren zu entfernen.

Übertragen Sie dann die sauberen Luftröhren in die zweite 100-Millimeter-Petrischale mit den Schinken. F 12 Medien mit Antibiotika. Schneide die Luftröhren mit einer Präparierschere entlang der vertikalen Achse und lege das Lumen frei.

Übertragen Sie die Luftröhren in das konische 50-Milliliter-Röhrchen mit 10 Millilitern Pronase-Lösung und stellen Sie sie in den Kühlschrank, um sie über Nacht bei vier Grad Celsius zu inkubieren. Bereiten Sie abschließend mit Kollagen behandelte Transwell-Platten für die Verwendung vor. Am nächsten Tag fügen Sie 50 Milligramm Kollagen hinzu, eines pro Milliliter 0,02 N Essigsäurepipette einen Milliliter dieser Lösung in jede Vertiefung einer 12.

Well trans well Platte. Wickeln Sie die Platte in Para-Folie ein und lassen Sie sie über Nacht bei Raumtemperatur in der Gewebekulturhaube stehen. Am nächsten Tag.

Drehen Sie den Schlauch mit den Luftröhren der Maus 10 bis 12 Mal vorsichtig um. Lassen Sie dann den Inhalt des Röhrchens weitere 30 bis 60 Minuten bei vier Grad Celsius inkubieren. In der Gewebekulturhaube werden 10 Milliliter Schinken F 12 mit Antibiotika in 20%FBS in das konische Röhrchen mit dem verdauten Trachealgewebe pipettiert und 12 Mal invertiert.

Anschließend werden 10 Milliliter Schinken F 12 mit Antibiotika in 20 % FBS in je drei konische 15-Milliliter-Röhrchen pipettiert. Verwenden Sie eine sterile Nudelpipette, um das Trachealgewebe von der Pronaselösung in das erste der Röhrchen mit den ergänzten Schinken zu übertragen. F 12 media.

Legen Sie die Pronase-Lösung auf die Eiskappe, den Schlauch mit dem Trachealgewebe, und drehen Sie sie vorsichtig 12 Mal um, um sie zu mischen. Übertragen Sie dann mit der Nudelpipette das Trachealgewebe in das zweite konische 15-Milliliter-Röhrchen und drehen Sie dieses Röhrchen 12 Mal um. Wiederholen Sie den Transfer- und Inversionsvorgang mit dem letzten konischen 15-Milliliter-Röhrchen.

Zum Schluss verwenden Sie die Nudelpipette, um das Trachealgewebe zu entfernen und zu entsorgen. Dann wird die Pronaselösung aus dem Eis entnommen und die drei 15-Milliliter-Volumina der supplementierten Schinken F 12 Medien mit der Pronaselösung kombiniert. Zentrifugieren Sie die Probe in der gekühlten Zentrifuge bei vier Grad Celsius für 10 Minuten bei 1.400 Umdrehungen pro Minute, nachdem die Zentrifugation die Supena verworfen hat, pipettieren Sie dann etwa 100 bis 200 Mikroliter DNA, eine Lösung pro Luftröhre, auf das Pellet und reus.

Mit leichtem Klopfen aufhängen. Inkubieren Sie die Zellen fünf Minuten lang auf Eis. Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 1.400 Umdrehungen pro Minute für fünf Minuten bei vier Grad Celsius und verwerfen Sie das Supinat.

Pipettieren Sie dann acht Milliliter MTEC-Medium mit einem Gehalt von 10 % FBS auf das Pellet und die Resuspendierungsplatte. Die Zellsuspension auf einer Paria-Platte inkubiert bei 37 Grad Celsius in einer Atmosphäre aus 95 % Luft und 5 % Kohlendioxid für fünf bis sechs Stunden. Dies ist ein negativer Selektionsschritt für die Entfernung von Fibroblasten.

Nach der Inkubation die Zellsuspension von der Paria-Platte auffangen und in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen pipettieren. Spülen Sie die Platte dann zweimal mit vier Millilitern MTEC-Medium mit einem Gehalt von 10 % FBS aus. Übertragen Sie beide Wäschen in das konische 50-Milliliter-Röhrchen, das die Zellsuspension enthält.

Pipettieren Sie einen Milliliter der Zellsuspension in ein Einor-Röhrchen. Reservieren Sie dieses Aliquot für die Zytospin-Analyse und die Zellzählzentrifuge. Das konische 50-Milliliter-Röhrchen, das die restlichen 15 Milliliter Zellsuspension enthält, entspricht 1.400 Umdrehungen pro Minute bei vier Grad Celsius für 10 Minuten.

Während der Zentrifugation die Kollagenlösung aus der zuvor vorbereiteten Transwell-Platte entfernen und verwerfen. Lassen Sie die Platte fünf Minuten unter der Haube trocknen und waschen Sie sie dann nach der letzten Wäsche zweimal mit PBS. Aspirieren Sie das gesamte PBS und pipettieren Sie nach der Zentrifugation 1,5 Milliliter Proliferationsmedium in das Basalkompartiment der Transvertiefung.

Das Supinat wird verworfen und das Zellpellet in einem geeigneten Volumen des Proliferationsmediums resuspendiert, um die Beschichtung von 7,5 mal 10 auf die vier bis eins mal 10 auf die fünf Zellen in 500 Mikrolitern Suspension pro Vertiefung zu erleichtern. Pipettieren Sie 500 Mikroliter Zellsuspension auf die apikale Oberfläche der transworld Polycarbonatmembran. Einfügen. Inkubieren Sie die untergetauchten MTEC-Kulturen bei 37 Grad Celsius in einem befeuchteten Inkubator mit 95 % Luft und 5 % Kohlendioxid für sieben bis 10 Tage, wobei das Medium jeden zweiten Tag gewechselt wird.

Messen Sie den trans-epithelialen Zellwiderstand mit einem Intervallometer. Wenn der Epithelwiderstand 1000 Ohm pro Quadratzentimeter erreicht und die Kulturen konfluent erscheinen. Konvertieren Sie in eine LI-Kultur, indem Sie die apikalen Medien entfernen.

Ersetzen Sie auch Basalmedien durch MTEC basische Medien, die 2% neues Serum und Retinsäure enthalten. Inkubieren Sie die Kulturen 10 bis 14 Tage lang bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid, um eine Differenzierung mit Medienwechseln jeden zweiten Tag zu ermöglichen. Stellen Sie zunächst die Räuchermaschine gemäß den Angaben des Herstellers auf.

Notieren Sie das Gewicht eines unbenutzten Polflexfilters. Setzen Sie dann den Filter in den Inline-Edelstahlhalter auf dem Probenahmerohr ein, das von der Probenahmeöffnung an der Räucherkammer zur Konstantstrompumpe führt. Verbinden Sie die Probenahmeeinheit mit dem Gaszähler über ein Abflussrohr unter Verwendung eines CS-Zellen-Belichtungssystems.

Setzen Sie die apikale Seite der Transworld-Kulturen dem Mainstream-Zigarettenrauch von drei R vier F Forschungs-Referenzfilterzigaretten aus. Setzen Sie die Zellen dem Rauch von ein bis zwei Zigaretten aus. Kontrollkulturen sind für einen gleichwertigen Expositionszeitraum der Raumluft auszusetzen, nachdem die Gasprobenahme an Gewicht zugenommen hat.

Beim Pool-Flex-Filter wird das Gesamtmaterial, das sich auf dem Filter ablagert, in Milligramm normalisiert. Für das Gesamtvolumen der beprobten Luft ergibt der Rauch von ein bis zwei Zigaretten typischerweise 100 bis 200 Milligramm pro Kubikmeter TPM. Ernten Sie nach der Zigarettenexposition die Zellen und Basalmedien für weitere Analysen.

Dies ist ein Beispiel für eine gesunde Monoschicht aus respiratorischen Epithelzellen der Maus, die für Kernepithelzellen und C-Marker gefärbt wurde. Für eine erfolgreiche epitheliale Isolierung, Proliferation und Differenzierung wird eine intakte Monoschicht mit einer Kopfsteinpflastermorphologie verwendet. Die Kulturen sind im Wesentlichen frei von Fibroblasten.

Diese elektronenmikroskopischen Aufnahmen sind repräsentativ für gesunde MTEC-Kulturen und zeigen die Ultrastruktur der verschiedenen Zelltypen und die CELIA-Morphologie. Dieses Live-Zell-Imaging-Video zeigt die gesunde C-Morphologie von MTEC-Kulturen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Trachealepithelzellen von Mäusen isoliert, sie in einer Luftflüssigkeitsschnittstelle unterscheidet und sie dem üblichen Zigarettenrauch aussetzt.