Neuromodulation 및 Mitochondrial 교통 : 긴 기간이 이상 Hippocampal 뉴런의 라이브 영상

이 절차의 전반적인 목표는 살아있는 세포 형광 현미경을 사용하여 장기간에 걸쳐 미토콘드리아 수송 및 배양된 뉴런을 시각화하는 것입니다. 이는 먼저 배양된 뉴런의 미토콘드리아를 기관 L 표적 형광 단백질로 표지함으로써 이루어집니다. 절차의 두 번째 단계는 제어 조건에서 미토콘드리아 수송의 이미지를 획득하는 것입니다.

절차의 세 번째 단계는 세로토닌과 같은 신경 조절제의 급성 투여 후 미토콘드리아 수송의 타임 랩스 이미지 시리즈를 획득하는 것입니다. 절차의 마지막 단계는 획득한 타임랩스 이미지 시리즈의 분석을 수행하는 것입니다. 궁극적으로, 신경전달물질이 미토콘드리아 수송을 조절한다는 것을 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다.

이러한 결과는 장기간에 걸쳐 뉴런에서 형광 표지된 미토콘드리아를 이미징함으로써만 얻을 수 있습니다. 생명 염료 라벨링 또는 GFP의 일시적인 transfection과 같은 기존 기술에 비해 이 방법의 주요 장점은 이 방법을 통해 건강한 배양 뉴런에서 미토콘드리아 수송을 장기간 관찰할 수 있다는 것입니다. 이 절차를 시연하는 것은 제 연구실의 부연구원인 Chen이 안정적으로 가열되고 가습된 환경을 제공하기 위

스테이지 상단 인큐베이터는 폐쇄 회로를 통해 표준 조직 배양 인큐베이터에 연결되며, 35mm 유리 바닥 배양 접시용 A-P-F-T-E 멤브레인 뚜껑은 인큐베이터 내 환경과 신경 세포 배양물 간의 가스 교환을 가능하게 합니다. 이러한 기능과 다른 기능을 함께 사용하면 다양한 실험 조건에서 배양된 뉴런을 장기간 관찰할 수 있습니다. 배양된 해마 뉴런을 포함하는 배양 접시를 전달하여 mito turbo red 단백질을 조직 배양 후드로 발현합니다.

플라스틱 뚜껑을 PFTE 멤브레인 뚜껑으로 교체하고 배양 접시를 현미경으로 옮깁니다. 인큐베이터 바닥을 현미경 스테이지에 끼운 다음 멤브레인으로 덮인 배양 접시에 조심스럽게 안착시킵니다. 오목한 개구부에서 인큐베이터 인클로저를 인큐베이터 베이스의 강철 기둥에 맞추고 인클로저를 베이스로 내립니다.

인클로저와 베이스 사이에 잘 밀봉될 때까지 나비 나사를 조입니다. 이미징 소프트웨어를 열기 전에 현미경 필터 휠 컨트롤러, 광원 및 CCD 카메라를 켜십시오. 이 프로토콜에서 슬라이드 북 5는 이미지 획득에 사용됩니다.

63 x 오일 이멀젼 대물렌즈로 전환하고 대물렌즈 포탑을 내리십시오. 대물렌즈 표면에 이머젼 오일을 조심스럽게 바르십시오. 도구 모음에서 초점 창 아이콘을 클릭하고 램프 슬라이더를 이동하여 명시야 램프를 켭니다.

빛의 강도를 조정하려면 접안렌즈를 사용하여 세포 필드에 초점을 맞추고 관심 있는 세포를 찾으십시오. 접안렌즈를 사용하여 스코프 탭에서 XI 3 필터를 선택하고, mito turbo red protein으로 표지된 세포에서 미토콘드리아에 대한 초점면을 찾은 다음 CCD 카메라로 전환합니다. 도구 모음에서 이미지 캡처 아이콘을 클릭하여 초기 노출 시간 100밀리초부터 시작합니다.

테스트를 사용하여 최적의 노출을 찾고 캡처 창에서 최상의 버튼을 찾습니다. 캡처 유형 상자 아래. 타임랩스 옵션을 확인하고 타임랩스 캡처 옵션에서 원하는 이미징 간격과 이미징 세션 시간을 선택합니다.

캡처 창의 오른쪽 하단에 있는 시작 버튼을 클릭하여 타임랩스 이미지 획득을 시작합니다. 대조군 이미징 세션을 캡처한 후 스테이지 상단 인큐베이터 상단의 주입 포트를 통해 신경 전달 물질 또는 기타 시약을 투여합니다. 세로토닌 수용체 작용제(agonist)를 추가하면 화살촉으로 표시된 8개의 O-H-D-P-A-T-A 이전에 정지해 있던 미토콘드리아가 해마 뉴런의 축삭돌기를 따라 움직입니다.

개별 미토콘드리아의 평균 속도와 방향성은 세로토닌이 추가되기 전에 요약됩니다. 대부분의 미토콘드리아는 정지해 있지만, 세로토닌이 추가된 후 미토콘드리아의 42%는 이제 세로토닌이 없을 때 방향성 움직임을 보이는 미토콘드리아보다 방향성 움직임을 보이고 더 먼 거리를 이동합니다. 반대로, 도파민이 추가되면 미토콘드리아의 92%가 이 절차에 따라 이미징 세션의 마지막 15분까지 정지합니다.

추가적인 질문에 답하기 위해 하나 이상의 신호를 모니터링하기 위한 다른 방법들을 수행할 수 있다. 예를 들어, 뉴런의 칼슘 활동과 미토콘드리아 수송이 어떻게 관련되어 있는지 등입니다.