하는 세포 칼슘의 형광 및 생물 발광 영상 ^{2 +} 노인 해마 신경 세포에서

이 절차의 전반적인 목표는 신경 노화의 모델로 간주되는 프랫 해마 뉴런의 장기 배양에서 세포질 및 미토콘드리아 칼슘의 형광 및 생물 발광 이미징을 사용하여 노화 뇌의 칼슘 리모델링을 조사하는 것입니다. 이 방법은 칼슘 과부하와 관련된 세포 내 칼슘의 리모델링이 흥분 독성 및 뉴런 손상에 어떻게 기여하는지와 같은 노화 분야의 주요 질문을 이해하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 이점은 이 기술 줄기를 통해 또는 뇌졸중 또는 세포 나 질병의 치료에서 다른 DYS에 배양을 사용하여 개별 뉴런의 칼슘 리모델링을 밀접하게 따를 수 있다는 것입니다.

이 비디오를 본 후, 예수는 쥐 해마 뉴런의 단기 및 장기 배양에서 세포질 및 미토콘드리아 칼슘의 형광 및 회상 이미징을 수행하는 방법을 잘 이해하게 되었습니다. 이 절차를 시작하려면 페트리 접시의 파라폼 스트립에 커버 슬립을 분배하십시오. 그런 다음 각 커버 슬립에 밀리리터당 1밀리그램씩 폴리D 라이신 200마이크로리터를 바르고 밤새 처리합니다.

다음날 멸균 상태에서 15분 동안 90분 동안 이중 증류 멸균수로 커버 슬립을 세척합니다. 커버 슬립을 멀티에 넣고 사용할 때까지 섭씨 37도, 5%CO2의 가습 인큐베이터에 보관하십시오. 해마 뉴런을 분리하려면 멸균 가위로 갓 태어난 새끼 쥐의 두개골을 열고 주걱으로 뇌를 추출한 다음 햄의 F 12 배지로 빠르게 씻습니다.

그런 다음 각 반구에서 메스로 대각선으로 절단하고 현미경으로 햄 F 12 매체가 들어있는 페트리 접시로 옮깁니다. 수막은 버리십시오. 피질 위의 특징적인 오목한 위치에 있는 해마를 조심스럽게 확인하십시오.

그런 다음 조심스럽게 잡아당겨 눈 가위를 사용하여 제거하여 피질에서 해마를 분리합니다. 다음으로, 해마 조각을 1.8ml의 사전 여과된 페판 용액이 들어 있는 바이알에 옮깁니다. 섭씨 37도에서 15분 동안 가끔 부드럽게 흔들어 배양합니다.

그런 다음 90마이크로리터의 DNA 용액을 추가합니다. 밀리리터당 50마이크로그램을 넣고 15분 더 배양합니다. 그런 다음 조직을 10ml 원심분리기 튜브로 옮기고 새로운 신경 기저 배양 배지로 조각을 씻습니다.

조직 조각을 5ml 플라스틱 피펫에 통과시켜 세포 현탁액을 얻습니다. 다음으로, 160G에서 5분 동안 세포 현탁액을 원심분리합니다. 그 후, 플라스틱 멸균 목초지 피펫을 사용하여 supinate를 제거하고 1ml 자동 피펫으로 1ml의 신경 기초 배양 배지에 펠릿을 조심스럽게 현탁시킵니다.

다음으로, 중성자 계수 챔버를 사용하여 세포 밀도를 측정합니다. 10마이크로리터의 세포 현탁액을 추가하고 현미경으로 사용한 세포의 수를 세어 봅니다. 다음 대략 30, 000의 세포를 포함하는 세포 현탁액의 40에서 80 마이크로리터를 얻기 위하여 대응 계산을 실행하십시오.

신경 기초 매체의 500 마이크로리터를 포함하는 4개의 우물 판에서는, 약 30 의 유리제 덮개 미끄러짐을 포함하는 각 우물에 000의 세포를 놀았다. 어린 뉴런의 경우 2-5일 동안 인큐베이터에 보관하고, 노화된 뉴런의 경우 15일 이상 체외에서 보관합니다. 이 절차에서는 어두운 실온에서 60분 동안 오전 2:00 미만으로 세포를 배양합니다.

그런 다음 커버 슬립을 풍부한 챔버로 옮깁니다. 그런 다음 도립 현미경의 홀더에 커버 슬립이 있는 풍부 챔버를 놓습니다. 미시적 영역을 선택하고 예열 HBS로 세포를 지속적으로 관류합니다.

그 후, epi는 340 및 380 나노 미터에서 셀을 비춥니다. 그런 다음 520나노미터에서 방출되는 빛을 5-10초마다 형광 카메라로 기록하고, 이는 피라 투 다이크 미러로 필터링됩니다. 기록된 형광 이미지를 분석하려면 먼저 Aqua Cosmos 소프트웨어를 사용하여 실험 파일을 열고 비율을 클릭한 다음 원하는 비율 범위를 선택합니다.

비율 이미지의 시퀀스를 얻기 위해 결과 이미지에서 픽셀 대 픽셀 비율을 계산합니다. 그런 다음 배경 제거 버튼을 조정하여 배경을 뺍니다. 그런 다음 계산 시작을 누르십시오.

그런 다음 전체 시간 시퀀스 버튼을 누르고 개별 세포의 정량 분석을 위해 이전 ROI를 지웁니다. 새로운 ROI 또는 개별 뉴런에 해당하는 ROI를 설정합니다. 개별 기록을 그래프로 표시하려면 그래프를 클릭하여 각 ROI에 해당하는 비율 형광 값을 Origin lab 프로그램으로 내보냅니다.

그런 다음 계산을 클릭하고 TXT 파일을 저장합니다. 그 후, MIT 돌연변이 플라스미드로 배양된 뉴런에 대한 각 자극에 대한 각 자극에 반응하여 형광 비율의 상승 크기를 추정하기 위한 해당 계산을 수행합니다. 먼저, 바이알에 트랜스펙션 시약을 함유한 용액 A 50마이크로리터를 준비합니다.

다음으로, 바이알에 MIT ute 플라스미드를 함유한 용액 B 50마이크로리터를 준비합니다. 용액 B를 용액 A에 추가하고 20분 동안 배양합니다. 그 후, 해마 뉴런이 포함된 커버 슬립을 200마이크로리터의 신선한 신경 기저 TF가 포함된 새로운 멀티 플레이트로 옮깁니다. 그런 다음 100마이크로리터의 용액 A와 B를 각 커버 슬립에 한 방울씩 넣고 30분 동안 배양합니다.

30분 후 매체를 제거합니다. 신선한 신경 기저 tf로 세포를 씻으십시오. 일단 다시 돌아오면 덮개는 원래의 신경 기저 배양 배지로 미끄러져 들어가고 transfection 후 24시간 동안 세포를 배양하여 프로브의 효율적인 발현 및 표적화가 가능합니다.

다음으로, 4마이크로리터의 실란트 TEREZIN N을 200마이크로리터의 HBS에 첨가하여 4마이크로몰의 최종 농도를 얻습니다. 부드럽게 섞어 어두운 곳에서 실온에서 2시간 동안 배양합니다. 2시간 후, 전사 커버가 관류 챔버로 미끄러져 들어가 예열 HBS 용액으로 계속 정독합니다.

미토콘드리아 칼슘 농도의 생물 발광 이미지를 기록하려면 형광 방출로 표시된 것처럼 APO corin을 발현하는 세포가 포함된 현미경 필드를 선택합니다. 다음으로 현미경 조명을 끕니다. 빛의 통로에 있는 이색성 포함 상자를 제거합니다.

그런 다음 여기 조명을 끄고 어두운 상자를 닫아 완전한 어둠을 만듭니다. 섭씨 37도에서 예열된 테스트 용액의 유무에 관계없이 HBS 배지로 세포를 관류합니다. 그런 다음 이미지 프로세서로 처리되는 광자 계수 카메라로 10초마다 광자 방출 이미지를 캡처합니다.

다음으로, dig toin을 추가하여 나머지 광자를 모두 방출하여 미토콘드리아 칼슘을 반영하는 생물 발광 이미지를 분석합니다. GFP 형광 이미지를 엽니다. 형질주입된 세포 주위를 그려 개별 ROI를 선택합니다.

그런 다음 시퀀스의 모든 이미지에 동일한 ROI를 복사하여 붙여넣습니다. 화면 캡처. 그런 다음 각 ROI에 대한 광자 방출 값을 계산 클릭 그래프를 위해 특정 소프트웨어로 내보냅니다.

모든 ROI에 대한 값을 계산하려면 총 값을 선택하고 모든 이미지에 현재 ROI를 사용합니다. 그런 다음 계산을 누르고 텍스트 파일을 저장하고 데이터를 내보냅니다. 다음으로, 표시된 각 자극에 대한 반응으로 미토콘드리아 칼슘의 상승 크기를 추정하기 위해 해당 계산을 수행합니다.

다음은 100 마이크로몰 및 MDA로 자극 전후의 해마 뉴런의 단기 및 장기 배양에 대한 대표적인 명시야 및 유사 컬러 이미지이며, 더 따뜻한 색상은 상승된 세포질 칼슘 농도를 반영합니다. 이러한 미량은 해마 뉴런의 단기 및 장기 배양에서 100마이크로몰 및 MDA에 대한 반응으로 세포질 칼슘 농도의 대표적인 단세포 기록을 보여줍니다. 세포질 칼슘 농도 증가는 단기적으로 배양된 뉴런보다 장기적으로 훨씬 더 큽니다.

이 실험에서는 배양된 해마 뉴런을 GFP에 융합한 저친화성 미토콘드리아 표적 코린으로 형질주입하고, 4개의 마이크로몰 실란트 테레진으로 배양하고, 미토콘드리아 칼슘 농도의 생물 발광 이미징을 실시했습니다. 여기, 단기 및 장기 배양 된 해마 뉴런에서 미토콘드리아 칼슘을 반영하는 광 방출의 방출을 보여주는 녹음. MDA 100 마이크로몰은 노화된 뉴런에서 미토콘드리아 칼슘 농도를 증가시켰지만, 이 절차에 따라 젊은 배양 해마 뉴런에서는 증가하지 않았습니다.

공정한 좌측 평가와 같은 다른 방법은 뉴런 세포에 대한 감수성, 노화 신경 퇴행 및 허혈과 관련된 납과 같은 추가 질문에 답하기 위해 동일한 세포에서 형광 및 생물 발광 이미징과 결합할 수 있습니다.