Экстракции ДНК из парафин материала для генетических и эпигенетических Анализы

В этом видео будет показано, как извлечь ДНК из образцов тканей, залитых парафином. Образец, использованный в этой демонстрации, представляет собой тканевое ядро диаметром три миллиметра и длиной шесть миллиметров. В то время как в этой демонстрации используется одно ядро, более крупные образцы более пяти миллиметров в диаметре и 10 миллиметров в длину, или два-три ядра такого размера, как здесь, могут быть обработаны за одну реакцию.

Тем не менее, важно отметить, что могут потребоваться корректировки протокола, чтобы обеспечить полное удаление парафина и переваривание тканей. Это достигается с помощью ксилола, так как ксилол и фенол токсичны. Любые работы с этими химическими веществами следует проводить в вытяжном шкафу, добавьте 800 микролитров ксилола в пробирку, содержащую ваш образец.

Затем поместите образец на коромысло на 10 минут с легким встряхиванием. Уменьшите темп вращения образца при 14 000 об/мин в течение трех минут, чтобы гранулировать образец, а затем удалите ксилол и растворите парафин из пробирки. Повторите эти действия два-три раза, пока парафин полностью не растворится.

Ткань должна казаться влажной и мягкой. Важно удалить весь парафин для увеличения конечного выхода ДНК. Поэтому для более крупных образцов тканей требуется больше промывок.

Теперь, когда парафин был удален из образца, ткань должна быть регидратирована, чтобы обеспечить ее переваривание. Это достигается с помощью серии регидратации этанола. Сначала добавьте 800 микролитров 100% этанола в образец и вращайте образец со скоростью 14 000 об/мин в течение трех минут.

Удалите надосадочную жидкость. Повторите эти действия, используя 800 микролитров 70% этанола, а затем 50% этанола. Финальный отжим должен длиться пять минут, потому что ткань будет менее твердой и требует большего усилия для гранулирования.

Теперь ткань должна быть переварена, чтобы высвободить ДНК из клеток. Это делается с помощью буфера для лизиса, раствора, состоящего из белка Дена, такого как SDS и протеиназа. K. Фермент, ответственный за деградацию тканей.

Добавьте в образец от 200 до 500 микролитров буфера для лизиса. В зависимости от размера, 400 микролитров — это хороший объем для использования. Конечно, компоненты буфера для лизиса, а также температура инкубации 56 градусов по Цельсию служат для максимальной активности белка.

ACE K. Поскольку белок, ACE K, может разрушать ткани только в течение определенного времени, необходимо периодически добавлять больше фермента для продолжения реакции. 20 микролитров белка. АПФ К в концентрации 10 мг/М добавляют в образец утром и вечером до полного растворения ткани.

Когда вы не видите более твердой ткани, необходимо извлечь ДНК из буфера клеточного мусора. Насыщенный фенол используется для разделения образца на водную и органическую фазы. Водная фаза содержит ДНК.

Важно использовать буферный насыщенный фенол, потому что кислотность нормального фенола не только ухудшает вашу ДНК, но и инвертирует слоистость водной и органической фаз. Имейте в виду, что буферный насыщенный фенол хранится в две фазы. Фенол является нижним слоем.

Добавьте к образцу равный объем буфера насыщенного фенола и переверните пробирку несколько раз. Далее поместите образец в центрифугу и раскрутите его. 14 000 об/мин в течение пяти минут для индуцирования разделения фаз.

ДНК и РНК будут обнаружены в верхней водной фазе, в то время как белок, липиды и полисахариды будут обнаружены в интерфазной и нижней органической фазе. Осторожно снимите водный слой, не нарушая интерфазу, и поместите его в новую пробирку. Часто после первого спина интерфейс расшатывается и обратно.

Требуется экстракция с использованием небольших объемов воды. Протокол для обратного извлечения можно найти в тексте, сопровождающем это видео. Повторяйте эти шаги до тех пор, пока граница раздела не станет чистой, что обычно достигается после трех-пяти повторений путем добавления равного объема фенолхлороформа, изоамилового спирта к образцу ДНК.

Это служит той же цели, что и фенол в отдельности, но заостряет границу раздела для максимизации выхода ДНК. Повторите эту процедуру один или два раза, пока интерфейс не станет четким и четким. Теперь, когда в образце нет белка, необходимо удалить любую загрязняющую РНК.

Это достигается за счет РНК. К образцу добавляют деградационные РНК А в конечной концентрации 100 микрограммов на милль, и образец инкубируют в течение одного часа при температуре 37 градусов Цельсия. Теперь, когда РНК разрушена, фермент РНК должен быть удален

Процедура очистки ДНК повторяется, как и раньше. Используя сначала буферный насыщенный фенол, а затем перейдя к фенолхлороформе изоамиловому спирту, потребуется меньше этапов очистки, поскольку единственным загрязнением теперь является фермент РНК А и деградированная РНК. Теперь, когда образец содержит только ДНК, ДНК необходимо осаждать из раствора добавить одну 10-ю, объем ацетата натрия и один объем изопропанола.

В качестве альтернативы можно добавить два с половиной объема этанола, но в этом случае потребуется пробирка большего размера. Инкубируйте образец при температуре минус 20 градусов Цельсия в течение от 30 минут до часа или, если вы работаете допоздна ночью. Теперь, когда вы работаете с ДНК, убедитесь, что образец остается на льду, чтобы он не разлагался.

Вращайте образец при 14 000 об/мин в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия, чтобы гранулировать осажденную ДНК. Удалите надосадочную жидкость, стараясь не сместить гранулу, чтобы удалить избыток солей, которые могут помешать более поздним экспериментам, таким как секвенирование. Например, добавьте один мил охлажденного, 70%-ного этанола и аккуратно восстановите, суспензируйте образец.

Снова уменьшите темп пробы при 14 000 об/мин в течение 10 минут при температуре 4 градуса Цельсия. Осторожно удалите надосадочную жидкость и дайте избытку этанола высохнуть на воздухе в течение пяти минут. Важно не пересушить пробу.

Наконец, ДНК очищается и готова к ресуспендированию в буфере по вашему выбору. Здесь мы используем автоклавную дистиллированную воду. О, да.

Храните образцы ДНК при температуре минус 20 градусов Цельсия для последующего использования. После завершения экстракции вы должны оценить качество и количество вашей ДНК. Для этого с помощью спектрометрии вы с помощью NanoDrop 30 устанавливаете тип измерения на нуклеиновую кислоту, выбираете DNA 50 в качестве расчета и инициализируете прибор 1,5 микролитрами воды.

Очистите тумбу и сделайте замер болванкой, используя 1,5 микролитра разбавителя. В данном случае дистиллированная вода. Очистите пьедестал и загрузите 1,5 микролитра образца и нажмите измерить. Да, отлично.

Соотношение A two 60 over two 80 1,8 является идеальным на данном этапе. Ваша ДНК готова к использованию в последующих приложениях, которые включают, помимо прочего. Матричная, сравнительная геномная гибридизация, метилирование, ДНК, иммунопреципитация и секвенирование.

Ссылки на эти протоколы показаны здесь, если они не нужны немедленно. Храните образцы при температуре минус 20 градусов Цельсия для последующего использования.