Medición de los efectos de anticuerpos en la función celular de cardiomiocitos aislados

El objetivo general del siguiente experimento es detectar los anticuerpos cardiotrópicos en el plasma de pacientes con miocardiopatía dilatada u otras enfermedades cardíacas de base autoinmune. Esto se logra mediante una inmunoabsorción mínima inicial del plasma del paciente en columnas de esferos con anticuerpos anti-IgG para purificar la inmunoglobulina G como segundo paso. Se aíslan cardiomiocitos ventriculares de ratas Wistar adultas, proporcionando la base celular para este bioensayo.

A continuación, se permite que los cardiomiocitos se adhieran a las cubiertas de la cámara y se tiñan con URA 2:00 AM para permitir la observación del transitorio de calcio intracelular durante las contracciones; luego, se prueba la IgG del paciente para observar su efecto sobre la contractilidad del cardiomiocito. Los resultados demuestran si la IgG de un paciente contiene anticuerpos trópicos, basándose en los cambios en la contractilidad y en el transitorio de calcio en los cardiomiocitos aislados. La ventaja principal de esta técnica frente a métodos existentes, como los inmunoensayos estándar para la detección de anticuerpos, es que es independiente de un antígeno específico y permite discriminar entre anticuerpos estimulantes y bloqueantes.

El procedimiento será demostrado por Google y contará con asistencia técnica de nuestro laboratorio. Para comenzar este procedimiento, prepare las columnas de inmunoabsorción miniatura cargando tres mililitros de esferos anti-IgG por cada dos mililitros de plasma de paciente con EDTA en una columna econopak vacía. A continuación, coloque un filtro encima de los esferos anti-IgG.

Corte la punta inferior de la columna y presione el filtro para alcanzar un flujo de aproximadamente una gota por segundo. Luego, lave la columna tres veces con un volumen de plasma de cloruro de sodio al 0,9 %. Introduzca el plasma en la columna mediante pipeta cuando el plasma se haya impregnado completamente en el anti IgG Spheros, y lave con el mismo volumen de cloruro de sodio al 0,9 %. A continuación, añada mediante pipeta un volumen de plasma de glicina clorhidrato 0,2 molar a pH 2,8 en la columna y deje que se impregne en el phos.

Luego, agregue otro volumen de clorhidrato de glicina a la columna. Recopile el flujo en un tubo de 15 mililitros y ajuste el pH a 7,3 con tris clorhidrato 0,5 molar a un pH de 8,0 para regenerar la columna. Lávela con tres volúmenes de plasma de clorhidrato de glicina tras un lavado final con dos volúmenes de cloruro de sodio al 0,9 %.

La columna puede utilizarse para la siguiente muestra de plasma destinada al uso en cardiomiocitos. La fracción de IgG recolectada debe dializarse frente al tampón experimental, primero llenando la fracción de IgG en un tubo de diálisis de membrana de estearato de celulosa con un corte de peso molecular de 100 kilodaltons. Luego, coloque el tubo en un litro de EB y agite lentamente con un agitador magnético a cuatro grados Celsius. Después de ocho horas, transfiera el tubo de diálisis a tres litros de EB fresco y dialice durante otras 20 horas a cuatro grados Celsius tras la diálisis.

Hervir la muestra durante 30 minutos a 57 grados Celsius en un baño de agua. Para inactivar los factores del complemento, determinar la concentración total de IgG y preparar alícuotas, cada una conteniendo 330 microgramos de IgG. En este procedimiento, preparar el tampón de aislamiento sin calcio según el manuscrito adjunto.

Luego, llene 80 mililitros de IB en el depósito superior de un sistema de perfusión con termostato y mantenga el tampón a 37 grados Celsius, aireándolo con 95% oxígeno, 5% dióxido de carbono durante 30 minutos. Disuelva aproximadamente entre 7.000 y 10.000 unidades de colagenasa tipo dos y 174 miligramos de BSA libre de ácidos grasos en 20 mililitros. IB que contenga cloruro de calcio 112,5 micromolar y ajuste el pH del tampón de aislamiento en el depósito superior si es necesario.

A continuación, anestesie una rata wistar de 175 a 200 gramos utilizando tiopental a 375 microgramos por kilogramo con 2.500 UI de heparina añadidas a la solución de tiopental. Tras realizar una toracotomía, extirpe cuidadosamente el corazón con el arco aórtico intacto y transfiéralo a cloruro de sodio al cero punto cero por ciento en hielo, en cloruro de sodio frío con hielo. Retire la sangre y el tejido circundante del corazón.

Luego, transfiera a 0,9 % de cloruro de sodio fresco y exponga la aorta. Encienda el reductor de flujo del sistema langor para obtener una velocidad de goteo de dos a tres gotas por segundo. A continuación, fije el corazón a la cánula.

Perfúndalo durante hasta tres minutos con un caudal de una gota por segundo para eliminar la sangre residual. Después, circule el IB en el sistema LOR. Ahora retire 20 mililitros de tampón del depósito superior.

Llene el depósito con la solución de colagenasa y rellene con tanto tampón como sea necesario para alcanzar 80 mililitros. A continuación, haga circular la solución de digestión durante otros 27 minutos. Después, desprenda el corazón de la cánula.

Retire los atrios y la aorta, luego corte los ventrículos en trozos pequeños. Permita que el tampón de digestión fluya hacia el depósito inferior. Reduzca el volumen a un máximo de 40 mililitros para continuar la digestión de los ventrículos troceados durante 10 a 15 minutos bajo aeración continua con 95%oxígeno, 5%dióxido de carbono.

A continuación, filtre la suspensión celular a través de una gasa de tamaño de malla de 200 micrones en un tubo de 50 mililitros. Por último, restablezca el contenido de calcio de las células centrifugando la suspensión celular a 40 3G durante dos minutos. A temperatura ambiente, resuspenda las células en 10 mililitros.

IB con 200 micromoles por litro de cloruro de calcio, centrifugar nuevamente y resuspender las células en 10 mililitros. IB con 500 micromoles por litro de cloruro de calcio. Tras una centrifugación final, resuspender los cardiomiocitos en EB estéril filtrado hasta una densidad de 50.000 células por mililitro.

Recubra los cubreobjetos en una cámara de cuatro pocillos con 10 microgramos de laminina por pocillo y espere hasta que esté completamente seco. Luego, agregue un mililitro de la suspensión de cardiomiocitos en cada pocillo. Utilizando una micropipeta con la punta cortada y permita que las células se adhieran durante una hora a temperatura ambiente, diluya 10 microlitros de la solución stock de fura 2:00 AM de un miligramo por mililitro en cinco mililitros de EB y mantenga la solución de tinción en la oscuridad.

A continuación, retire el tampón y las células no adheridas de los cubreobjetos; pipete 0,5 mililitros de la solución de tinción en cada uno. Incube las células durante 10 minutos con agitación moderada. Posteriormente, retire la solución de tinción y lave las células una vez con un mililitro de EB.

Luego, agregue 0,5 mililitros de EB a cada pocillo en este procedimiento, coloque el cubreobjetos bajo un microscopio de fluorescencia invertido conectado a un sistema de registro de calcio y contractilidad de miocitos. Coloque un electrodo personalizado con un tubo de entrada y salida en el primer pocillo y super. Fuse los cardiomiocitos con un mililitro por minuto de EB.

Comience la estimulación eléctrica a 20 voltios, un hercio y una duración de cinco milisegundos por pulso, y permita que las células se adapten a la estimulación durante aproximadamente dos minutos. Seleccione un cardiomiocito en forma de varilla intacto, con estrías visibles y contracción constante, y colóquelo en el centro del campo visual. Luego, abra el canal de la cámara y oriente la célula horizontalmente dentro del área de video girando el adaptador de sujeción de la célula y moviendo la platina del microscopio.

Ajuste el límite de los elementos de control de detección del área de video. Encienda el canal fluorescente y registre de 10 a 15 contracciones para obtener el acortamiento celular inicial y el transitorio de calcio. A continuación, apague el canal de luz del microscopio para evitar el blanqueo del colorante fluorescente.

Cambie el flujo desde EB al derivador de la muestra mediante una válvula de tres vías y fusione los cardiomiocitos con un mililitro de IgG del paciente. Detenga la bomba justo antes de que el aire alcance el pocillo, active el canal de luz y registre otros 10 a 15 contracciones para obtener la respuesta aguda de la célula. Luego, pause la grabación y vuelva a desactivar el canal de luz, repita las grabaciones a los dos y cinco minutos, y retire el electrodo del pocillo cuando finalicen. Al final, analice el acortamiento celular y el transitorio de calcio con el software IonWizard, utilizando respectivamente la longitud del borde dividida por longitud y la ventana de razón restada numéricamente URA2.

A continuación, calcule los cambios porcentuales para las respuestas aguda, a los dos minutos y a los cinco minutos a partir de la altura inicial del acortamiento celular y del pico del transitorio de calcio. A continuación se muestra un ejemplo representativo de la medición control. El acortamiento celular y el transitorio de calcio se monitorearon en línea antes de la superfusión con IgG y de forma inmediata a los dos minutos y a los cinco minutos después de la superfusión con IgG.

Y aquí se muestra un ejemplo de la medición de una muestra de IgG que contiene anticuerpos cardio-depresores. El acortamiento celular y el transitorio de calcio se midieron en línea antes de la superfusión con IgG y inmediatamente a los dos minutos y a los cinco minutos tras la superfusión con IgG. Tras ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo detectar anticuerpos cardio-depresores en plasma de pacientes mediante la medición del efecto de la IgG aislada sobre el acortamiento celular y el transitorio de calcio en cardiomiocitos adultos aislados.