GST-la sua purificazione: A Two-step Affinity Purification protocollo Cedendo Full-length proteine ​​purificate

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di ottenere una proteina di interesse altamente purificata e a lunghezza intera. Ciò si ottiene producendo un virus bao ricombinante, che viene utilizzato per infettare nove cellule di insetti SF al fine di ottenere una versione altamente espressa e solubile a due marcatori della proteina di interesse. Viene quindi intrapresa una purificazione di affinità in due fasi, caratterizzata dalla purificazione del glutatione, proteina marcata siero, seguita da cromatografia di affinità dei metalli.

Il risultato della purificazione è una proteina altamente pura marcata con istidina. Successivamente, i campioni di proteine purificate vengono dializzati per garantire basse concentrazioni di sale nel tampone di conservazione. Si ottengono risultati che mostrano l'espressione, la solubilità, la quantità e la qualità della proteina in base alla colorazione proteica intera di un gel SDS.

Abbiamo avuto l'idea di questo metodo quando abbiamo avuto problemi a purificare proteine grandi e instabili come PAL B due e BOC due. Quindi il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come la purificazione per affinità in una fase, è che nel nostro protocollo di purificazione per affinità in due fasi, la proteina ottenuta è altamente pura e generalmente priva di prodotti di degradazione. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della biologia delle proteine, come le funzioni biochimiche delle proteine ricombinanti purificate.

Questo protocollo inizia con la produzione del virus bao ricombinante, seguito dalla selezione del virus BA più efficiente, come descritto nel protocollo di testo per l'infezione. Preparare un recipiente di coltura spinner contenente tra 0,75 e 1,0 volte 10 per le sei cellule SF nove in 500 millilitri di terreno con un rapporto di uno a 150 tra virus e terreno. Posizionare lo spinner sotto una cappa di coltura cellulare, infettare le cellule aggiungendo il volume necessario di sospensione del virus baula nella sospensione cellulare attraverso un braccio dello spinner.

Lascia che le cellule infette crescano in sospensione a 27 gradi Celsius e raccogli le cellule quando viene raggiunta la massima espressione proteica, che viene determinata quando si sceglie il virus maculare più efficiente. Dopo aver raccolto le cellule, liscia SF nove cellule che esprimono la proteina di interesse in circa 20 millilitri di tampone legante GST, integrato con inibitori della proteasi in un bagno di acqua ghiacciata. Immergere la soluzione 20 volte con un omogeneizzatore verso il basso, quindi sonicare per tre 32 cicli prima di ballare di nuovo 20 volte, centrifugare il lisato cellulare a 18.000 giri/min per 30 minuti a quattro gradi Celsius e mantenere il surnatante, incubare il lisato cellulare solubile con un millilitro di perle GST prelavate per un'ora a quattro gradi Celsius sotto una leggera rotazione.

Il tempo di incubazione deve essere ottimizzato in base alla stabilità del pro e all'efficienza del legame dopo il legame. Centrifugare rapidamente a 700 giri/min e rimuovere il surnatante contenente proteine non legate. Lavare le proteine legate alla GST con il tampone di lavaggio GST.

Ripetere questo processo due volte dopo l'ultimo lavaggio. Rimuovere quanto più surnatante possibile. Quindi incubare le perle con cinque millimolari di A TP e 15 millimolari di cloruro di magnesio in 10 millilitri di tampone legante GST per un'ora a quattro gradi Celsius per evitare il legame non specifico delle proteine da shock termico dopo l'incubazione.

Lavare le perline tre volte con il tampone di lavaggio GST. Dopo aver centrifugato le perle GST e rimosso il surnatante, lavare le perle GST con un tampone P cinque. Successivamente, dividi le perle GST, infrazioni di 100 microlitri e aggiungi da quattro a otto unità di enzima di precisione diluito in 100 microlitri di tampone P cinque.

Incubare le perle GST con l'enzima per tre ore o per una notte a quattro gradi Celsius con una leggera rotazione. Il tempo di incubazione deve essere ottimizzato in base al peso molecolare e alla stabilità della proteina dopo la scissione. Gira velocemente e raccogli il surnatante.

Aggiungere 100 microlitri di tampone P 5 alle perline. Quindi ripetere, centrifugare e raccogliere il surnatante due volte. Estrai tutte le frazioni.

Dividere l'EIT in tre frazioni da un millilitro e incubare ciascuna con 100 microlitri di perle secche di resina di affinità metallica per artigli prelavate per un'ora a rotazione, dividendo l'eluizione in più frazioni, aumenta l'efficienza di legame e lavaggio. Quindi lavare la resina per cinque minuti con tampone P 30 a quattro gradi Celsius con una leggera rotazione. Dopo aver ripetuto il lavaggio due volte, tirare le perle in un unico tubo per eluire la proteina purificata.

Aggiungere il tampone P 500 alla resina talon legata alle proteine. Aggiungere un rapporto tra buffer e perline di volume uno a uno. Volume. Incubare la sospensione per cinque minuti a rotazione.

Ripetere questo passaggio due volte. Mantenere separata ogni frazione elusa per la conservazione della proteina purificata. Dializzare la proteina con un tampone di conservazione appropriato due volte per un'ora a quattro gradi Celsius sotto agitazione.

È importante verificare la precipitazione della proteina purificata durante la dialisi. Preparare piccole aliquote delle proteine purificate e congelare su ghiaccio secco per 30 minuti. Conservare le aliquote a una temperatura negativa di 80 gradi Celsius ed evitare molti cicli di congelamento del disgelo.

Analizza il processo di purificazione caricando circa 20-40 microlitri di ciascuna frazione su un gel SDS. Dopo aver eseguito la colorazione del gel con blu di kumasi o colorazione proteica per la visualizzazione, i lisati cellulari solubili e totali di cellule SF nove infettate con il virus valo ricombinante REC 14 o infettati simulati come controllo sono stati analizzati mediante colorazione blu di Kumasi, consentendo la conferma dell'espressione della proteina GST re 14 durante il processo di purificazione. Molti campioni sono stati analizzati per seguire l'efficienza del metodo di analisi di questi campioni da parte di kumasi Blue.

La colorazione mostra che durante la prima fase di purificazione, GST Rec 14 è stato correttamente legato a perle GST con un peso molecolare apparente di circa 50 kilodalton a causa della fusione di rec 14 con GST dopo la scissione di precisione con G-S-T-G-S-T, il sibilo libero rec 14 migra intorno ai 37 kilodalton. Mentre la GST scissa può essere visualizzata sulle perline GST, nonostante una parte di REC 14 esente da GST rimanesse ancora legata alle perline GST, è stato ottenuto un notevole arricchimento del sibilo REC 14. Questo passaggio potrebbe essere migliorato aumentando il tempo di incubazione della proteina con un'analisi di precisione della proteasi del sibilo di REC 14 legato alle perle di Talon rispetto alle proteine alluse dopo la fase di purificazione della GST mostra che una grande frazione del sibilo di REC 14 è legata alle perle di Talon.

Dopo diversi lavaggi, il sibilo REC 14 è stato eluso e raccolto, sono state eseguite tre illusioni. L'analisi ha rivelato un'elevata purezza del sibilo rec 14 e la massima concentrazione del sibilo rec 14 nel primo confronto elluciano delle frazioni eluse con le perle di artiglio dopo che Ellucian ha illustrato l'efficienza dell'illusione. Poiché il sibilo rec 14 è poco rilevabile come legato sulle perline.

Questi campioni sono stati anche sottoposti ad analisi del sangue occidentale con anticorpi anti GST e anti sibilo per seguire REC 14. Durante tutta la procedura, l'anti GST blot mostra che alcuni GS TRE 14 e GST da soli erano presenti nelle proteine alluse dalla fase di purificazione GST e che i contaminanti sono stati rimossi dalla fase di purificazione dell'affinità hiss tag. Questo blot rivela che la GST è stata rimossa in modo efficiente da re 14 mediante il trattamento di precisione e la fase di purificazione del ttag sibilante.

L'anti hiss blot mira a rilevare re 14. Questa macchia conferma che il sibilo GST Rec 14 e il sibilo REC 14 non sono stati completamente tagliati e rimossi dalle perline GST. Inoltre, ad alta concentrazione REC 14 sembra aggregarsi.

In sintesi, i risultati presentati dimostrano l'efficienza della purificazione del sibilo GST per la purificazione del palmo S B rec 14. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come recuperare un'energia altamente abbellita. Proteina combinante Una volta padroneggiata.

Questa tecnica può essere eseguita in 12 ore dopo la degenerazione dell'acido solubile se viene eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di lavorare rapidamente e rigorosamente a quattro gradi Celsius per evitare la degradazione delle proteine Dopo questa procedura. Altri metodi, come i saggi di precipitazione del codice o la spettrometria di massa, possono essere eseguiti per rispondere a domande aggiuntive, come l'identificazione di partner proteici o la modifica post-traduzionale della proteina di interesse.

Sebbene utilizziamo questo metodo per il DNA, le proteine di riparazione potrebbero essere modificate per studiare la funzione delle proteine in altre aree di ricerca.