Name: Automated interazione idrofobica colonna di selezione cromatografia per lutilizzo in purificazione di proteine (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 21 s
Description: Scopri un metodo automatizzato per selezionare colonne di cromatografia a interazione idrofobica ottimali per la purificazione di proteine ricombinanti. Questa tecnica riduce la variabilità e garantisce risultati riproducibili.

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Questo lavoro è stato finanziato dal National Institutes of Health di sovvenzione GM086822 e National Science Foundation importante ricerca strumentazione concessione DBI-0960313. Gli autori desiderano ringraziare Drs. Jon Hardy &amp; Donna Miyake (Bio-Rad) e Jennifer Loertscher (Seattle University) alla loro competenza tecnica. Selezionare reagenti cromatografia e strumentazione supplementare stati generosamente fornito da Bio-Rad.

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</ol>

Selezionare reagenti cromatografia e strumentazione supplementare sono stati forniti da Bio-Rad.

Tecniche di cromatografia liquida hanno dimostrato prezioso per la preparazione di proteine ​​altamente purificate necessari per lo svolgimento di 6 immunologica, biochimica 7 e 8 studi strutturali. Metodi di purificazione HIC più spesso richiedono determinazione empirica di un mezzo preferito, e la struttura ligando, densità di ligando, e matrice proprietà tallone tutti hanno dimostrato di impatto risultati cromatografici 2, 3. Colonna Automated scouting è un approccio efficace per la selezione di un mezzo di HIC per l&#39;ottimizzazione e la successiva purificazione di proteine ​​4. Il metodo automatizzato colonna esplorazione presentato può essere facilmente adattato alle strategie di varie proteine ​​HIC purificazione. Alterazioni concentrazione salina, scelta di sale, gradiente salino, e il pH può ulteriormente migliorare le condizioni di purificazione, e gli effetti delle variazioni di questi parametri essenziali sono stati precedentemente recensione 13,14. HIC eluato contenente una prote bersaglio parzialmente purificatoin può essere ulteriormente purificato utilizzando una tecnica cromatografica complementare, come cromatografia a scambio ionico (IEX) o gel filtrazione / cromatografia per esclusione dimensionale 9,10. A causa della sua assorbanza di luce unico e caratteristiche di emissione, il profilo di eluizione di GFP può essere identificato utilizzando in-linea e post-run approcci. A tal fine, questo protocollo può ulteriormente essere adattato per la purificazione di ricombinanti di fusione GFP-proteine, in cui una proteina bersaglio è correlato &quot;tag&quot; con GFP. Proteine ​​bersaglio GFP-etichetta può essere rilevato con luce UV 11 e purificato usando vari metodi cromatografici, compresa la strategia di purificazione HIC sopra descritto. Depurazione GFP è diventata anche un fiocco pedagogico nei laboratori di biochimica per l&#39;insegnamento di tecniche moderne della scienza delle proteine ​​12. Mentre base purificazione della proteina HIC può essere condotta utilizzando un sostanzialmente meno robusto cromatografia sygambo, la strumentazione qui presentata ha un numero di vantaggi distinti per aiutare a ottenere risultati favorevoli. Notevoli vantaggi di utilizzare un sistema altamente automatizzato includono il miglioramento delle run-to-run condizioni di riproducibilità, risparmio di tempo e diminuzione opportunità per l&#39;aria di essere introdotte nel sistema 10. Sistema di controllo miscelazione tampone, che viene facilitata dalla massimizzatore sistema, consente maggiore coerenza nella preparazione tampone e riproducibilità sperimentale. Disegno abbastanza carico campione nel ciclo del campione dinamico per tutti i scouting corre successiva garantisce l&#39;uniformità del campione che viene aggiunto ad ogni colonna e permette la replica in sequenza senza interruzioni o manuale ricarica. Iniezione del campione controllato dal circuito campione attraverso la colonna diminuisce variabilità che può verificarsi con caricamento manuale del campione. Una coppia di valvole di selezione di colonna per consentire corse campioni consecutivi, ciascuno utilizzando una colonna HIC differente, senza dover rinnovare gli impianti idraulici del sistema. Esecuzione di mul<html> ti-lunghezza d&#39;onda analisi è particolarmente vantaggioso quando saggiando una proteina con un unico profilo spettrofotometrico. Oltre a GFP, citocromi, flavoproteine ​​e altri eme contenenti proteine ​​possono beneficiare di questa tecnica. Dispositivi di controllo di conducibilità e pH per consentire la verifica delle condizioni sperimentali in tempo reale. Frazione collezione Split eluato consente una gestione migliore frazione e consente il trasferimento facile per Post-Run metodi di analisi che richiedono un volume minimo di campione (ad esempio ELISA, SDS-PAGE, western blot, e Experion elettroforesi microfluidica). Durante il funzionamento il secondo in linea collettore di frazioni richiede sincronizzazione manuale, permette la massima flessibilità nella scelta frazione collettore. Gli inconvenienti più significativi a utilizzare un sistema robusto cromatografia per la colonna HIC scouting e purificazione della proteina comprende il tempo iniziale e spese di bilancio connesse con l&#39;acquisizione dello strumento e la formazione degli operatori. t &quot;&gt; Il protocollo qui presentato utilizza un Bio-Rad DuoFlow sistema di cromatografia. tuttavia, strumentazione altrettanto robusto da altri produttori, come il Avant AKTA da GE Healthcare, possono anche essere utilizzati e sono in grado di produrre risultati equivalenti sistema di cromatografia Anche comparabile hanno caratteristiche uniche (ad esempio il metodo di programmazione, i limiti nomenclatura dei componenti, le preferenze dell&#39;operatore, e scalabilità) che devono essere considerati prima di avviare una procedura di purificazione o di acquisizione dello strumento.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reattivo </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti (opzionale) </td></tr><tr><td> <a href="http://www.bio-rad.com/prd/en/US/adirect/biorad?cmd=BRCatgProductDetail&productID=223301" target="_blank">BioLogic DuoFlow Pathfinder 20 Sistema</a> </td><td> <a href="http://www.bio-rad.com/" target="_blank">Bio-Rad</a> </td><td> <a href="http://www.bio-rad.com/prd/en/US/adirect/biorad?cmd=BRCatgProductDetail&productID=223301" target="_blank">7602257</a> </td><td> Include il sistema di Maximizer, mixer, workstation F10, AVR7-3 valvole, QuadTec UV / Vis con rivelatore di cella di flusso, collettore di frazioni BioFrac, software BioLogic e starter kit </td></tr><tr><td> <a href="https://www.bio-rad.com/prd/en/US/adirect/biorad?cmd=catProductDetail&isFromSearch=true&productID=760-0408&vertical=LSR&parentCategoryGUID=22c495f1-36ff-44a3-9140-ee7e54d0b1ba" target="_blank">AVR9-8 stream-selezionare valvola</a><html></td><td> <a href="http://www.bio-rad.com/" target="_blank">Bio-Rad</a> </td><td> <a href="https://www.bio-rad.com/prd/en/US/adirect/biorad?cmd=catProductDetail&isFromSearch=true&productID=760-0408&vertical=LSR&parentCategoryGUID=22c495f1-36ff-44a3-9140-ee7e54d0b1ba" target="_blank">7600408</a> </td><td> Valvola di alta pressione, 9-port, 8 posizioni, 3.500 psi (233 bar) limite, per l&#39;utilizzo con sistema biologico DuoFlow </td></tr><tr><td> Valvola deviatrice SV3T-2 </td><td> <a href="http://www.bio-rad.com/" target="_blank">Bio-Rad</a> </td><td> 7600410 </td><td> Elettrovalvola, a 3 porte, 2-posizione, 30 psi (2 bar) limite, per l&#39;utilizzo con sistema biologico DuoFlow </td></tr><tr><td> Flusso splitter valvola </td><td> <a href="http://www.bio-rad.com/" target="_blank">Bio-Rad</a> </td><td></td><td></td></tr><tr><td>verticale = LSR &amp; parentCategoryGUID = &quot;target =&quot; 22c495f1-36ff-44a3-9140-ee7e54d0b1ba _blank &quot;&gt; DynaLoop 25 Kit </td><td> <a href="http://www.bio-rad.com/" target="_blank">Bio-Rad</a> </td><td> <a href="https://www.bio-rad.com/prd/en/US/adirect/biorad?cmd=catProductDetail&isFromSearch=true&productID=750-0451&vertical=LSR&parentCategoryGUID=22c495f1-36ff-44a3-9140-ee7e54d0b1ba" target="_blank">7500451</a> </td><td> Sliding-pistone ciclo kit campione, include 25 ml DynaLoop scorrevole anello del pistone, DynaLoop parti kit (# 750-0450) </td></tr><tr><td> <a href="https://www.bio-rad.com/prd/en/US/LSR/PDP/ec82e7b4-919e-428b-ac03-9adf1f50a48e/BioFractrade_Fraction_Collector" target="_blank">Raccoglitore di frazioni BioFrac</a> </td><td> <a href="http://www.bio-rad.com/" target="_blank">Bio-Rad</a> </td><td> <a href="https://www.bio-rad.com/prd/en/US/LSR/PDP/ec82e7b4-919e-428b-ac03-9adf1f50a48e/BioFractrade_Fraction_Collector" target="_blank">7410002</a> </td><td> Due frazione col<html> lettori usati </td></tr><tr><td> <a href="https://www.bio-rad.com/prd/en/US/adirect/biorad?cmd=catProductDetail&isFromSearch=true&productID=741-0088&vertical=LSR&parentCategoryGUID=ec82e7b4-919e-428b-ac03-9adf1f50a48e" target="_blank">BioFrac micropiastra goccia adattatore testa</a> </td><td> <a href="http://www.bio-rad.com/" target="_blank">Bio-Rad</a> </td><td> <a href="https://www.bio-rad.com/prd/en/US/adirect/biorad?cmd=catProductDetail&isFromSearch=true&productID=741-0088&vertical=LSR&parentCategoryGUID=ec82e7b4-919e-428b-ac03-9adf1f50a48e" target="_blank">7410088</a> </td><td></td></tr><tr><td> <a href="https://www.bio-rad.com/prd/en/US/adirect/biorad?cmd=catProductDetail&vertical=LSR&country=US&lang=en&productID=741-0017" target="_blank">BioFrac microtiter piastra di adattamento</a> </td><td> <a href="http://www.bio-rad.com/" target="_blank">Bio-Rad</a> </td><td>&amp; Country = US &amp; lang = en &amp; ProductID = &quot;target =&quot; _blank 741-0017 &quot;&gt; 7410017 </td><td></td></tr><tr><td> <a href="https://www.bio-rad.com/prd/en/US/adirect/biorad?cmd=catProductDetail&isFromSearch=true&productID=750-0202&vertical=LSR&parentCategoryGUID=c140016b-1958-4a91-be4c-8645a4c8204f" target="_blank">UV Ottica Module</a> </td><td> <a href="http://www.bio-rad.com/" target="_blank">Bio-Rad</a> </td><td> <a href="https://www.bio-rad.com/prd/en/US/adirect/biorad?cmd=catProductDetail&isFromSearch=true&productID=750-0202&vertical=LSR&parentCategoryGUID=c140016b-1958-4a91-be4c-8645a4c8204f" target="_blank">7500202</a> </td><td></td></tr><tr><td> <a href="https://www.bio-rad.com/prd/en/US/adirect/biorad?cmd=catProductDetail&isFromSearch=true&productID=760-1331&vertical=LSR&parentCategoryGUID=c4095dc1-9260-4431-b066-823b050048c8" target="_blank">Lampada alogena</a> </td><td> <a href="http://www.bio-rad.com/" target="_blank">Bio-Rad</a> </td><td> &lt;<html> un target = &quot;_blank&quot;&gt; 7601331 </td><td></td></tr><tr><td> <a href="https://www.bio-rad.com/prd/en/US/adirect/biorad?cmd=BRCatgProductDetail&productID=220901" target="_blank">Econo Gradient Pump</a> </td><td> <a href="http://www.bio-rad.com/" target="_blank">Bio-Rad</a> </td><td> <a href="https://www.bio-rad.com/prd/en/US/adirect/biorad?cmd=BRCatgProductDetail&productID=220901" target="_blank">7319001</a> </td><td> Pompa gradiente a bassa pressione purificazione della proteina, comprende tubi e raccordi kit </td></tr><tr><td> <a href="https://www.bio-rad.com/prd/en/US/adirect/biorad?cmd=BRCatgProductDetail&productID=224301" target="_blank">Experion sistema</a> </td><td> <a href="http://www.bio-rad.com/" target="_blank">Bio-Rad</a> </td><td>bio-rad.com/prd/en/US/adirect/biorad? cmd = BRCatgProductDetail &amp; ProductID = &quot;target =&quot; 224301 _blank &quot;&gt; 7.007.001 </td><td></td></tr><tr><td> <a href="https://www.bio-rad.com/prd/en/US/adirect/biorad?cmd=BRCatgProductDetail&productID=224101" target="_blank">Experion Pro260 Analisi Kit</a> </td><td> <a href="http://www.bio-rad.com/" target="_blank">Bio-Rad</a> </td><td> <a href="https://www.bio-rad.com/prd/en/US/adirect/biorad?cmd=BRCatgProductDetail&productID=224101" target="_blank">7007102</a> </td><td></td></tr><tr><td> HiTrap HIC colonna kit di selezione </td><td> GE Healthcare </td><td> 28-4110-07 </td><td> Include 7 x 1 ml preconfezionati colonne di mezzi di HIC per scouting </td></tr><tr><td> GE Healthcare-to-Bio-Rad colonna raccordi </td><td> GE Healthcare </td><td> 18111251 e 18111257 </td><td></td></tr></tbody></table>

automated interazione idrofobica colonna di selezione cromatografia per l&#39;utilizzo in purificazione di proteine

Automated Hydrophobic Interaction Chromatography Column Selection for Use in Protein Purification

A differenza di altri metodi cromatografici per proteine ​​purificante (gel ad esempio filtrazione, affinità, e scambio ionico), cromatografia di interazione idrofoba (HIC) richiede comunemente determinazione sperimentale (denominato screening o &quot;scouting&quot;) per selezionare il mezzo più adatto cromatografica per purificare una proteina dato 1. Il metodo qui presentato descrive un metodo automatizzato per scouting per un supporto ottimale HIC da utilizzare nella purificazione di proteine. HIC separa proteine ​​e di altre biomolecole da un lisato grezzo sulla base delle differenze di idrofobicità. Simile a cromatografia di affinità (AC) e cromatografia a scambio ionico (IEX), HIC è in grado di concentrare la proteina di interesse mentre avanza attraverso il processo cromatografico. Le proteine ​​più adatti per la purificazione da HIC sono quelli con le regioni superficie idrofoba e in grado di sopportare l&#39;esposizione a concentrazioni di sale in eccesso di 2 munizioni Mnio solfato ((NH 4) 2 SO 4). HIC è spesso scelta come metodo di purificazione di proteine ​​prive di una etichetta di affinità, e quindi inadatto per AC, e quando IEX non fornisce adeguata purificazione. Frazioni idrofobe sulla superficie della proteina temporaneamente legarsi ad un ligando non polare accoppiata ad un inerte, matrice immobile. L&#39;interazione tra proteina e legante sono altamente dipendenti dalla concentrazione salina del buffer che fluisce attraverso la colonna cromatografica, con alte concentrazioni ioniche rafforzamento della proteina-ligando e rendendo la proteina immobile (cioè vincolato all&#39;interno della colonna) 2. Come diminuzione delle concentrazioni di sale, la proteina-ligando dissipa, la proteina diventa nuovamente mobile e eluisce dalla colonna. Vari mezzi di HIC sono commercialmente disponibili in preconfezionati colonne, ciascuna contenente uno dei diversi ligandi idrofobi (ad esempio S-butile, butile, ottile, e fenil) reticolato a varie densità di perline di agarosio di una specificadiametro ific 3. Colonna di scouting automatizzato consente di adottare un approccio efficiente per determinare quali media HIC dovrebbe essere impiegato per i futuri, gli esperimenti di ottimizzazione più esaurienti e purificazione della proteina funziona 4. La proteina viene purificata specifico ecco ricombinante proteina verde fluorescente (GFP), tuttavia, il metodo può essere adattato per purificare altre proteine ​​con una o più regioni superficie idrofoba. GFP serve come una proteina modello utile, grazie alla sua stabilità, unico picco di assorbanza della luce a 397 nm, e la fluorescenza quando esposti a luce UV 5. Lisato batterico contenente GFP di tipo selvatico è stato preparato in un tampone ad alto sale, caricata in un Bio-Rad sistema mezzo cromatografia DuoFlow pressione del liquido, e adsorbiti colonne HiTrap HIC contenenti diversi supporti HIC. La proteina è stata eluita dalle colonne e analizzato in linea-e post-run metodi di rilevamento. Buffer blending, dinamica campione ansa di iniezione, col sequenzialeselezione UMN, multi-lunghezza d&#39;onda di analisi, e la frazione raccolta divisione eluato aumentato la funzionalità del sistema e la riproducibilità del metodo sperimentale.

Un metodo automatizzato per identificare adatti cromatografia interazione idrofoba (HIC) mezzi da utilizzare nel processo di purificazione di proteine ​​viene presentato. Il metodo utilizza un sistema di media pressione cromatografia liquida compreso il miscuglio tampone automatizzata, dinamico ciclo di iniezione del campione, selezione di colonna sequenziale, multi-lunghezza d&#39;onda di analisi, e la frazione raccolta divisione eluato.

Automated interazione idrofobica colonna di selezione cromatografia per l&#39;utilizzo in purificazione di proteine

A differenza di altri metodi cromatografici per la purificazione delle proteine (ad esempio la filtrazione su gel, l'affinità e lo scambio ionico), l'interazione idrofobica...

L'obiettivo generale di questa procedura è selezionare una colonna ottimale di cromatografia liquida per l'HI, utilizzando un metodo automatizzato di scouting per la purificazione di una proteina ricombinante con un sistema di cromatografia liquida a pressione media BioRad DUO flow. Questo viene realizzato preparando innanzitutto i tamponi necessari e i lisati batterici contenenti la proteina ricombinante di interesse. Successivamente, il sistema di cromatografia duo flow viene configurato fisicamente, collegato idraulicamente e preparato per il protocollo di scouting.Successivamente, i campioni vengono caricati ed eseguito il metodo di screening della colonna HI programmato per raccogliere il campione frazionario eit. Infine, l'EIT viene analizzato e la colonna HI e il mezzo ottimali vengono identificati in base alle caratteristiche di separazione osservate. In definitiva, è possibile ottenere risultati che indicano un mezzo di colonna HI preferito per la purificazione su larga scala della proteina di interesse del ricercatore mediante cromatografia liquida a media pressione, utilizzando le capacità automatizzate di screening della colonna HI del sistema DUO flow.Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come le esecuzioni sequenziali di cromatografia su colonna manuale, è che l'automazione del processo riduce la variabilità e garantisce risultati altamente riproducibili. In generale, le persone nuove rispetto a questo metodo potrebbero incontrare difficoltà a causa della complessità fisica dei moderni sistemi di cromatografia liquida. Tuttavia, questa complessità può essere facilmente padroneggiata.Dopo aver acquisito sufficiente pratica, la procedura verrà dimostrata da Orange Stone e Shelly Anderson, due studenti del mio laboratorio. Per iniziare, preparare 500 millilitri dei seguenti tamponi: 200 millimolari di fosfato di sodio per il tampone A1, 200 millimolari di fosfato monosodico per il tampone A2 e 4,8 molare di solfato di ammonio. Per il tampone B2, l'acqua deionizzata fungerà da tampone B1. Degasare i tamponi per garantire condizioni operative cromatografiche ottimali. Il sistema Maximizer mescolerà i tamponi A1 e A2 per generare un tampone di eluizione fosfato a basso contenuto salino, e mescolerà i tamponi B1 e B2 per generare il solfato di ammonio ad alto contenuto salino.Tampone iniziale. Preparare 20 millilitri di campione da caricare mescolando 10 millilitri di lisato cellulare contenente la proteina da purificare con 10 millilitri di tampone B due. La concentrazione finale di solfato di ammonio nella soluzione del lisato cellulare dovrebbe essere di circa 2,4 molare, rendendola approssimativamente equivalente al tampone iniziale.Filtrare la miscela del lisato attraverso un filtro per siringa con bassa capacità di legame per le proteine da 0,45 micrometri per rimuovere le particelle in sospensione dalla soluzione. Mantenere il campione sul ghiaccio fino al momento del caricamento nel sistema. La configurazione fisica e il cablaggio del sistema di cromatografia rappresentano uno degli aspetti più complessi di questa procedura.Configurare il sistema di cromatografia a flusso doppio secondo lo schema mostrato qui. Assicurarsi che siano disponibili volumi adeguati di tampone per l'intero protocollo e che i tubi rimangano costantemente immersi. Collegare la valvola di carico del campione e il loop dinamico del campione come illustrato qui, connettendo il loop del campione all'ingresso della valvola del campione nella posizione tre.Preparare otto coppie di tubi Peak di diametro esterno un sedicesimo di pollice, tutte delle stesse dimensioni. Quindi collegare le coppie alle posizioni da uno a otto delle due valvole di selezione della colonna. Dopo aver acceso le lampade del rivelatore UV e aver confermato che tutti i rivelatori sono stati calibrati, collegare la valvola dello splitter del flusso del raccoglitore frazionario e il relativo controller dello splitter come illustrato qui.La valvola del divisore del raccoglitore frazioni nella posizione due e il relativo controller vengono gestiti separatamente dalla stazione di cromatografia. Impostare la percentuale di divisione al 10%. Sostituire il drophead standard del raccoglitore frazioni nella posizione due con un drophead per micropiastre.Risciacquare il loop del campione e scaricare il sistema di cromatografia. Quindi avviare un flusso manuale di un millilitro al minuto di tampone di eluizione attraverso il sistema. Collegare colonne HI da un millilitro con alto trap ai punti da due a otto delle valvole di selezione colonna.Rimuovere il raccordo che collega le valvole di selezione della colonna della posizione due. Collegare i raccordi della colonna a monte al flusso doppio. Far passare il tampone eluente attraverso i raccordi fino a quando tutta l'aria sarà stata espulsa e si formerà una grossa goccia di tampone.Successivamente, rimuovere il tappo collegato all'ingresso della colonna e posizionare una goccia abbondante di tampone a bassa forza ionica sulla sommit&agrave; della colonna. Quindi collegare la colonna ai raccordi a monte. Collegare l'uscita ai raccordi della colonna a valle e al tubo della valvola di selezione.Impostare il limite di pressione in uscita a 40 PS.I lavare la colonna con cinque volumi di colonna. Buffer Evolution a un flusso di un millilitro al minuto. Lavare la colonna con 10 volumi di colonna di buffer iniziale a un flusso di un millilitro al minuto.Una volta stabilizzati manualmente i tracciati UV del pH e la pressione di retro, posizionare le valvole di selezione della colonna sulla posizione uno e arrestare il flusso del tampone. Per caricare un campione, immergere il tubo di ingresso del campione nel campione da 20 millilitri. Successivamente, spostare la valvola di carica/lavaggio del loop campione sulla posizione uno e la valvola di caricamento del campione sulla posizione di spurgo.Avviare l'azione della pompa di caricamento del loop del campione, aspirando il campione nel tubo della pompa a una portata di un millilitro al minuto fino a subito dopo che il campione ha raggiunto la valvola di caricamento del campione. Passare la valvola di caricamento del campione da spurgo a caricamento. Riavviare la pompa di caricamento del loop del campione a una portata di un millilitro al minuto fino a quando 10 millilitri di campione sono stati aspirati nel loop dinamico del campione dalla finestra di configurazione del software biologico.Selezionare i dispositivi di sistema contrassegnati con un asterisco in questa tabella. Successivamente, selezionare sei colonne HIC per il programma di saggio. Un gradiente lineare decrescente di sale e un metodo preliminare a sei colonne avviano manualmente il flusso del tampone iniziale a un millilitro al minuto.Premere il pulsante di avvio sul controller dello splitter per iniziare immediatamente la suddivisione del flusso EIT da 90% a 10% non appena avviato il metodo del programma; premere quindi il tasto di avvio sul pannello di controllo a schermo del frazionatore offline a piatto da 96 pozzetti. Osservare la visualizzazione in tempo reale per confermare i parametri previsti dell'esecuzione. Confrontare il tracciato di assorbanza specifico per GFP a 397 nanometri con il tracciato di assorbanza a 280 nanometri per le proteine in generale per stimare la separazione e purificazione relativa utilizzando i diversi mezzi HI in fase di valutazione. Aliquote di cinque a 50 microlitri dai frazioni del piatto a 96 pozzetti possono essere trasferite in un piatto nuovo e sottoposte a saggio per il contenuto proteico specifico mediante Elisa o Western blot e per il contenuto proteico totale mediante SDS-PAGE o un sistema Experion di elettroforesi microfluidica. Qui sono mostrati rappresentativi la conducibilità del gradiente salino e la pressione della colonna delle prove di screening.La variazione della concentrazione di sale, misurata in base alla percentuale di tampone prelevata dalle linee di tampone ad alta salinità, è tipica della metodologia HI. Quando la concentrazione di sale diminuisce, le proteine legate alla colonna eluiscono conducibilità, che corrisponde alla concentrazione di sale osservata; questa viene misurata in linea immediatamente dopo i rilevatori quad tech e UV. L'offset tra il gradiente di sale e le tracce di conducibilità indica il tempo necessario affinché il tampone percorra il tragitto dall'ingresso del tampone attraverso il sistema fino al monitor della conducibilità.Durante l'intero processo di analisi, la pressione del sistema e il pH rimangono relativamente costanti. Questa figura mostra i cromatogrammi di sequenze di prove preliminari sulla colonna HI con rilevamento in linea della proteina totale. La NGFP viene effettuata misurando l'assorbanza della luce a 280 nanometri e a 397 nanometri rispettivamente.È possibile approssimare l'abbondanza relativa di GFP e la separazione per ogni corsa di ricognizione. Confrontando le due linee in questa figura, i tubi di coltura per le frazioni 10, 12, 14, 16 e 18 della corsa di ricognizione FF del finocchio sono stati visualizzati alla luce ambiente o fluorescente e i tubi sotto luce ultravioletta sono stati osservati sia frontalmente che dall'alto per osservare lo spettro di emissione caratteristico della GFP, che è chiaramente rilevata nella frazione 14. In entrambe le immagini UV, il colore blu diffuso nel pannello sinistro UV è la luce emessa dalla lampada UV.Questi dati post-run corrispondono bene al rilevamento in linea della GFP mediante la misurazione dell'assorbanza dell'eluato a 397 nanometri, che identifica anch'esso la frazione 14 come contenente il picco principale della GFP eluita. Seguendo questa procedura, altri metodi come il western blot, il saggio ELISA, la microscopia a forza atomica e i saggi di ricostruzione biochimica possono essere eseguiti per rispondere a ulteriori domande relative alla purezza e all'attività funzionale della proteina in corso di purificazione.Nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare la necessità di un controllo manuale del sistema a flusso doppio in diversi punti del metodo. Esempi includono il riempimento dei tamponi e il caricamento del campione, la verifica della presenza di bolle d'aria e l'accensione o spegnimento delle lampade di rilevamento secondo necessità. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come utilizzare un sistema di cromatografia liquida per effettuare una ricerca automatizzata di colonne e supporti HI ottimali.L'analisi in linea e su scala preparativa permetterà al ricercatore di selezionare una colonna adatta per la successiva purificazione su scala maggiormente ampia, che potrebbe anche essere combinata con altri metodi cromatografici per aumentare la purezza e il rendimento della proteina bersaglio.

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