Automated interazione idrofobica colonna di selezione cromatografia per l'utilizzo in purificazione di proteine

L'obiettivo generale di questa procedura è selezionare una colonna ottimale di cromatografia liquida per l'HI, utilizzando un metodo automatizzato di scouting per la purificazione di una proteina ricombinante con un sistema di cromatografia liquida a pressione media BioRad DUO flow. Questo viene realizzato preparando innanzitutto i tamponi necessari e i lisati batterici contenenti la proteina ricombinante di interesse. Successivamente, il sistema di cromatografia duo flow viene configurato fisicamente, collegato idraulicamente e preparato per il protocollo di scouting.

Successivamente, i campioni vengono caricati ed eseguito il metodo di screening della colonna HI programmato per raccogliere il campione frazionario eit. Infine, l'EIT viene analizzato e la colonna HI e il mezzo ottimali vengono identificati in base alle caratteristiche di separazione osservate. In definitiva, è possibile ottenere risultati che indicano un mezzo di colonna HI preferito per la purificazione su scala ampliata della proteina di interesse del ricercatore mediante cromatografia liquida a media pressione, utilizzando le capacità automatizzate di screening della colonna HI con flusso DUO.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come le esecuzioni sequenziali di cromatografia su colonna manuale, è che l'automazione del processo riduce la variabilità e garantisce risultati altamente riproducibili. In generale, le persone nuove rispetto a questo metodo potrebbero incontrare difficoltà a causa della complessità fisica dei moderni sistemi di cromatografia liquida. Tuttavia, questa complessità può essere facilmente padroneggiata.

Dopo aver effettuato un'adeguata pratica, la procedura sarà dimostrata da Orange Stone e Shelly Anderson, due studenti del mio laboratorio. Per iniziare, preparare 500 millilitri dei seguenti tamponi: 200 millimolari di fosfato di sodio per il tampone A1, 200 millimolari di fosfato monosodico per il tampone A2 e 4,8 molare di solfato di ammonio. Per il tampone B2, l'acqua deionizzata fungerà da tampone B1; degasare i tamponi per garantire condizioni operative cromatografiche ottimali. Il sistema Maximizer mescolerà i tamponi A1 e A2 per generare un tampone di eluizione fosfato a bassa concentrazione salina, e mescolerà i tamponi B1 e B2 per generare il solfato di ammonio ad alta concentrazione salina.

Tampone iniziale. Preparare 20 millilitri di campione da caricare mescolando 10 millilitri di lisato cellulare contenente la proteina da purificare con 10 millilitri di tampone B due. La concentrazione finale di solfato di ammonio nella soluzione campione di lisato cellulare dovrebbe essere di circa 2,4 molare, rendendola approssimativamente equivalente al tampone iniziale.

Filtrare la miscela del lisato attraverso un filtro per siringa da 0,45 micrometri a bassa adesione proteica per rimuovere le particelle in sospensione dalla soluzione. Mantenere il campione sul ghiaccio fino al momento del caricamento nel sistema. La configurazione fisica e il cablaggio del sistema di cromatografia rappresentano uno degli aspetti più complessi di questa procedura.

Configurare il sistema di cromatografia a flusso doppio secondo lo schema mostrato qui. Assicurarsi che siano disponibili volumi adeguati di tampone per l'intero protocollo e che i tubi rimangano costantemente immersi. Collegare la valvola di carico del campione e il loop dinamico del campione come illustrato qui, connettendo il loop del campione all'ingresso della valvola del campione nella posizione tre.

Preparare otto coppie di tubi peak di diametro esterno un sedicesimo di pollice, tutte delle stesse dimensioni. Quindi collegare le coppie alle posizioni da uno a otto delle due valvole di selezione della colonna. Dopo aver acceso le lampade del rivelatore UV e aver confermato che tutti i rivelatori sono stati calibrati, collegare la valvola del divisore del flusso del collettore frazionario e il relativo controller del divisore come illustrato qui.

La valvola del divisore del raccoglitore frazioni nella posizione due e il relativo controller vengono gestiti separatamente dalla stazione di cromatografia. Impostare la percentuale di divisione al 10%. Sostituire il drophead standard del raccoglitore frazioni nella posizione due con un drophead per microtiter plate.

Risciacquare il loop del campione e scaricare il sistema cromatografico. Quindi avviare un flusso manuale di un millilitro al minuto di tampone di eluizione attraverso il sistema. Collegare colonne HI ad alto trappolamento da un millilitro alle posizioni da due a otto delle valvole di selezione colonna.

Rimuovere il raccordo che collega le valvole di selezione della colonna della posizione due. Collegare i raccordi della colonna a monte al flusso doppio. Far passare il tampone eluente attraverso i raccordi fino a quando tutta l'aria sarà stata espulsa e si formerà una goccia consistente di tampone.

Successivamente, rimuovere il tappo collegato all'ingresso della colonna e posizionare una goccia abbondante di tampone a bassa forza ionica sulla sommità della colonna. Quindi collegare la colonna ai raccordi a monte. Collegare l'uscita ai raccordi della colonna a valle e al tubo della valvola di selezione.

Impostare il limite di pressione in uscita a 40 PS.I lavare la colonna con cinque volumi di colonna di buffer Evolution a una portata di un millilitro al minuto. Lavare la colonna con 10 volumi di colonna di buffer iniziale a una portata di un millilitro al minuto.

Una volta stabilizzati manualmente i tracciati UV del pH e la pressione di retro, posizionare le valvole di selezione della colonna sulla posizione uno e arrestare il flusso del tampone. Per caricare un campione, immergere il tubo di ingresso del campione nel campione da 20 millilitri. Successivamente, spostare la valvola di lavaggio del loop di campionamento sulla posizione uno e la valvola di caricamento del campione sulla posizione di spurgo.

Avviare l'azione della pompa di caricamento del loop del campione, aspirando il campione nel tubo della pompa a una portata di un millilitro al minuto fino a subito dopo che il campione ha raggiunto la valvola di caricamento del campione. Passare la valvola di caricamento del campione da spurgo a caricamento. Riavviare la pompa di caricamento del loop del campione a una portata di un millilitro al minuto fino a quando 10 millilitri di campione sono stati aspirati nel loop dinamico del campione dalla finestra di configurazione del software biologico.

Selezionare i dispositivi di sistema contrassegnati con un asterisco in questa tabella. Successivamente, selezionare sei colonne HIC per il programma di saggio. Un gradiente lineare decrescente di sale e un metodo preliminare a sei colonne avviano manualmente il flusso del tampone iniziale a un millilitro al minuto.

Premere il pulsante di avvio sul controller dello splitter per iniziare immediatamente la suddivisione del flusso EIT in proporzione 90% a 10% non appena si avvia l'esecuzione del metodo del programma; premere quindi il pulsante di avvio sul pannello di controllo a schermo del frazionatore offline a piatto da 96 pozzetti. Osservare la visualizzazione in tempo reale per confermare i parametri previsti dell'esecuzione. Confrontare il tracciato di assorbanza specifico per GFP a 397 nanometri con il tracciato di assorbanza a 280 nanometri per le proteine in generale per stimare la separazione e la purificazione relative utilizzando i diversi mezzi HI in fase di valutazione. Aliquote di cinque a 50 microlitri dai frazioni del piatto a 96 pozzetti possono essere trasferite in un piatto nuovo ed analizzate per contenuto proteico specifico mediante ELISA o Western blot e per contenuto proteico totale mediante SDS-PAGE o un sistema Experion di elettroforesi microfluidica. Qui sono mostrati rappresentativi la conducibilità del gradiente salino di hick e la pressione della colonna delle prove di valutazione.

La variazione della concentrazione di sale, misurata in base alla percentuale di tampone prelevata dalle linee di tampone ad alta salinità, è tipica della metodologia HI. Quando la concentrazione di sale diminuisce, le proteine legate alla colonna eluiscono conducibilità, che corrisponde alla concentrazione di sale osservata; questa viene misurata in linea immediatamente dopo i rilevatori quad tech e UV. L'offset tra il gradiente di sale e le tracce di conducibilità indica il tempo necessario affinché il tampone percorra il tragitto dall'ingresso del tampone attraverso il sistema fino al monitor della conducibilità.

Durante l'intera corsa del campione, la pressione del sistema e il pH rimangono relativamente costanti. Questa figura mostra i cromatogrammi di corsa sequenziali di prova sulla colonna HI con rilevamento in linea della proteina totale. La NGFP viene effettuata misurando l'assorbanza della luce a 280 nanometri e a 397 nanometri rispettivamente.

È possibile approssimare l'abbondanza relativa di GFP e la separazione per ciascuna corsa di esplorazione. Confrontando le due linee in questa figura, i tubi coltura per le frazioni 10, 12, 14, 16 e 18 della corsa di esplorazione FF di finocchio sono stati visualizzati alla luce ambiente o fluorescente e i tubi sotto luce ultravioletta sono stati osservati sia frontalmente che dall'alto, al fine di osservare lo spettro di emissione caratteristico della GFP; la GFP è chiaramente rilevata nella frazione 14. In entrambe le immagini UV, il bagliore blu diffuso nel pannello UV sinistro è la luce emessa dalla lampada UV.

Questi dati post-run corrispondono bene al rilevamento in linea della GFP mediante la misurazione dell'assorbanza dell'eluato a 397 nanometri, che identifica anch'esso la frazione 14 come contenente il picco principale della GFP eluita. Seguendo questa procedura, altri metodi come il western blot, il saggio ELISA, la microscopia a forza atomica e i saggi di ricostruzione biochimica possono essere eseguiti per rispondere a ulteriori domande relative alla purezza e all'attività funzionale della proteina in corso di purificazione.

Nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare la necessità di un controllo manuale del sistema a flusso doppio in diversi punti del metodo. Esempi includono il riempimento dei tamponi e il caricamento del campione, la verifica della presenza di bolle d'aria e l'accensione o spegnimento delle lampade di rilevamento secondo necessità. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come utilizzare un sistema di cromatografia liquida per effettuare una ricerca automatizzata di colonne e supporti HI ottimali.

L'analisi in linea e su scala preparativa permetterà al ricercatore di selezionare una colonna adatta per la successiva purificazione su scala maggiormente ampia, che potrebbe anche essere combinata con altri metodi cromatografici per aumentare la purezza e il rendimento della proteina bersaglio.