Automated interazione idrofobica colonna di selezione cromatografia per l'utilizzo in purificazione di proteine

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di selezionare una colonna per cromatografia liquida HI ottimale utilizzando un metodo di scouting automatizzato per la purificazione di una proteina ricombinante con un sistema di cromatografia liquida a media pressione BioRad DUO. Ciò si ottiene preparando prima i tamponi necessari e lisati batterici contenenti la proteina ricombinante di interesse. Successivamente, il sistema di cromatografia a flusso duo viene fisicamente configurato, collegato e preparato per il protocollo di scouting.

Quindi i campioni vengono caricati e viene eseguito il metodo di scouting della colonna HI programmato per raccogliere la frazione di campione eit. Infine, l'EIT viene analizzato e vengono identificati la colonna e il terreno di coltura ottimali in base alle caratteristiche di separazione osservate. In definitiva, è possibile ottenere risultati che mostrano un mezzo di colonna HI preferito per la purificazione su larga scala della proteina di interesse dello sperimentatore attraverso la cromatografia liquida a media pressione utilizzando le funzionalità di scouting automatizzato della colonna HI DUO flow.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come le esecuzioni sequenziali della cromatografia manuale su colonna, è che l'automazione del processo riduce la variabilità e garantisce risultati altamente riproducibili. In generale, le persone che non conoscono questo metodo possono avere difficoltà a causa della complessità fisica dei moderni sistemi di cromatografia liquida. Tuttavia, questo può essere facilmente padroneggiato.

A seguito di una pratica sufficiente, a dimostrare la procedura saranno Orange Stone e Shelly Anderson, due studenti del mio laboratorio Per iniziare a preparare 500 millilitri dei seguenti tamponi, 200 millimolare di fosfato di sodio per tampone, A uno 200 millimolare di sodio idrogeno fosfato per tampone A due e 4,8 molari di solfato di ammonio. Per il tampone B, due acque deionizzate fungeranno da tampone B, uno degasserà i tamponi per garantire condizioni operative cromatografiche ottimali. Il massimizzatore del sistema mescolerà insieme i tamponi A uno e A due per generare un tampone di eluizione del fosfato a basso contenuto di sale e mescolerà i tamponi B uno e B due per generare il solfato di ammonio ad alto contenuto di sale.

Avvia buffer. Preparare 20 millilitri di campione da caricare mescolando 10 millilitri di lisato cellulare contenente la proteina da purificare con 10 millilitri di tampone B due. La concentrazione finale di solfato di ammonio della soluzione del campione di lisato cellulare deve essere di circa 2,4 molari, il che la rende approssimativamente equivalente al tampone iniziale.

Filtrare la miscela di tampone lisato attraverso un filtro a siringa da 0,45 micrometri a basso legame proteico per rimuovere il particolato dalla soluzione. Tenere il campione sul ghiaccio fino a quando non è pronto per essere caricato nel sistema. La configurazione fisica e l'impianto idraulico del sistema cromatografico sono uno degli aspetti più complicati di questa procedura.

Configurare il sistema di cromatografia a flusso duo secondo lo schema mostrato di seguito. Assicurarsi che siano disponibili volumi adeguati di tampone per l'intero protocollo e che i tubi continuino a rimanere sommersi. Collegare a piombo la valvola di caricamento del campione e il circuito dinamico del campione come illustrato qui, collegare il circuito del campione all'ingresso della valvola del campione in posizione tre.

Preparare otto coppie di dimensioni identiche di un tubo di picco con diametro esterno di 16 pollici. Quindi collegare le coppie alle posizioni da uno a otto delle due valvole di selezione della colonna. Dopo aver acceso il rivelatore UV lamps e aver confermato che tutti i rivelatori sono calibrati, collegare la valvola di divisione del flusso del collettore di frazioni e il controller del divisore di frazione come illustrato. Qui.

La valvola splitter del collettore di frazioni di posizione due e il controller splitter vengono azionati offline dalla stazione di lavoro cromatografica. Imposta la percentuale di divisione su 10. Sostituire la testina di caduta del collettore di frazioni standard sul collettore di frazioni di posizione due con una testa di caduta per micropiastre.

Sciacquare il circuito del campione e lavare il sistema cromatografico. Quindi avviare un flusso manuale di un millilitro al minuto di tampone di evoluzione attraverso il sistema. Collegare le colonne HI con scaricatore alto un millilitro alle posizioni da due a otto delle valvole di selezione della colonna.

Rimuovere il raccordo che collega la posizione a due valvole di selezione a colonna. Collegare i raccordi della colonna a monte al flusso duo. Far passare il tampone eluciano attraverso i raccordi fino a quando tutta l'aria non viene espulsa ed è presente una grande goccia di tampone.

Quindi, rimuovere il tappo collegato all'ingresso della colonna e posizionare una grossa goccia di tampone a basso contenuto di sale sulla parte superiore della colonna. Fissare quindi la colonna ai raccordi a monte. Collegare l'uscita ai raccordi della colonna a valle e al tubo della valvola di selezione.

Impostare il limite di contropressione a 40 CV. Lavo la colonna con cinque volumi di colonna. Tampone di evoluzione a una velocità di flusso di un millilitro al minuto. Lavare la colonna con 10 volumi di tampone di avviamento a una velocità di flusso di un millilitro al minuto.

Una volta stabilizzati il pH, i tracciati UV e la contropressione, commutare manualmente le valvole di selezione della colonna in posizione uno e arrestare il flusso tampone. Per caricare un campione, immergere il tubo di ingresso del campione nel campione da 20 millilitri. Quindi commutare la valvola di lavaggio del carico del circuito del campione in posizione uno e la valvola di caricamento del campione in spurgo.

Avviare l'azione della pompa di caricamento del circuito del campione, aspirando il campione nel tubo della pompa a una portata di un millilitro al minuto fino a quando il campione non raggiunge la valvola di caricamento del campione. Commutare la valvola di caricamento del campione da spurgo a carico. Riavviare la pompa di caricamento del circuito di campionamento a una portata di un millilitro al minuto fino a quando non sono stati aspirati 10 millilitri di campione nel ciclo dinamico del campione dalla finestra di configurazione del software biologico.

Selezionare i dispositivi di sistema contrassegnati da un asterisco in questa tabella. Quindi, selezionare sei colonne HIC per il programma di analisi. Un gradiente salino discendente lineare e un metodo di esplorazione a sei colonne avviano manualmente il flusso del tampone iniziale a un millilitro al minuto.

Premere start sul controller splitter per avviare la suddivisione del flusso EIT dal 90% al 10% subito dopo aver avviato l'esecuzione del metodo del programma, premere start sul pannello di controllo sullo schermo del collettore di frazioni di piastre a 96 pozzetti offline. Osservare il display in tempo reale per confermare i parametri di esecuzione previsti. Confrontare il tracciato di assorbanza a 397 nanometri specifico per GFP con il tracciato di assorbanza generale a 280 nanometri per stimare la separazione e la purificazione relative utilizzando i diversi mezzi HI esplorati aliquote da cinque a 50 microlitri dalle frazioni di piastra a 96 pozzetti possono essere trasferite su una piastra fresca e saggiare il contenuto proteico specifico mediante Eliza o Western blot e il contenuto proteico totale utilizzando la pagina SDS o un sistema di elettroforesi microfluidica Experian rappresentativo del sale hick La conducibilità del gradiente e la pressione della colonna delle corse di ricognizione sono mostrate qui.

La variazione della concentrazione di sale, misurata dalla percentuale di tampone prelevata da linee tampone ad alto contenuto di sale, è tipica della metodologia HI. Man mano che la concentrazione di sale diminuisce la conducibilità delle proteine legate alla colonna di eluizione, che corrisponde a quella osservata, la concentrazione di sale viene misurata in linea immediatamente dopo i rivelatori quad tech e UV. L'offset tra i tracciati del gradiente salino e della conducibilità indica il tempo necessario affinché il tampone viaggi dall'ingresso del tampone attraverso il sistema e al monitor di conducibilità.

Durante l'esecuzione del campione, la pressione del sistema e il pH rimangono relativamente costanti. Questa figura mostra i cromatogrammi della colonna HI sequenziale che esegue la rilevazione in linea della proteina totale. L'NGFP si ottiene misurando l'assorbanza della luce rispettivamente a 280 nanometri e 397 nanometri.

È possibile approssimare l'abbondanza e la separazione relativa della GFP per ogni corsa di esplorazione. Confrontando le due linee in questa figura i tubi di coltura per le frazioni, 10, 12, 14, 16 e 18 della corsa di scouting FF del finocchio sono stati visualizzati sotto la luce ambientale o fluorescente della stanza e i tubi di luce ultravioletta sono stati visti sia in avanti che dall'alto verso il basso per osservare lo spettro di emissione caratteristico della GFP, la GFP è chiaramente rilevata nella frazione 14. In entrambe le immagini UV, il blu diffuso nel pannello UV sinistro è la luce emessa dalla lampada UV.

Questi dati post-corsa corrispondono bene con il rilevamento in linea della GFP misurando l'assorbanza eluida a 397 nanometri, che identifica anche la frazione 14 come contenente il picco maggiore della GFP allusa. Seguendo questa procedura. Altri metodi come il western blotting, la microscopia a forza atomica e i saggi di ricostituzione biochimica possono essere eseguiti per rispondere a ulteriori domande relative alla purezza e all'attività funzionale della proteina da purificare.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare la necessità di un controllo manuale del sistema a doppio flusso in diversi punti del metodo. Gli esempi includono il riempimento del tampone e il caricamento del campione, il controllo della presenza di bolle d'aria e l'accensione e lo spegnimento delle lampade di rilevamento, se necessario. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come utilizzare un sistema di cromatografia liquida per condurre lo scouting automatizzato per colonne e terreni HI ottimali.

L'analisi in linea e poster, valutata consentirà a un ricercatore di selezionare una colonna adatta per la successiva purificazione su scale-up, che può anche essere combinata con altri metodi cromatografici per aumentare la purezza e la resa delle proteine target.