Name: Purificazione di Native Complessi di studio strutturale utilizzando un metodo Tag Tandem Affinity (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 36 s
Description: Scopri il metodo TAP per purificare complessi macromolecolari nativi da estratti cellulari di S. cerevisiae. Questo protocollo garantisce omogeneità composizionale e qualità strutturale per studi biofisici.

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Gli autori sono grati per il supporto e i consigli di Nikolaus Grigorieff. Ringraziamo Anna Loveland, Axel Brilot, Chen Xu e Mike Rigney per le utili discussioni e le indicazioni EM. Questo lavoro è stato finanziato dalla National Science Foundation, Premio n. 1157892. La struttura EM di Brandeis è supportata dalla sovvenzione P01 GM62580 del National Institutes of Health.

Nota: Il seguente protocollo è stato ideato per la purificazione di un complesso da 4 L di coltura cellulare, a circa 40 g di peso umido di cellule. Una volta preparato, tutti i buffer devono essere conservati a 4 ° C ed utilizzati entro un mese della loro preparazione. Ridurre gli inibitori della proteasi e agenti vengono aggiunti ai buffer appena prima dell&#39;uso. 1. Preparazione di tutta la cella estratto per Tandem Affinity Purification <ol><li> La crescita di S. cellule cerevisiae <ol><li> Streak TAP desiderata contrassegnata S. ceppo cerevisiae da stoccaggio (-80 ° C) su un destrosio lievito peptone (YPD) piatto. Incubare per 3 - 5 giorni (30 ° C), fino a quando le cellule di lievito appaiono bianchi e soffici. </li><li> Seminare una striscia di circa 2 mm 2 delle cellule fresche dalla piastra in 10 ml supporti YPD in 50 ml conica in polipropilene provetta da centrifuga. Agitare la provetta a 180 giri al minuto (rpm) per una notte (30m ° C). </li><li> Seminare 2 ml di sopracultura notte per litro di supporti YPD in 2 L Erlenmeyer o beuta. Agitare a 180 rpm (30 ° C). Monitorare la crescita delle cellule ad una densità ottica a 600 nm (OD 600) fino fase logaritmica tardiva, OD 600 di 1,8 a 2, tipicamente 20 - 24 ore. </li></ol></li><li> Raccolta S. cellule cerevisiae <ol><li> Celle di raccolta per centrifugazione a 5.400 xg per 15 minuti (4 ° C). </li><li> decantare rapidamente il supernatante e mantenere le cellule a 4 ° C o su ghiaccio. </li><li> Sospendere ogni litro di pellet con 2 ml refrigerati Lysis Buffer (10 mM Tris-HCl, pH 8,0; 300 mM NaCl; 10 mM KCl, 0,2 mM EDTA, pH 8,0; 5 mM imidazolo, pH 8,0; 10% glicerolo; 0,1% v / v NP-40). Sospendere le cellule da vorticoso e / o ripetere pipettaggio utilizzando una pipetta 10 ml sierologico. Nota: L&#39;importanza di NP-40 in quanto riguarda la qualità e la complessa analisi post-purificazione è discusso qui di seguito. </li><li> Trasferire la sospensione cellulare in un vuoto da 50 ml conica in polipropilene tubo da centrifuga kEPT sul ghiaccio. Lavare ogni bottiglia centrifuga con ulteriori 2 ml di tampone di lisi e raffreddato aggiungere alla sospensione cellulare nel tubo 50 ml. </li><li> Determinare il peso umido del pellet cellulare pesando il tubo e sottraendo il peso del tubo vuoto, nonche la aggiunto Lysis Buffer. Nota: Un litro di coltura cellulare avente un diametro esterno 600 di 1,8 è di circa 10 g. </li><li> Creare un bagno di azoto liquido in un 50 ml provetta da centrifuga conica polipropilene. Disegnare cellule sospese in una siringa da 5 ml. Collegare un ago 16 G alla siringa. Bloccare la sospensione cellulare facendolo passare attraverso la siringa / ago per generare cellule &quot;goccioline&quot;. Tasso di congelamento dovrebbe essere di circa 1 min / ml. </li><li> Conservare le goccioline di cellule congelate (-80 ° C) o procedere alla lisi. </li></ol></li><li> Lisi Cellule e lisato Chiarimento <ol><li> Lyse le cellule di lievito con un macinino da caffè. cellule Lisare otto a nove volte con 25 secondi di rettifica scoppi, mentre agitando il csmerigliatrice Offee. Prima dell&#39;uso, pre-raffreddare il macinacaffè con azoto liquido. Ogni due turni di rettifica, aggiungere uno strato superficiale di azoto liquido per il macinino e lasciare evaporare. </li><li> Mescolare con una spatola di azoto liquido refrigerato come necessario per mantenere le cellule di aggregazione. Fare attenzione per evitare lo scongelamento delle cellule, che può risultare in aggregazione delle cellule. Le cellule dovrebbero apparire come una polvere bianca dopo lisi. Un pellet massima cellulare da 4 L di coltura di lievito (~ 40 g) può essere terra alla volta. Nota: Osservazioni sul metodo di lisi sono discussi di seguito. </li><li> Valutare il grado di lisi delle cellule utilizzando un emocitometro o metodo di conteggio delle cellule alternativo. Per fornire un&#39;adeguata analisi, prendere i seguenti esempi: (1) prima di lisi; (2) dopo quattro turni di lisi; e (3) dopo lisi. Per controllare questi campioni, prendere una piccola quantità di cellule con una spatola di azoto raffreddato liquido e posto in una provetta da 1,5 ml. </li><li> Una volta che le cellule sono scongelati, pipetta da 5 ml di cellulee mescolare con 495 ml di acqua. Se 40 - si osserva il 60% lisi delle cellule, procedere al passo successivo nel protocollo. Nota: Osservazioni sul effetto di lunghi periodi di lisi sono discussi di seguito. </li><li> Una volta adeguata lisi si osserva, negozio lisate cellule (-80 ° C) o passare alla fase successiva. </li><li> Preparare due provette da 50 ml per centrifuga conica polipropilene ciascuna con 15 ml tampone di lisi, tra 1 mM phenylmethanesulfonyl fluoruro (PMSF), 1 mM ditiotreitolo (DTT), e un cocktail disponibile in commercio di inibitori delle proteasi. Nota: Se si osserva proteolisi significativo, considerare l&#39;uso di una proteasi ceppo carente. </li><li> Utilizzare una spatola di azoto liquido refrigerato per raccogliere la polvere delle cellule lisato congelato nei preparati provette da 50 ml. Aggiungere la polvere di cellule / solido incrementale al Lysis Buffer, contenente sia un riducente e inibitore della proteasi (s). </li><li> Ruotare i tubi 50 ml dolcemente RT modo da scongelare / sciogliere le cellule, ma anche per prevenire la formazione di bolle. UNs la polvere di cellule / dissolve solidi, aggiungere delle cellule ulteriore solido / polvere. </li><li> Riempire ciascuno dei due tubi 50 ml fino ognuno ha circa 20 g di cellule o di tutte le cellule aggiunti. Continuare scongelamento / dissoluzione fino a quando non ci sono grumi di cellule congelate osservati nei tubi da 50 ml. Questo dovrebbe durare circa 50 minuti. </li><li> Centrifugare il lisato cellulare sospeso per 20 minuti a 25.000 xg (4 ° C). cellule ben lisate possono presentare una piccola quantità di precipitato nero. </li><li> Trasferire i 50 ml di surnatante in policarbonato tubi ultra-centrifuga (26.3 ml tubi usati) e aggiungere 10 ml 200 mm PMSF ad ogni provetta piena. </li><li> Centrifuga per 1 ora a 100.000 xg (4 ° C). Quattro strati devono essere visibili, dal basso verso l&#39;alto: (1) un disco chiaro pellet, contenente complessi ribosomiale; (2) una morbida pallina ricchi di lipidi; (3) un grande livello giallastra trasparente contenente più di proteine ​​e complessi solubili della cellula; e (4) uno strato superiore &#39;squamosa&#39; costituito da lipidi. </li><li> Eseguire tutte le spassi ubsequent in una stanza fredda (4 ° C). Rimuovere la maggior quantità di alto strato lipidico &#39;squamosa&#39; possibile, utilizzando una pipetta 1 ml e scartare. Utilizzare una pipetta ml sierologico 10 di recuperare la maggior parte del colore giallo, strato trasparente. </li><li> Recuperare gli ultimi ml di questo strato con una pipetta 1 ml per evitare di disturbare i due strati inferiori. Da 40 g pellet cellulare bagnato, circa 48 ml di strato centrale è in genere recuperati e 8 ml di strato lipidico rimossi / scartati. Nota: flusso purificazione colonna è fortemente ostacolato dalla presenza di lipidi, che può anche ridurre la qualità del complesso, discusso sotto. </li></ol></li></ol> 2. Purificazione passo Colonna 1: IgG cromatografia <ol><li> Resina Equilibration e rilegatura <ol><li> Preparare una 300 ml IgG Sepharose liquami per 40 g di pellet. Tagliare l&#39;estremità di una punta pipetta 1 ml per facilitare il pipettaggio il liquame. Lavare / equilibrare la resina IgG tre volte, ogni volta con 5 ml IgGD150 Buffer (10 mM Tris-HCl, pH 8,0; 150 mM NaCl; 150 mM KCl, 1 mM MgCl 2, 5 mM imidazolo, pH 8; 0,1% v / v NP-40, 1 mM DTT, una tavoletta inibitore della proteasi per 50 Volume ml). <ol><li> Spin a pellet a 160 g (4 ° C) tra i lavaggi e rimuovere il surnatante. </li></ol></li><li> Ruotare la resina IgG con il surnatante fase intermedia e due mini compresse inibitore della proteasi per 40 g di cellule, utilizzando un rotatore appropriata, per 2 ore (4 ° C). Questa è la soluzione lotto IgG. </li><li> Preparare due 10 ml colonne poli-prep uso tagliando la fine della colonna per produrre un taglio piatto. Per accelerare l&#39;imballaggio e lavaggio della colonna mediante flusso per gravità, caricare un massimo di 200 ml di resina IgG imballato o ~ 25 ml della soluzione di lotto IgG per 10 ml di colonna. </li><li> Versare la soluzione lotto IgG nella colonna e lasciar sedimentare per gravità. Se sedimentazione richiede più di 30 minuti, non più probabile era contaminazione lipidico quando recuperare la fase centrale dalla centrifuga tUBE. </li><li> Lavare la colonna imballato con quattro successive 10 ml volumi di IgGD150 tampone. </li></ol></li><li> Sulla colonna di fenditura TEV <ol><li> Sigillare la parte inferiore della colonna e aggiungere 1 ml di IgGD150 tampone e 100 ml di TEV proteasi (0,6 mg / ml magazzino, mutante variante S219V di TEV prodotto in-house). Sigillare la parte superiore della colonna e miscelare per 20 min (18 ° C) utilizzando un miscelatore termico, agitando a 750 rpm. resina Risospendere e mescolare ancora per 20 minuti, ripetere una volta di più, per un totale di 1 ora di incubazione. Nota: E &#39;fondamentale per mantenere il tempo di incubazione al minimo. </li><li> Riportare la colonna 4 ° C ed eluire la proteina / complesso per gravità. Eluire il volume morto con altri 200 ml di IgGD150 tampone. </li></ol></li></ol> 3. colonna di purificazione Fase 2: Calmodulina affinità e cromatografia <ol><li> Resina Equilibration e rilegatura <ol><li> Preparare 200 ml di resina di affinità Calmodulina per 40 g di cellulepellet. Lavare la resina tre volte, ogni volta con 5 ml Calmodulin Binding Buffer (10 mM Tris-HCl, pH 8,0; 150 mM NaCl; 10 mM KCl, 1 mM MgCl 2, 5 mM imidazolo, pH 8; 2 mM CaCl 2; 0,1 % v / v NP-40; 10 mM β-mercaptoetanolo), centrifugazione a 160 xg (4 ° C) a pellet per ogni lavaggio. </li><li> Per ogni eluato 1 ml IgG, aggiungere 3 volumi di Calmodulina Binding Buffer. Per mantenere il livello di calcio costante, aggiungono CaCl 2 e β-mercaptoetanolo per spiegare la mancanza di tali componenti, l&#39;eluizione IgG. Le concentrazioni finali dovrebbero essere di 2 mm CaCl 2 e 10 mm β-mercaptoetanolo. </li><li> Aggiungere il campione alla resina Calmodulin e legarsi per 1 ora (4 ° C) usando un rotatore tubo. </li></ol></li><li> Imballaggio ed eluendo da Calmodulina Resina <ol><li> Preparare una colonna poli-prep 2 ml per 100 microlitri slurry Calmodulin tagliando la fine della colonna per creare un&#39;apertura piatta. Caricare non più di 100 ml Calmodulina liquami per colonna per minimizzare la quantità di resina campione viene a contatto con durante l&#39;eluizione. </li><li> Riempire la colonna per gravità e lavare la resina nella colonna tre volte con 5 ml Calmodulin Binding Buffer. </li><li> Eluire proteina con aggiunta di 200 microlitri Calmodulina tampone di eluizione (10 mM Tris-HCl, pH 8,0; 150 mM NaCl; 10 mM KCl, 1 mM MgCl 2, 5 mM imidazolo, pH 8,0; 4 mM EGTA, pH 8,0; 0,08% v / v NP-40; 10 mM β-mercaptoetanolo). Ripetere sei volte l&#39;aggiunta di 200 ml di tampone di eluizione calmodulina. </li><li> Per eluizioni 1 a 3, applicare il volume della colonna e raccogliere immediatamente l&#39;eluato. Per eluizione 4, sigillare il fondo della colonna e incubare con tampone di eluizione per 2,5 minuti e poi unseal e si eluisce per gravità. Per eluizione 5, incubare per 5 minuti e poi rimuovere il sealing ed eluire. Per eluizione 6, incubare per 10 minuti e poi rimuovere il sealing ed eluire. Nota: L&#39;integrità del complesso può variare tra eluizioni / frazioni (vedere la sezione rappresentativa risultati) &lt;./ Li&gt; <li> Dializzare eluizioni 2 a 6 singolarmente notte utilizzando un metodo di dialisi micro appropriata. Dializzare frazioni contro Dialysis tampone (10 mM Tris-HCl, pH 8,0; 150 mM NaCl; 10 mM KCl, 1 mM MgCl 2, 5 mM imidazolo, pH 8; 10 mM β-mercaptoetanolo). Nota: NP-40 non passa sensibilmente, se non del tutto, attraverso la membrana di dialisi. </li></ol></li></ol> 4. Le analisi post-depurazione per valutare la qualità Complex <ol><li> Native Gel e argento colorazione <ol><li> Preparare un 4 - gel nativo prefabbricati 16% per l&#39;analisi del complesso secondo le istruzioni del produttore. Utilizzare un apposito standard di proteine ​​di peso molecolare e carico 15 ml di ciascuna delle Calmodulina eluizione / frazioni dializzati sul gel. </li><li> Elettroforesi il gel a 150 V per circa 3 ore (4 ° C). </li><li> Argento macchia il gel per valutare la qualità di ciascuna delle sei eluizioni. In alternativa, utilizzare commerciale ugualmente sensibilimacchia fluorescente (s). In questa fase, la concentrazione del complesso è più probabile di sotto del livello di rilevamento per Coomassie blue colorazione. </li></ol></li><li> Ulteriori Gel Metodi di analisi <ol><li> Per rilevare la proteina mediante Western blotting, risolvere il complesso da SDS o PAGE nativo e quindi sondare il gel per l&#39;epitopo Calmodulina Binding Peptide (CBP) utilizzando un anticorpo tag TAP secondo le istruzioni del produttore. </li><li> Utilizzando un colorante fluorescente specifico (s), confermare la presenza e l&#39;integrità delle proteine ​​e / o acido nucleico in un complesso di rubinetto depurata. Fare attenzione che non viene rilevato alcun sovrapposizione spettrale tra queste macchie. </li></ol></li><li> Negativo visualizzazione Stain Electron Microscopy <ol><li> Utilizzare le griglie di carbonio continue glow-scaricata a -15 mA per 30 secondi, in 30 minuti di applicazione complessa. </li><li> Applicare 3 ml di TAP purificato complesso (tipicamente ad una concentrazione di 1 nM) alla griglia. Incubare per un minuto. blot fROM lato della griglia per rimuovere l&#39;eccesso di buffer. </li><li> Lavare due volte con 20 gocce microlitri di acqua deionizzata. macchia laterale tra un lavaggio. </li><li> Applicare griglia per un 50 microlitri negativo goccia macchia e incubare per un min. Si raccomanda di colorazione con acetato di uranile (2%) o uranile formiato (0,75%). Attenzione: sali e soluzioni di uranile sono debolmente radioattivo e contengono metalli pesanti. Questi dovrebbero essere maneggiati con cura e tutto il materiale che entra in contatto con queste soluzioni devono essere smaltiti secondo le linee guida consigliate rifiuti istituzionali. </li><li> Applicare griglia per un fresco 50 ml goccia macchia negative, senza assorbente. Incubare per un minuto, poi il lato macchia, e infine asciugare all&#39;aria e visualizzare. </li></ol></li><li> Cryo Microscopia Elettronica (crio-EM) Visualizzazione <ol><li> Eseguire crio-EM con TAP purificato complesso, anche se l&#39;ottimizzazione può essere necessario, secondo il protocollo del produttore. Nota: Presenza di detersivo a concentrazioni alte may impedire il progresso e è discusso qui di seguito. </li></ol></li></ol> 5. stoccaggio Complex <ol><li> Preparazione complesso per bagagli <ol><li> Concentrare il complesso, se necessario, utilizzando un filtro centrifugo avente un peso molecolare di cut-off appropriato per il complesso. Spin a 14000 g per incrementi di 1 min fino a raggiungere la concentrazione desiderata. Nota: concentrazione NP-40 aumenterà in concentrazione durante concentrazione, in quanto non passa attraverso la membrana del filtro nè dialisi. </li><li> Flash congelare il complesso in 30 aliquote microlitri in azoto liquido o ghiaccio secco raffreddato bagno di etanolo e poi conservare a -80 ° C. </li></ol></li><li> La rimozione post-purificazione opzionale di detersivo </li></ol> Nota: La presenza di un detergente tipo NP-40 e ad una concentrazione superiore a quella della sua concentrazione critica micellare può ostacolare o inibire il progresso per alcune applicazioni. Le conseguenze della sua rimozione dal protoCol così come la sostituzione con altri additivi o co-solventi sono discussi di seguito. Se nessun NP-40 è desiderato, una possibilità è quella di utilizzare una applicazione commerciale per la rimozione, ad esempio Bio-perline. <ol style="margin-left: 40px;"><li> Pre-equilibrare disponibili in commercio detergenti assorbire perline in Dialisi buffer. Mescolare cinque perle per 30 ml di complesso (di solito a 10 concentrazioni nM). </li><li> Incubare perline equilibrate dal punto 5.2.1 con TAP complesso purificato per 15 min in ghiaccio. Utilizzare complesso entro poche ore dalla rimozione di detersivo. </li></ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Il metodo TAP utilizza due tag che bilanciano la necessità di rigorosa e selettiva legame con una resina di affinità con un desiderio di mantenere vicino a condizioni di soluzioni fisiologiche. Questo equilibrio serve a preservare l&#39;interazione stabile (s) della proteina tag con l&#39;interazione dei fattori (s) per la caratterizzazione post-purificazione. Inoltre, TAP individuo etichettato ORF sono disponibili da una fonte commerciale, in modo che si può ottenere qualsiasi ceppo di lievito con una proteina codifica...

Molti importanti processi cellulari sono svolte da grande proteina e proteina-RNA complessi 1. Un collo di bottiglia di eseguire studi biofisici e strutturali tali complessi loro è ottenere una adeguata qualità (cioè, l&#39;omogeneità) e ad una idonea concentrazione. Isolare un complesso da una fonte nativa ha molti vantaggi, tra cui trattenere rilevanti modificazioni post-trascrizionali e / o traslazione di subunità e assicurare il corretto assemblaggio complesso. Tuttavia, grandi complessi cellulari sono spesso presenti in una cellula ad un basso numero di copia e la purificazione devono essere altamente efficiente e verificarsi in condizioni fisiologiche vicino per assicurare l&#39;integrità complesso è mantenuta. Purificare un complesso da una fonte eucariotica è particolarmente impegnativo e può essere finanziariamente proibitivo. Così, le strategie o metodi che siano efficienti e producono un complesso omogeneo sono altamente desiderata. Una strategia che è statasuccesso nel purificare complessi nativi di cellule eucariotiche per la loro caratterizzazione iniziale è il metodo Tandem Affinity Purification (TAP) 2,3. Il metodo TAP è stato inizialmente concepito per purificare una proteina nativa dal lievito in erba (S. cerevisiae) in complesso con l&#39;interazione fattore (s) 2. Il metodo utilizzato TAP due tag, ogni tag fusa in tandem per la stessa sequenza del gene della proteina-codifica. I tag sono stati selezionati in modo da bilanciare la necessità di rigorosa e selettiva legame una resina di affinità con un desiderio di mantenere condizioni quasi soluzione fisiologica. Questo equilibrio serve a preservare l&#39;interazione stabile (s) della proteina tag con l&#39;interazione dei fattori (s) per la caratterizzazione post-purificazione. Il tag TAP genomicamente incorporata è stata posta alla fine (C-terminale) di un gene codificante e consisteva di una sequenza codificante per un Calmodulin Binding Peptide (CBP) seguita da Protein A - un&#39;aggiunta di poco più di 20 kDa la targhetta proteina. CBP è breve, 26 amminoacidi, e riconosciuti dal ~ 17 kDa proteina calmodulina (CaM) in presenza di calcio con una K D dell&#39;ordine di 10 -9 M 4. Il tag Proteina A è maggiore, costituito da due ripetizioni di 58 residui con una breve linker tra le ripetizioni. Ogni ripetizione acid 58 amino è riconosciuto da immunoglobulina G (IgG) con K D ~ 10 -8 M 5. Tra questi due tag è stato incorporato un sito di riconoscimento per il TEV proteasi, un endopeptidasi dal virus Tobacco Etch 6,7. Come illustrato in figura 1, nella prima fase affinità del metodo TAP etichettato proteina è fissata su una resina IgG tramite la proteina A. La proteina marcata è eluito su colonna di scissione dopo l&#39;aggiunta del TEV proteasi, sito-specifica tra cleaving i due tag. Questo è un passo necessario come l&#39;interazione di IgG e proteina A è molto forte e solo può essere adeguatamente perturbata in condizioni denaturanti soluzione. In mancanza di un Protein Un tag, la proteina si lega alla resina CaM in presenza di calcio e eluita da questa resina con aggiunta di EGTA ione metallico chelante (acido tetraacetico etilenglicole) (Figura 1). Subito dopo l&#39;introduzione del metodo TAP, è stato utilizzato in uno studio su larga scala per generare un &#39;map&#39; di interazioni complesse S. cerevisiae 8. È importante sottolineare che, come conseguenza di questo sforzo un intero telaio di lievito-TAP Tagged Open Reading (ORF) biblioteca, così come TAP individuo etichettato ORF 9 sono disponibili da una fonte commerciale. Così, si può ottenere un ceppo di lievito con una proteina codificata per qualsiasi complesso lievito. Il metodo TAP anche stimolato modifiche o varianti del tag TAP, tra cui: il suo utilizzo per la purificazione di complessi provenienti da altri eucariotica così come le cellule batteriche 10,11; la progettazione di un &quot;tag raggruppati&quot;, in cui la proteina A e CBP sono posti su differenti proteine ​​12; e la tags cambiato, in modo da accogliere la necessità del ricercatore, come la sensibilità del complesso Ca 2+ o EGTA 13. I recenti progressi sia in strumentazione e metodologie hanno portato a progressi significativi nell&#39;applicazione di microscopia elettronica (EM) per la determinazione della struttura, che hanno portato in alto, nei pressi di immagini atomiche risoluzione di complessi macromolecolari 14. La risoluzione ottenibile di un complesso di EM, tuttavia, resta subordinata alla qualità del complesso in esame. Questo studio ha utilizzato l&#39;approccio tag TAP per purificare da S. cerevisiae U1 snRNP, un 18-subunità (~ 0,8 MDA) a basso numero di copie complesso ribonucleoproteico che fa parte del spliceosome 15,16. Un certo numero di passi sono stati compiuti per purificare questo complesso tale che è omogenea e di una concentrazione adeguata. Potenziali problemi riscontrati nelle varie fasi della purificazione sono descritti e strategie adottate per superare challEnges evidenziati. Valutando con attenzione e ottimizzando passi nella purificazione, l&#39;U1 snRNP purificato è di una qualità e ad un quantitativo adatto per macchia negativa e (crio-EM) studi di elettroni crio microscopia. Un metodo ottimizzato protocollo TAP per la purificazione di complessi native per studi strutturali è descritta nel presente documento.

<table><tbody><tr><td>Ceppo marcato TAP di S. cerevisiae</td><td>Open Biosystems</td><td>YSC1177</td><td>Questo è il ceppo di lievito primario utilizzato per sviluppare il protocollo TAP. Il suo sfondo è S288C: ATCC 201388: MATa, his3&Delta; 1, leu2&Delta; 0, met15&Delta; 0, ura3&Delta; 0, SNU71::TAP::HIS3MX6</td></tr><tr><td>Macinacaffè</td><td>Mr. Coffee</td><td>IDS77</td><td>Utilizzato per l'emocitometro per lisi cellulare</td></tr><tr><td>, Bright Line</td><td>Hausser Scientific</td><td>3120</td><td>Utilizzato per valutare la lisi cellulare</td></tr><tr><td>JA 9.100 rotore centrifuga&nbsp;</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td></td><td>Utilizzato per raccogliere le cellule di lievito</td></tr><tr><td>JA 20 rotore centrifugo ad angolo fisso</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td></td><td>Utilizzato per eliminare l'estratto cellulare dal materiale cellulare non solubile</td></tr><tr><td>Ti 60 rotore per centrifuga ad angolo fisso</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td></td><td>Utilizzato per eliminare ulteriormente l'estratto cellulare solubile</td></tr><tr><td>Thermomixer</td><td>Eppendorf</td><td>R5355</td><td>Agitatore a temperatura controllata</td></tr><tr><td>Sistema gel Novex</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Resina IgG</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0969-01</td><td>Sepharose 6</td></tr><tr><td>resina di Calmodulina</td> a flusso rapido <td>Agilent Technologies, Inc.</td><td>214303</td><td>Resina di affinità</td></tr><tr><td>Cocktail di inibitori della proteasi, mini compresse</td><td>Sigma Aldrich</td><td>589297</td><td>Mini cOmplete ultra EDTA-free compresse</td></tr><tr><td>Cocktail di inibitori della proteasi, compresse grandi</td><td>Sigma Aldrich</td><td>5892953</td><td>cOmplete ultra EDTA-free compresse</td></tr><tr><td>Fenilmetanosulfonile fluoruro (PMSF)</td><td></td><td></td><td>Disciolto in isopropanolo</td></tr><tr><td>2 ml Colonna Bio-spin</td><td>Bio-Rad Laboratori, Inc.</td><td>7326008</td><td>Utilizzato per imballare e lavare la</td></tr><tr><td>colonna poli-prep da 10 ml</td> in resina Calmodulin <td>Bio-Rad Laboratories, Inc.</td><td>7311550</td><td>Utilizzato per imballare e lavare la resina IgG</td></tr><tr><td>Gel prefabbricati nativi PAGE Bis-Tris</td><td>Life Technologies</td><td>BN1002</td><td>Novex NativePAGE Bis-Tris 4 - Gel prefabbricati di poliacrilammide</td></tr><tr><td>NativeMark standard proteico Thermo</td><td>Fisher Scientific</td><td>LC0725</td><td>Standard proteico non colorato utilizzato per PAGE nativo. Carico 7,5 &mu; l per un gel colorato d'argento e 5 &mu; l per un gel colorato con rubino SYPRO</td></tr><tr><td>Gel prefabbricati SDS PAGE Bis-Tris</td><td>Life Technologies</td><td>NP0321</td><td>Novex Nu-PAGE Bis-Tris 4 - 12% gel prefabbricati di poliacrilammide&nbsp;</td></tr><tr><td>PageRuler proteina standard</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>26614</td><td>Proteina non colorata standard utilizzata per il Western blotting</td></tr><tr><td>SDS tampone di corsa</td><td>Life Technologies</td><td>NP0001</td><td>1x NuPAGE MOPS SDS</td></tr><tr><td>Tampone TAP Anticorpo Thermo</td><td>Fisher Scientific</td><td>CAB1001</td><td>Anticorpo primario contro il tag CBP</td></tr><tr><td>Anticorpo secondario</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31341</td><td>Capra anti-coniglio fosfatasi alcalina coniugata</td></tr><tr><td>BCIP/NBT</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>34042</td><td>5-bromo-4-cloro-3-indolil-fosfato/nitro blu tetrazolio&nbsp;</td></tr><tr><td>Unità di dialaysi</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>88401</td><td>Mini unità di dialisi Slide-A-Lyzer</td></tr><tr><td>Unità di filtraggio centrifughe, 100kDa MWCO</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC5100008</td><td>Unità di filtraggio centrifugo Amicon Ultra-0.5 con membrana Ultracel-100</td></tr><tr><td>Perle assorbenti detergenti</td><td>Bio-Rad Laboratories, Inc.</td><td>1523920</td><td>Bio-bead SM-2 assorbenti</td></tr><tr><td>SYBR Green II</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S-7564</td><td>Colorante fluorescente per la colorazione degli acidi nucleici, quando si rileva con SYPRO Ruby presente, utilizzare una lunghezza d'onda di eccitazione di 488 nm e una lunghezza d'onda di emissione di 532 nm</td></tr><tr><td>SYPRO</td><td>Ruby Molecular Probes</td><td>S-12000</td><td>Colorante fluorescente per la colorazione delle proteine, quando si rileva con SYBR Green II presente, utilizzare una lunghezza d'onda di eccitazione di 457 nm e una lunghezza d'onda di emissione di 670 nm</td></tr><tr><td>Griglie di rame Microscopia</td><td>elettronica Scienze</td><td>G400-CP</td><td></td></tr></tbody></table>

purificazione di native complessi di studio strutturale utilizzando un metodo tag tandem affinity

Purification of Native Complexes for Structural Study Using a Tandem Affinity Tag Method

approcci purificazione per affinità sono riusciti ad isolare complessi native per la caratterizzazione proteomica. eterogeneità strutturale e un grado di eterogeneità composizionale di un complesso di solito non impediscono progressi nel condurre tali studi. Al contrario, un complesso destinato caratterizzazione strutturale deve essere purificato in uno stato che è sia per composizione e strutturalmente omogeneo, nonché ad una maggiore concentrazione di quanto richiesto per proteomica. Recentemente, ci sono stati progressi significativi nell&#39;applicazione di microscopia elettronica per la determinazione della struttura di grandi complessi macromolecolari. Questo ha accresciuto interesse per approcci per purificare complessi nativi di qualità sufficiente e quantità per la determinazione strutturale di microscopia elettronica. Il metodo Tandem Affinity Purification (TAP) è stato ottimizzato per estrarre e purificare un 18-subunità, ~ 0.8 MDa assemblaggio ribonucleoproteico dal lievito in erba (Saccharomyces cerevisiae) </em&gt; adatto a macchia negativa e crioconservati microscopia elettronica. In questo è dettagliato le modifiche apportate al metodo TAP, il razionale per fare questi cambiamenti, e gli approcci adottati per test per un complesso compositivo e strutturalmente omogeneo.

Un metodo TAP modificata è stata usata per purificare da S. cerevisiae U1 snRNP, un complesso ribonucleoproteina 18 subunità. Una purificazione TAP iniziale del complesso seguendo il 2,3 protocollo pubblicato ha prodotto un complesso che è apparso eterogenea, la migrazione di tre bande su un argento macchiate gel di poliacrilammide nativo (Figura 2A). Molteplici cicli di ottimizzazione del metodo TAP, ha prodotto un complesso che migrato principalment...

Il metodo di purificazione per affinità tandem (TAP) è stato ampiamente utilizzato per isolare complessi nativi da estratti cellulari, principalmente eucariotici, per la proteomica. Qui, presentiamo un protocollo del metodo TAP ottimizzato per la purificazione di complessi nativi per studi strutturali.

Purificazione di Native Complessi di studio strutturale utilizzando un metodo Tag Tandem Affinity

Affinity purification approaches have been successful in isolating native complexes for proteomic characterization. Structural heterogeneity and a degree ...

L'obiettivo generale di questo protocollo è purificare un complesso macromolecolare nativo di qualità adeguata per studi biofisici. Questo protocollo rappresenta non solo un metodo per purificare un complesso, ma anche una guida dettagliata per valutarne la qualità strutturale durante il processo di purificazione. Il vantaggio principale di questo protocollo è che consente di purificare un assemblaggio nativo in condizioni di tampone prossime a quelle fisiologiche in modo semplice e rapido, garantendo così un'omogeneità composizionale.Dopo la centrifugazione delle cellule di S.cerevisiae e il decantamento del sopranatante secondo il protocollo descritto nel testo, aggiungere due millilitri di tampone di lisi freddo e agitare delicatamente oppure utilizzare una pipetta sierologica da 10 millilitri per sospendere il pellet. Trasferire la sospensione cellulare in un tubo conico in polipropilene da 50 millilitri vuoto, mantenuto sul ghiaccio. Successivamente, utilizzare altri due millilitri di tampone di lisi freddo per lavare ciascun flacone da centrifuga e aggiungere la soluzione al tubo da 50 millilitri.Dopo aver determinato il peso fresco del pellet cellulare, preparare un bagno di azoto liquido all'interno e intorno a un tubo conico in polipropilene da 50 millilitri. Successivamente, aspirare le cellule sospese in una siringa da cinque millilitri e collegare un ago da 16 gauge alla siringa. Congelare quindi la sospensione cellulare facendola passare attraverso la siringa e l'ago nel bagno a una velocità di circa un millilitro al minuto, in modo da generare goccioline.Per lisare le cellule di lievito, iniziare utilizzando azoto liquido per preraffreddare un macinacaffè. Aggiungere quindi fino a 40 grammi di cellule di lievito e macinare per 25 secondi, ripetendo l'operazione di macinazione da otto a nove volte. Si raccomanda di non purificare più di 10 litri di coltura cellulare in un'unica volta.Questo riduce al minimo il tempo di purificazione e garantisce il mantenimento dell'integrità strutturale del complesso. Dopo ogni due cicli di macinazione, aggiungere uno strato sottile di azoto liquido nel macinatore e lasciarlo evaporare. Per evitare l'aggregazione delle cellule, impedire il loro scongelamento mescolandole con una spatola raffreddata con azoto liquido.Dopo la lisi, le cellule dovrebbero apparire come una polvere bianca finissima. Dopo aver verificato la lisi cellulare e preparato il buffer di lisi con PMSF, DTT e inibitori della proteasi seguendo il protocollo indicato nel testo, utilizzare una spatola raffreddata con azoto liquido per prelevare gradualmente la polvere congelata di cellule lisate e trasferirla nei tubi da 50 millilitri contenenti il buffer preparato. Ad ogni aggiunta, ruotare delicatamente i tubi da 50 millilitri a temperatura ambiente per favorire lo scongelamento e la dissoluzione delle cellule ed evitare la formazione di bolle d'aria.Mentre le cellule si sciolgono, aggiungere ulteriore polvere cellulare. Dopo aver aggiunto tutte le cellule, continuare a scongelare e sciogliere le cellule fino a quando non si osservano grumi cellulari congelati nei tubi. Questo processo dovrebbe richiedere circa 50 minuti.Successivamente, centrifugare il lisato cellulare a 25.000 ×g e 4 °C per 20 minuti. Una volta che le cellule sono state lisate e dopo la centrifugazione, si può osservare un piccolo strato scuro nel pellet insolubile. Trasferire il soprannatante in provette ultracentrifuga in policarbonato e aggiungere 10 microlitri di PMSF 200 millimolare a ciascuna provetta piena.Centrifugare i campioni a 100.000 ×g e a quattro gradi Celsius per un'ora. Al termine della centrifugazione, dovrebbero essere visibili quattro strati: un pellet duro e chiaro contenente principalmente complessi ribosomiali; un pellet morbido ricco di lipidi; uno strato grande, chiaro e con tonalità giallastra che contiene la maggior parte delle proteine e dei complessi solubili della cellula; e uno strato superiore squamoso costituito da lipidi.In una stanza fredda a quattro gradi Celsius, utilizzare una pipetta da un millilitro per rimuovere la maggior parte possibile dello strato lipidico superiore scaglioso e scartarlo. Utilizzare una pipetta sierologica da 10 millilitri per recuperare la maggior parte dello strato giallo chiaro. Quindi, utilizzando una pipetta da un millilitro per evitare di disturbare gli strati inferiori, recuperare gli ultimi millilitri di questo strato.Da 40 grammi di pellet cellulare umido, si ottengono tipicamente circa 48 millilitri del livello intermedio. Dopo aver preparato la sefarosi IgG secondo il protocollo descritto, combinare la resina IgG con il soprannatante della fase intermedia e due compresse di inibitore di proteasi mini per ogni 40 grammi di cellule. Quindi posizionare su un agitatore rotante a quattro gradi Celsius per due ore.Questa è la soluzione batch di IgG. Preparare due colonne Polyprep da 10 millilitri tagliando le estremità delle colonne per ottenere un'apertura piatta. Versare i 24 millilitri di sospensione della pasta di resina IgG o soluzione batch in ciascuna colonna e lasciare sedimentare per gravità.Questo corrisponde a 200 microlitri di resina IgG compatta. Se la sedimentazione richiede più di 30 minuti, la fase intermedia potrebbe essere stata contaminata da lipidi. Al termine della sedimentazione, utilizzare quattro volumi successivi da 10 millilitri di tampone IgG D150 per lavare la colonna compatta.Per eseguire il taglio mediante il proteasi del virus della mosaico del tabacco (TEV) direttamente sulla colonna, sigillare l'estremità inferiore della colonna e aggiungere un millilitro di tampone IgG D150 e 100 microlitri di proteasi TEV. Sigillare l'estremità superiore della colonna e, utilizzando un termoagitatatore a 750 giri al minuto e 18 gradi Celsius, agitare per 20 minuti. Ripesare la resina e agitare nuovamente per 20 minuti.Quindi, risospendere e ripetere il mescolamento di 20 minuti per la terza volta. Riportare la colonna a quattro gradi Celsius e utilizzare la forza di gravità per eluire il complesso proteico. Successivamente, aggiungere 200 microlitri di IgG D150 per eluire il volume morto.Dopo aver preparato la resina a affinità per la calmodulina seguendo il protocollo descritto nel testo, aggiungere il tampone di legame della calmodulina e il campione alla resina, quindi utilizzare un rotatore per tubi per incubare a quattro gradi Celsius per un'ora. Preparare una colonna Polyprep da due millilitri ogni 100 microlitri di sospensione di calmodulina, tagliando l'estremità della colonna per creare un'apertura piana. Il protocollo descrive in dettaglio volumi specifici di tampone e di residenza scelti per mantenere il complesso concentrato e minimizzare il tempo di permanenza sulla resina.Se il volume della coltura viene modificato, si raccomanda di modificare i volumi della resina e del tampone nelle colonne a gravità per compensare tale variazione. Impacchettare la colonna con non più di 100 microlitri di sospensione di calmodulina e, per gravità, utilizzare 5 millilitri di tampone di legame alla calmodulina per lavare la resina tre volte. Utilizzando 200 microlitri di tampone di eluizione della calmodulina, eluire la proteina tre volte.Quindi, sigillare la parte inferiore della colonna e aggiungere 20 microlitri di tampone di eluizione, quindi incubare per 2,5 minuti prima di rimuovere il sigillo e lasciare che la proteina venga eluita per gravità. Sigillare nuovamente la parte inferiore della colonna e aggiungere 200 microlitri di tampone di eluizione, quindi incubare per cinque minuti. Successivamente, rimuovere il sigillo dalla parte inferiore della colonna ed eluire la soluzione.Per la sesta ed ultima eluizione, sigillare la parte inferiore della colonna e incubare con il tampone di eluizione per 10 minuti. Successivamente, rimuovere il sigillo ed effettuare l'eluizione. Eseguire l'analisi post-purificazione e conservare i campioni secondo il protocollo descritto nel testo.Come mostrato qui, una purificazione iniziale TAP del complesso, eseguita seguendo un protocollo pubblicato, ha prodotto un complesso che migrava come tre bande in un gel colorato con argento. Diverse ripetizioni di ottimizzazione del metodo TAP ci hanno permesso di ottenere un complesso che migrava come una singola banda in un gel nativo, indicativo di un'assemblea più omogenea. In accordo con il risultato ottenuto in gel nativo, il test immunoblotting eseguito con un anticorpo TAP diretto contro il complesso purificato secondo il protocollo pubblicato ha rivelato la proteolisi della proteina marcata con il tag TAP, SNU-71.Le modifiche al metodo TAP hanno ridotto in modo significativo la quantità di proteolisi, poiché quasi tutte le 17 proteine del complesso U1 snRNP sono state risolte mediante elettroforesi su gel di poliacrilammide in presenza di SDS e identificate positivamente tramite spettrometria di massa multipla. La microscopia elettronica con contrasto negativo mostra particelle monodisperse ottenute da una purificazione riuscita dopo il primo e il secondo passaggio del metodo TAP. Al contrario, nessuna particella delle dimensioni corrette è osservata quando la purificazione non riesce.La qualità finale del complesso è stata valutata su un tappeto di particelle purificate, mostrato qui, che appaiono monodisperse nell'immagine grezza ottenuta con la colorazione negativa al microscopio elettronico. Inoltre, le medie delle classi delle particelle rivelano caratteristiche distinte che indicano come il campione possa essere adatto allo studio strutturale. Una volta acquisita padronanza, questo protocollo può essere completato in 10-12 ore dal momento della scongelazione della polvere di cellule lisate congelata.Seguendo questo protocollo, è fondamentale assicurarsi che tutte le soluzioni siano prive di proteasi e nucleasi e lavorare rapidamente per prevenire l'aggregazione o la dissociazione del complesso. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe comprendere come purificare un complesso nativo di qualità adeguata per lo studio strutturale, nonché come valutare che ciò sia stato raggiunto.

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