Purificazione di Native Complessi di studio strutturale utilizzando un metodo Tag Tandem Affinity

L'obiettivo generale di questo protocollo è purificare un complesso macromolecolare nativo di qualità adeguata per studi biofisici. Questo protocollo rappresenta non solo un metodo per purificare un complesso, ma anche una guida dettagliata per valutarne la qualità strutturale durante il processo di purificazione. Il vantaggio principale di questo protocollo è che consente di purificare un assemblaggio nativo in condizioni di tampone prossime a quelle fisiologiche in modo semplice e rapido, garantendo così un'omogeneità composizionale.

Dopo la centrifugazione delle cellule di S.cerevisiae e il decantamento del sopranatante secondo il protocollo descritto nel testo, aggiungere due millilitri di tampone di lisi freddo e agitare delicatamente oppure utilizzare una pipetta sierologica da 10 millilitri per sospendere il pellet. Trasferire la sospensione cellulare in un tubo conico in polipropilene da 50 millilitri vuoto, mantenuto sul ghiaccio. Successivamente, utilizzare altri due millilitri di tampone di lisi freddo per lavare ciascun flacone da centrifuga e aggiungere la soluzione al tubo da 50 millilitri.

Dopo aver determinato il peso fresco del pellet cellulare, preparare un bagno di azoto liquido all'interno e intorno a un tubo conico in polipropilene da 50 millilitri. Successivamente, aspirare le cellule sospese in una siringa da cinque millilitri e collegare un ago da 16 gauge alla siringa. Congelare quindi la sospensione cellulare facendola passare attraverso la siringa e l'ago nel bagno a una velocità di circa un millilitro al minuto, in modo da generare goccioline.

Per lisare le cellule di lievito, iniziare utilizzando azoto liquido per preraffreddare un macinacaffè. Aggiungere quindi fino a 40 grammi di cellule di lievito e macinare per 25 secondi, ripetendo l'operazione di macinazione da otto a nove volte. Si raccomanda di non purificare più di 10 litri di coltura cellulare in un'unica volta.

Questo riduce al minimo il tempo di purificazione e garantisce il mantenimento dell'integrità strutturale del complesso. Dopo ogni due cicli di macinazione, aggiungere uno strato sottile di azoto liquido nel macinatore e lasciarlo evaporare. Per evitare l'aggregazione delle cellule, impedire il loro scongelamento mescolandole con una spatola raffreddata con azoto liquido.

Dopo la lisi, le cellule dovrebbero apparire come una polvere bianca finissima. Dopo aver verificato la lisi cellulare e preparato il buffer di lisi con PMSF, DTT e inibitori della proteasi seguendo il protocollo indicato nel testo, utilizzare una spatola raffreddata con azoto liquido per prelevare gradualmente la polvere congelata di cellule lisate e trasferirla nei tubi da 50 millilitri contenenti il buffer preparato. Ad ogni aggiunta, ruotare delicatamente i tubi da 50 millilitri a temperatura ambiente per favorire lo scongelamento e la dissoluzione delle cellule ed evitare la formazione di bolle d'aria.

Mentre le cellule si sciolgono, aggiungere ulteriore polvere cellulare. Dopo aver aggiunto tutte le cellule, continuare a scongelare e sciogliere le cellule fino a quando non si osservano grumi cellulari congelati nei tubi. Questo processo dovrebbe richiedere circa 50 minuti.

Successivamente, centrifugare il lisato cellulare a 25.000 ×g e 4 °C per 20 minuti. Una volta che le cellule sono state lisate e dopo la centrifugazione, si può osservare un piccolo strato scuro nel pellet insolubile. Trasferire il soprannatante in provette ultracentrifuga in policarbonato e aggiungere 10 microlitri di PMSF 200 millimolare a ciascuna provetta piena.

Centrifugare i campioni a 100.000 ×g e a quattro gradi Celsius per un'ora. Al termine della centrifugazione, dovrebbero essere visibili quattro strati: un pellet duro e chiaro contenente principalmente complessi ribosomiali; un pellet morbido ricco di lipidi; uno strato grande, chiaro e con tonalità giallastra che contiene la maggior parte delle proteine e dei complessi solubili della cellula; e uno strato superiore squamoso costituito da lipidi.

In una stanza fredda a quattro gradi Celsius, utilizzare una pipetta da un millilitro per rimuovere la maggior parte possibile dello strato lipidico superiore scaglioso e scartarlo. Utilizzare una pipetta sierologica da 10 millilitri per recuperare la maggior parte dello strato giallo chiaro. Quindi, utilizzando una pipetta da un millilitro per evitare di disturbare gli strati inferiori, recuperare gli ultimi millilitri di questo strato.

Da 40 grammi di pellet cellulare umido, si ottengono tipicamente circa 48 millilitri del livello intermedio. Dopo aver preparato la sefarosi IgG secondo il protocollo descritto, combinare la resina IgG con il soprannatante della fase intermedia e due compresse di inibitore di proteasi mini per ogni 40 grammi di cellule. Quindi posizionare su un agitatore rotante a quattro gradi Celsius per due ore.

Questa è la soluzione batch di IgG. Preparare due colonne Polyprep da 10 millilitri tagliando le estremità delle colonne per ottenere un'apertura piatta. Versare i 24 millilitri di sospensione della pasta di resina IgG o soluzione batch in ciascuna colonna e lasciare sedimentare per gravità.

Questo corrisponde a 200 microlitri di resina IgG compatta. Se la sedimentazione richiede più di 30 minuti, la fase intermedia potrebbe essere stata contaminata da lipidi. Al termine della sedimentazione, utilizzare quattro volumi successivi da 10 millilitri di tampone IgG D150 per lavare la colonna compatta.

Per eseguire il taglio mediante il proteasi del virus della mosaico del tabacco (TEV) direttamente sulla colonna, sigillare l'estremità inferiore della colonna e aggiungere un millilitro di tampone IgG D150 e 100 microlitri di proteasi TEV. Sigillare l'estremità superiore della colonna e, utilizzando un termoagitatatore a 750 giri al minuto e 18 gradi Celsius, agitare per 20 minuti. Ripesare la resina e agitare nuovamente per 20 minuti.

Quindi, risospendere e ripetere il mescolamento di 20 minuti per la terza volta. Riportare la colonna a quattro gradi Celsius e utilizzare la forza di gravità per eluire il complesso proteico. Successivamente, aggiungere 200 microlitri di IgG D150 per eluire il volume morto.

Dopo aver preparato la resina a affinità per la calmodulina seguendo il protocollo descritto nel testo, aggiungere il tampone di legame della calmodulina e il campione alla resina, quindi utilizzare un rotatore per tubi per incubare a quattro gradi Celsius per un'ora. Preparare una colonna Polyprep da due millilitri ogni 100 microlitri di sospensione di calmodulina, tagliando l'estremità della colonna per creare un'apertura piana. Il protocollo descrive in dettaglio volumi specifici di tampone e di residenza scelti per mantenere il complesso concentrato e minimizzare il tempo di permanenza sulla resina.

Se il volume della coltura viene modificato, si raccomanda di modificare i volumi della resina e del tampone nelle colonne a gravità per compensare tale variazione. Impacchettare la colonna con non più di 100 microlitri di sospensione di calmodulina e, per gravità, utilizzare 5 millilitri di tampone di legame alla calmodulina per lavare la resina tre volte. Utilizzando 200 microlitri di tampone di eluizione della calmodulina, eluire la proteina tre volte.

Quindi, sigillare la parte inferiore della colonna e aggiungere 20 microlitri di tampone di eluizione, quindi incubare per 2,5 minuti prima di rimuovere il sigillo e lasciare che la proteina venga eluita per gravità. Sigillare nuovamente la parte inferiore della colonna e aggiungere 200 microlitri di tampone di eluizione, quindi incubare per cinque minuti. Successivamente, rimuovere il sigillo dalla parte inferiore della colonna ed eluire la soluzione.

Per la sesta ed ultima eluizione, sigillare la parte inferiore della colonna e incubare con il tampone di eluizione per 10 minuti. Successivamente, rimuovere il sigillo ed effettuare l'eluizione. Eseguire l'analisi post-purificazione e conservare i campioni secondo il protocollo descritto nel testo.

Come mostrato qui, una purificazione iniziale TAP del complesso, eseguita seguendo un protocollo pubblicato, ha prodotto un complesso che migrava come tre bande in un gel colorato con argento. Diverse ripetizioni di ottimizzazione del metodo TAP ci hanno permesso di ottenere un complesso che migrava come una singola banda in un gel nativo, indicativo di un'assemblea più omogenea. In accordo con il risultato ottenuto in gel nativo, il test immunoblotting eseguito con un anticorpo TAP diretto contro il complesso purificato secondo il protocollo pubblicato ha rivelato la proteolisi della proteina marcata con il tag TAP, SNU-71.

Le modifiche al metodo TAP hanno ridotto in modo significativo la quantità di proteolisi, poiché quasi tutte le 17 proteine del complesso U1 snRNP sono state risolte mediante elettroforesi su gel di poliacrilammide in presenza di SDS e identificate positivamente tramite spettrometria di massa multipla. La microscopia elettronica con contrasto negativo mostra particelle monodisperse ottenute da una purificazione riuscita dopo il primo e il secondo passaggio del metodo TAP. Al contrario, nessuna particella delle dimensioni corrette è osservata quando la purificazione non riesce.

La qualità finale del complesso è stata valutata su un tappeto di particelle purificate, mostrato qui, che appaiono monodisperse nell'immagine grezza ottenuta con la colorazione negativa al microscopio elettronico. Inoltre, le medie delle classi delle particelle rivelano caratteristiche distinte che indicano come il campione possa essere adatto allo studio strutturale. Una volta acquisita padronanza, questo protocollo può essere completato in 10-12 ore dal momento della scongelazione della polvere di cellule lisate congelata.

Seguendo questo protocollo, è fondamentale assicurarsi che tutte le soluzioni siano prive di proteasi e nucleasi e lavorare rapidamente per prevenire l'aggregazione o la dissociazione del complesso. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe comprendere come purificare un complesso nativo di qualità adeguata per lo studio strutturale, nonché come valutare che ciò sia stato raggiunto.