Purificazione di Native Complessi di studio strutturale utilizzando un metodo Tag Tandem Affinity

L'obiettivo generale di questo protocollo è quello di purificare un complesso macromolecolare nativo di qualità adeguata per studi biofisici. Questo protocollo serve non solo come un modo per purificare un complesso, ma anche come guida dettagliata per valutare la qualità strutturale del campione durante la purificazione. Il vantaggio principale di questo protocollo è che consente di purificare un assemblaggio nativo in condizioni tampone quasi fisiologiche in modo semplice e rapido, in modo da garantire l'omogeneità della composizione.

Dopo la centrifugazione delle cellule di S. cerevisiae e la decantazione del surnatante secondo il protocollo di testo, aggiungere due millilitri di tampone di lisi refrigerato e agitare e/o utilizzare una pipetta serelogica da 10 millilitri per sospendere il pellet. Trasferire la sospensione cellulare in una provetta da centrifuga conica in polipropilene vuota da 50 millilitri tenuta in ghiaccio. Quindi utilizzare altri due millilitri di tampone di lisi refrigerato per lavare ogni bottiglia da centrifuga e aggiungere la soluzione alla provetta da 50 millilitri.

Dopo aver determinato il peso umido del pellet di celle, creare un bagno di azoto liquido all'interno e intorno a una provetta da centrifuga conica in polipropilene da 50 millilitri. Quindi, aspirare le cellule sospese in una siringa da cinque millilitri e collegare un ago calibro 16 alla siringa. Quindi, congelare la sospensione cellulare facendola passare attraverso la siringa e l'ago nel bagno a una velocità di circa un millilitro al minuto per generare goccioline.

Per lisare le cellule di lievito, inizia usando l'azoto liquido per pre-raffreddare un macinacaffè. Quindi aggiungere fino a 40 grammi di cellule di lievito e macinare per 25 secondi, ripetendo la macinatura otto o nove volte. Si raccomanda di non purificare per più di 10 litri di coltura cellulare alla volta.

Ciò riduce al minimo i tempi di purificazione e garantisce il mantenimento dell'integrità strutturale del complesso. Dopo ogni due cicli di macinazione, aggiungere uno strato superficiale di azoto liquido al macinino e lasciarlo evaporare. Per evitare che le cellule si aggreghino, evitare che si scongelino utilizzando una spatola raffreddata ad azoto liquido per mescolare le cellule.

Dopo la lisi, le cellule dovrebbero apparire come una polvere bianca fine. Dopo aver controllato la lisi cellulare e preparato il tampone di lisi con PMSF, DTT e inibitori della proteasi secondo il protocollo di testo, utilizzare una spatola raffreddata con azoto liquido per raccogliere in modo incrementale la polvere di cellule lisate congelate nelle provette da 50 millilitri preparate del tampone. Ad ogni incremento aggiunto, ruotare delicatamente le provette da 50 millilitri a temperatura ambiente in modo da scongelare e sciogliere le cellule e prevenire la formazione di bolle.

Man mano che le cellule si dissolvono, aggiungi altra polvere cellulare. Dopo che tutte le cellule sono state aggiunte, continuare a scongelare e sciogliere le cellule fino a quando non si osservano grumi di cellule congelate nelle provette. L'operazione dovrebbe richiedere circa 50 minuti.

Quindi, centrifugare il lisato cellulare a 25.000 volte g e quattro gradi Celsius per 20 minuti. Una volta che le cellule sono state lisate e dopo la centrifugazione, si può osservare un piccolo strato scuro nel pellet insolubile. Trasferire il surnatante in provette per ultracentrifuga in policarbonato e aggiungere 10 microlitri di PMSF da 200 millimolari a ciascuna provetta piena.

Centrifugare i campioni a 100, 000 volte g e quattro gradi Celsius per un'ora. Alla fine della centrifuga, dovrebbero essere visibili quattro strati. Un pellet duro e chiaro contenente principalmente complessi ribosomiali; un pellet morbido ricco di lipidi; un grande strato chiaro, di colore giallo, contenente la maggior parte delle proteine e dei complessi solubili della cellula; e uno strato superiore squamoso costituito da lipidi.

In una cella frigorifera a quattro gradi Celsius, utilizzare una pipetta da un millilitro per rimuovere il più possibile lo strato lipidico squamoso superiore e scartarlo. Utilizzare una pipetta sierologica da 10 millilitri per recuperare la maggior parte dello strato giallo chiaro. Quindi, utilizzando una pipetta da un millilitro per evitare di disturbare i due strati inferiori, recuperare gli ultimi millilitri di questo strato.

Da 40 grammi di pellet a celle umide, in genere vengono recuperati circa 48 millilitri dello strato intermedio. Dopo aver preparato il sefarosio IgG secondo il protocollo di testo, combinare la resina IGG con il surnatante della fase intermedia e due compresse di mini inibitori della proteasi per 40 grammi di cellule. Quindi posizionare su un rotatore a quattro gradi Celsius per due ore.

Questa è la soluzione batch IgG. Preparare due colonne di polyprep da 10 millilitri tagliando le estremità delle colonne per produrre un'apertura piatta. Versare i 24 millilitri di sospensione di resina IgG o soluzione batch in ciascuna colonna e lasciare sedimentare per gravità.

Ciò corrisponde a 200 microlitri di resina IgG confezionata. Se la sedimentazione dura più di 30 minuti, la fase intermedia potrebbe essere stata contaminata dai lipidi. Al termine della sedimentazione, utilizzare quattro volumi successivi da 10 millilitri di tampone IgG D150 per lavare la colonna impaccata.

Per eseguire la scissione del virus dell'incisione del tabacco o della proteasi TEV sulla colonna, sigillare il fondo della colonna e aggiungere un millilitro di tampone IgG D150 e 100 microlitri di proteasi TEV. Sigillare la parte superiore della colonna e utilizzare un miscelatore termico a 750 giri/min e 18 gradi Celsius, mescolare per 20 minuti. Risospendere la resina e mescolare di nuovo per 20 minuti.

Quindi rimettere in pausa e ripetere la miscelazione di 20 minuti una terza volta. Riportare la colonna a quattro gradi Celsius e utilizzare la gravità per eluire il complesso proteico. Quindi, aggiungere 200 microlitri di IgG D150 per eluire il volume morto.

Dopo aver preparato la resina di affinità per la calmodulina secondo il protocollo di testo, aggiungere il tampone legante la calmodulina e il campione alla resina e utilizzare un rotatore per provette per incubare a quattro gradi Celsius per un'ora. Preparare una colonna di polipropilene da due millilitri per 100 microlitri di impasto di calmodulina tagliando l'estremità della colonna per creare un'apertura piatta. Il protocollo descrive in dettaglio specifici volumi di tampone e di residenza scelti in modo da mantenere il complesso concentrato e ridurre al minimo il tempo di permanenza della resina.

Se il volume della coltura viene modificato, si consiglia di modificare i volumi di resina e buffer delle colonne a gravità per tenere conto della modifica. Imballare la colonna con non più di 100 microlitri di impasto di calmodulina e, per gravità, utilizzare 5 millilitri di tampone legante la calmodulina per lavare la resina tre volte. Utilizzando 200 microlitri di tampone di eluizione della calmodulina, eluire la proteina tre volte.

Quindi, sigillare il fondo della colonna e aggiungere 20 microlitri di tampone di eluizione e incubare per 2,5 minuti prima di rilasciare il sigillo e consentire alla proteina di eluire per gravità. Sigillare nuovamente il fondo della colonna e aggiungere 200 microlitri di tampone di eluizione prima di incubare per cinque minuti. Quindi, aprire la parte inferiore della colonna ed eluire la soluzione.

Per la sesta e ultima eluizione, sigillare il fondo della colonna e incubare con il tampone di eluizione per 10 minuti. Quindi, aprire ed eluire. Eseguire l'analisi post-purificazione e conservare i campioni secondo il protocollo di testo.

Come mostrato qui, una purificazione iniziale TAP del complesso seguendo un protocollo pubblicato ha prodotto un complesso che è migrato in tre bande su un gel colorato d'argento. Cicli multipli di ottimizzazione del metodo TAP ci danno un complesso che è migrato come una singola banda su un gel nativo, indicativo di un assemblaggio più omogeneo. Coerentemente con il risultato nativo del gel, il western blotting utilizzando un anticorpo TAP contro il complesso, purificato secondo il protocollo pubblicato, ha rilevato la proteolisi della proteina marcata con TAP, SNU-71.

Le modifiche del metodo TAP hanno ridotto significativamente la quantità di proteolisi, poiché quasi tutte le 17 proteine nel complesso U1 snRNP sono state risolte da SDS-PAGE e identificate positivamente mediante spettrometria di massa multipla. La microscopia elettronica a colorazione negativa mostra particelle monodisperse da una purificazione riuscita dopo la prima e la seconda fase di TAP. Al contrario, non si osservano particelle della dimensione corretta quando la purificazione non ha successo.

La qualità finale del complesso è stata valutata su un prato di particelle purificate, mostrate qui, che appaiono monodisperse nell'immagine grezza EM con colorazione negativa. Inoltre, le medie di classe delle particelle rivelano caratteristiche distinte che indicano che il campione è possibilmente adatto per lo studio strutturale. Una volta padroneggiato, questo protocollo può essere completato entro 10-12 ore dallo scongelamento della polvere di cellule lisate congelate.

Seguendo questo protocollo, è importante assicurarsi che tutte le soluzioni siano prive di proteasi e nucleasi, nonché lavorare rapidamente per prevenire l'aggregazione o la dissociazione del complesso. Dopo aver visto questo video, dovresti capire come purificare un complesso nativo di qualità adeguata per lo studio strutturale, nonché come valutare che ciò sia stato raggiunto.