Purificazione di nanoparticelle proteiche autoassemblanti mediante cromatografia di affinità

Prendi una sospensione di batteri ingegnerizzati che esprimono nanoparticelle proteiche ricombinanti autoassemblanti con tag poliistidinici.

Sonicare per rilasciare componenti intracellulari.

Centrifuga per raccogliere il surnatante contenente nanoparticelle proteiche. Diluirlo con un tampone privo di imidazolo.

Prelevare una colonna per cromatografia di affinità contenente perle di agarosio con cationi di nichel immobilizzati.

Aggiungere un tampone con una bassa concentrazione di imidazolo per l'equilibrio della colonna.

Aggiungere il lisato batterico sulla colonna.

Durante la corsa, la poliistidina sulle nanoparticelle proteiche si lega fortemente con i cationi di nichel.

Nel frattempo, contaminanti come i lipopolisaccaridi batterici e altre proteine si legano debolmente alla colonna.

Lavare con un tampone contenente una bassa concentrazione di imidazolo per rimuovere le proteine debolmente legate.

Introdurre l'isopropanolo per rimuovere i lipopolisaccaridi e poi lavare.

Successivamente, introdurre un tampone con una concentrazione intermedia di imidazolo. L'imidazolo compete con l'istidina per legarsi al catione nichel, rilasciando nanoparticelle proteiche legate.

Successivamente, aggiungi un tampone contenente un'alta concentrazione di imidazolo per eluire completamente le nanoparticelle proteiche.

Raccogli le nanoparticelle proteiche purificate per un'ulteriore applicazione.

Per la lisi di E. coli raccolti che esprimono il fascio a sei eliche SAPN, utilizzare una sonda con una potenza di sonicazione di 150 watt, con quattro secondi di sonicazione e sei secondi di riposo per sonicare pellet batterici risospesi in 40 millilitri di tampone privo di imidazolo su ghiaccio per cinque minuti.

Centrifugare il lisato cellulare per generare un surnatante chiarificato e trasferire il surnatante in un pallone sterile da 150 millilitri. Quindi, portare il campione a un volume finale di 100 millilitri con un tampone fresco privo di imidazolo.

Per isolare la proteina di interesse, aprire il software FPLC e fare clic sull'opzione Nuovo metodo. Nel menu Impostazioni metodo, aprire il menu a discesa Posizione colonna e selezionare Porta C1 3. Nel menu a discesa Mostrato da tecnica, selezionare Affinità. Nel menu a discesa Tipo di colonna, selezionare Altri, HisTrap HP e cinque millilitri. Il volume della colonna e le caselle di pressione verranno automaticamente impostati sui valori appropriati.

Fare clic su Struttura metodo e trascinare i pulsanti Equilibrazione e Applicazione campione, i tre pulsanti Lavaggio colonna e il pulsante Eluizione dal menu a comparsa Libreria fasi accanto alla freccia, prima di chiudere il menu Libreria fasi. Fare clic su Equilibratura e impostare i valori elencati nella tabella su Buffer iniziale B, 4%, Buffer finale B, 4% e Volume colonna, 5.

Fare clic su Applicazione di esempio. Nella casella Caricamento del campione, fare clic sul pulsante di opzione Inietta campione sulla colonna con pompa del campione e confermare che la casella accanto alle impostazioni Usa portata dal metodo sia selezionata in Iniezione del campione con scatola pompa di sistema . Modificare il valore della casella Volume su 100 millilitri e lo schema di raccolta delle frazioni su Abilita.

Deselezionare la casella Usa dimensione frazione da Impostazioni metodo e modificare la dimensione della frazione a quattro millilitri. Fare clic sul primo pulsante Lavaggio colonna. Impostare i valori elencati nella tabella su Buffer iniziale B, 4%, Buffer finale B, 4% e Volume colonna, 10. Fare clic sulla casella Abilita schema di raccolta frazioni e deselezionare Usa dimensione frazione per le impostazioni del metodo. Modificare la dimensione della frazione a quattro millilitri e fare clic sul secondo pulsante Lavaggio colonna.

Impostare i valori nella tabella su Buffer iniziale B, 0%, Buffer finale B, 0% e Volume colonna, 5. Fare clic sulla casella Abilita schema di raccolta frazioni e deselezionare Usa dimensione frazione da Impostazioni metodo. Modificare la dimensione della frazione in 4 millilitri e fare clic sul pulsante Lavaggio terza colonna. Impostare i valori nella tabella su Buffer iniziale B, 0%, Buffer finale B, 0% e Volume colonna, 10. Fare clic sul pulsante Abilita schema di raccolta frazioni e deselezionare la casella Usa dimensione frazione per le impostazioni del metodo. Quindi, modificare la dimensione della frazione a 4 millilitri.

Fare clic sul pulsante Eluizione e fare clic con il pulsante destro del mouse sulle informazioni nella tabella. Nel menu a comparsa, fare clic su Elimina passaggio e trascinare due volte il pulsante Sfumatura isocratica sulla tabella in modo che vi siano due voci. Impostare il valore per la prima voce su Buffer iniziale B, 30%, Buffer finale B, 30% e Volume colonna, 10.

Impostare il valore per la seconda voce su Buffer iniziale B, 100%, Buffer finale B, 100% e Volume colonna, 10. Fare clic sul pulsante Abilita schema di raccolta frazioni, quindi fare clic sulla casella Usa dimensione frazione per le impostazioni del metodo. Quindi, fai clic su Salva con nome e assegna al file il nome Purificazione.

Posizionare il tubo A della pompa dell'FPLC nel tampone di lavaggio privo di imidazolo e il tubo B della pompa nel tampone imidazolico da 500 millimolari. Posizionare il tubo della pompa del campione nel campione da 100 millilitri ed eseguire il programma di purificazione. Quando è necessario il lavaggio con isopropanolo al 60%, mettere in pausa il programma, spostare il tubo della pompa dal lavaggio senza imidazolo al lavaggio con isopropanolo al 60% e riavviare il programma. Al termine del lavaggio, mettere nuovamente in pausa il programma, riportare il tubo della pompa A nel tampone di lavaggio privo di imidazolo e riavviare il programma di purificazione.