Purificazione delle proteine basata sulla cromatografia di affinità al nichel: una tecnica per purificare le proteine ricombinanti marcate con poliistidina dal lisato cellulare batterico

Per purificare la proteina ricombinante fusa con il tag di poliistidina - una stringa di residui di istidina a un'estremità - da un lisato cellulare batterico, in primo luogo, diluire il lisato cellulare per prevenire l'intasamento della colonna durante l'esecuzione cromatografica.

Assemblare una colonna di affinità contenente cationi bivalenti di nichel immobilizzati su una matrice di perle di agarosio utilizzando acido nitrilotriacetico, un agente chelante. L'acido nitrilotriacetico lega i cationi di nichel attraverso quattro siti covalenti coordinati, mentre due siti sullo ione metallico rimangono disponibili per le interazioni con i tag poliistidinici nella proteina di interesse.

Equilibrare la colonna con un tampone adatto per ottimizzare le condizioni per interazioni efficaci metallo-proteina. Caricare la cella lisato sulla colonna.

Le proteine ricombinanti, che trasportano residui terminali di istidina accessibili, formano legami di coordinazione con i cationi di nichel a causa dell'elevata affinità dello ione metallo per l'imidazolo, la catena laterale dell'istidina, e si legano alla matrice. L'elevato numero di istidine consecutive nella proteina ricombinante rafforza il s