Purificazione delle proteine basata sulla cromatografia di affinità al nichel: una tecnica per purificare le proteine ricombinanti marcate con poliistidina dal lisato cellulare batterico

Per purificare la proteina ricombinante fusa con il tag di poliistidina - una stringa di residui di istidina a un'estremità - da un lisato cellulare batterico, in primo luogo, diluire il lisato cellulare per prevenire l'intasamento della colonna durante l'esecuzione cromatografica.

Assemblare una colonna di affinità contenente cationi bivalenti di nichel immobilizzati su una matrice di perle di agarosio utilizzando acido nitrilotriacetico, un agente chelante. L'acido nitrilotriacetico lega i cationi di nichel attraverso quattro siti covalenti coordinati, mentre due siti sullo ione metallico rimangono disponibili per le interazioni con i tag poliistidinici nella proteina di interesse.

Equilibrare la colonna con un tampone adatto per ottimizzare le condizioni per interazioni efficaci metallo-proteina. Caricare la cella lisato sulla colonna.

Le proteine ricombinanti, che trasportano residui terminali di istidina accessibili, formano legami di coordinazione con i cationi di nichel a causa dell'elevata affinità dello ione metallo per l'imidazolo, la catena laterale dell'istidina, e si legano alla matrice. L'elevato numero di istidine consecutive nella proteina ricombinante rafforza il suo attaccamento alla matrice.

In confronto, le proteine prive di residui di istidina non aderiscono alla colonna ed eluiscono nel flusso. Lavare la colonna con tampone imidazolo a bassa concentrazione.

L'imidazolo compete con contaminanti proteici debolmente legati che potrebbero aver aderito in modo non specifico alla matrice attraverso residui di istidina nella loro catena polipeptidica, spostandoli e facilitando l'eluizione. Lavare la colonna con tampone imidazolico altamente concentrato per dissociare le proteine ricombinanti marcate con istidina fortemente legate dal chelato di ioni nichel, eluendole in flow-through.

Raccogliere la frazione proteica ricombinante purificata per ulteriori analisi.

Iniziare questo protocollo con la sovraespressione inducibile di una proteina marcata con istidina come descritto nel protocollo di testo. Preparare 1 millilitro di resina di acido nichel-nitriloacetico in una colonna a gravità, per purificare la proteina. Il giorno prima dell'uso, equilibrare la colonna per una notte a 4 gradi Celsius con 2 millilitri di tampone di equilibratura.

Il giorno seguente, portare la colonna da 4 gradi Celsius a temperatura ambiente, prima di caricare il lisato chiarificato, e lasciarla riposare per circa due o tre ore. Quindi, risospendere il pellet nel tampone di lisi.

Sonicare le cellule sul ghiaccio per 10 volte intervalli di 10 secondi, facendo una pausa di 30 secondi tra gli impulsi. Chiarificare il lisato mediante centrifugazione a 3080 x g per 30 minuti a 4 gradi Celsius utilizzando una microcentrifuga.

Preparare il lisato chiarificato con volumi uguali di tampone di lisi, quindi applicare il lisato chiarificato preparato sulla colonna e raccogliere il flusso. Riapplicare il flusso di lisato chiarificato alla colonna e raccogliere il flusso secondario.

Quindi, lavare la colonna con 5 millilitri di tampone di lavaggio #1 e raccogliere il flusso. Lavare nuovamente la colonna con 5 millilitri di tampone di lavaggio #2 e raccogliere il flusso. Ora, applicare 2 millilitri di tampone di eluizione. Raccogliere il flusso in due frazioni di 1 millilitro ciascuna.