Bilinçli Farelerde Glomerüler Filtrasyon Hızı Ölçümü için bir Yüksek verimli Yöntemi

Bu prosedürün genel amacı, diğer araştırmacılara uyanık farelerde böbrek fonksiyonlarının nasıl belirleneceğini göstermektir. Bu işlem, öncelikle floresein izotiyosiyanat veya FITC inülinin 24 saat boyuncale diyaliz edilmesi ve enjeksiyon için konsantrasyonunun belirlenmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adımda ise fare tartılır, retrobulber enjeksiyon için doğru hacimlerde FITC inülin hazırlanır ve fare anestezi altına alınır.

Ardından, retrobulber FITC-inulin enjeksiyonu gerçekleştirilir ve 75 dakikalık bir süre boyunca sekiz kan örneği alınır. Son adım, mikro hacimli bir florospektrometre kullanarak FITC-inulin miktarını ölçmek ve iki fazlı eksponansiyel bozunma modelini uygulayarak böbrek fonksiyonunu hesaplamaktır. Sonuç olarak, FITC-inulin tek bolus enjeksiyon yönteminin hassasiyetini florospektrometrenin mikro hacim kapasitesiyle birleştirmek; farelerdeki genetik modifikasyonların, diyet değişikliklerinin veya ilaç uygulamalarının neden olduğu böbrek fonksiyonu farklılıklarının tespit edilmesine olanak tanır.

Bu tekniğin sürekli infüzyon, anestezi altındaki koşullar, ozmotik mini pompaların implantasyonu veya radyoaktif inülin kullanımı gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajları, cerrahi müdahale gerektirmemesidir. Bu yöntem terminal bir deney değildir. İdrar toplama gereksinimi yoktur ve günde 24 M'ye kadar ölçüm yapmak mümkündür.

Bu prosedürü, laboratuvarımdan araştırma görevlisi Maria Azimo ile birlikte gerçekleştireceğim. Fitzy Nulin enjeksiyon solüsyonunu hazırlamak için; 2 ml %5'lik solüsyon için yeterli miktarda ZI inulin tartın, etiketli inülini tamamen çözünene kadar 90 °C'ye ısıtarak %0,85'lik sodyum klorür solüsyonunda çözün. Membrandaki kalıntı sodyum asidini gidermek için 20 cm'lik bir diyaliz membranı parçasını 30 dakika boyunca çift distile suyun içinde bekletin, ardından membranı birkaç kez durulayın, diyaliz membranını çözünmüş fitzy inülin ile doldurup kapatıcılarla uygun şekilde mühürleyin ve ardından membranın tamamını tartın.

Çözünmüş fitzy inulinin bir litre %0,85 sodyum klorür çözeltisi içinde diyalize olmasına izin verin ve oda sıcaklığında, ışıktan korunarak 24 saat boyunca yavaşça karıştırın; diyaliz sonrası, tüm diyaliz membranını tekrar tartın ve yeni konsantrasyonu hesaplayın. Su, ozmotik olarak membranın içine girecek ve bağlanmamış FSI membranın dışına çıkacaktır. Böylece, FSI inulin konsantrasyonu önemli ölçüde azalacaktır.

C yeni konsantrasyon, N başlangıçtaki fit inülin miktarı ve V ise diyaliz tüpünün diyaliz öncesi ve sonrası ağırlık farkı ile başlangıçtaki fit inülin çözeltisinin hacminin toplamı olmak üzere, bu formülü kullanarak yeni fit inülin konsantrasyonunu hesaplayın. Ardından, diyaliz edilen çözeltiyi 0,22 mikronluk bir şırınga filtresinden geçirerek filtrasyonla sterilize edin.

Deney öncesinde fotobeyazlamayı önlemek için fitzy inulin'in her zaman ışıktan korunduğundan emin olun. Fareleri %4 ila %5 isofluran ile kısa süreli anesteziye aldıktan sonra vücut ağırlıklarını ölçün. Anestezi derinliğini ayak refleksine bakarak kontrol edin; hava kabarcıklarını gidermek için yarım inç uzunluğunda 26 gauge iğneye sahip 100 µL'lik bir Hamilton şırınga kullanarak, vücut ağırlığının gramı başına 2 µL diyaliz edilmiş fitzy nulin aspire edin, ardından enjeksiyon için yarım inç uzunluğunda 30 gauge bir iğneye geçin.

Diyaliz edilmiş fitzy inülini retroorbital pleksusa enjekte edin. Farelerin kendi kafeslerinde kendiliğinden iyileşmelerini bekleyin. Fare kuyruğunu makasla bir kez bir milimetre genişliğinde kesin ve enjeksiyondan sonraki çeşitli zaman noktalarında sodyum heparinli mini kılcal tüplere kan toplayın.

Kan toplama işleminden sonra mini kapilerleri cha seal ile mühürleyin ve numuneleri ışıktan koruyun. Mühürlenen mini kapilerleri hematokrit kapilerlerinin içine yerleştirin ve beş dakika boyunca santrifüjleyin. Mini kapilerleri bir elmas kesici kullanarak kırın ve plazmanın tamamını pipetleme yoluyla 0.2 milliliter tüpe aktarın.

Yeni bir 0,2 mililitrelik tüp içerisinde, iki mikrolitre plazma ve 18 mikrolitre 0,5 mol/L HEPES kullanarak 1/10'luk bir dilüsyon hazırlayın. Ardından, altı farenin yüksek kapasiteli analizi için seyreltilmiş örnekten iki mikroliteri NanoDrop 3.000 ile dubleks olarak ölçün. Tüm böbrek GFR'sini tekli bolus enjeksiyon yöntemiyle ölçmek için metin protokolünde verilen akış şeması protokolünü izleyin; FSE inulin enjeksiyonundan sonraki 3, 5, 7, 10, 15, 35, 56 ve 75. dakikalarda sekiz kan örneği toplanmalıdır.

Bu akış şemasında, rakamlar toplama zaman noktalarını, parantez içindeki rakamlar ise numune numaralarını belirtmekte olup dikey kırmızı çizginin solundaki rakamlar enjeksiyon zaman noktalarını göstermektedir. Her fare farklı bir renkle işaretlenmiştir. Ardışık kan toplamaları gerçekleştirmek için okları takip edin.

Gri kutular, bu protokol kullanılarak enjeksiyondan önce bir sonraki farenin ne zaman izofloran anestezisi için hazırlanması gerektiğini belirtmektedir. Farklı farelerden alınan iki kan koleksiyonu arasındaki minimum süre bir dakikadır. Metin protokolünde listelenen standart dilüsyonları elde etmek için fitizulin enjeksiyon solüsyonunu seyreltilmiş fare plazması ile seyrelterek hazırlayın. Standartların konsantrasyonule diyalize bağlı olacaktır ve her FSI nulin hazırlığı için her zaman farklılık gösterecektir.

Bu nedenle, her seferinde standart eğri için konsantrasyonun girilmesi gereklidir. Bilinçli farelerde GFR ölçümü için metin protokolünde ayrıntılı olarak açıklanan iki fazlı eksponansiyel azalma fonksiyonunu kullanarak, uygun bir yazılımla glomerüler filtrasyon hızını veya GFR'yi hesaplamak için verileri analiz edin. GFR hesaplaması için, tek doz intravenöz enjeksiyon sonrası ZI inülinin plazma kinetikleri kullanılır; iki bölmeli modelde iki bölmeli model uygulanır.

İlk hızlı azalma evresi, fitzy inülinin intravasküler bölmeden hücre dışı sıvıya yeniden dağılımını temsil eder. Fitzy inülin konsantrasyonunun daha yavaş azaldığı sonraki evre ise ağırlıklı olarak plazmadan sistemik klirensi yansıtır. Tip 1 diyabet, streptozotosinin intraperitonal uygulamasıyla indüklenmiştir.

GFR, tip 1 diyabetin indüklenmesinden önce ve beş hafta sonra belirlenmiş olup, diyabetik hayvanlarda glomerüler hiperfiltrasyon belirgin şekilde görülmektedir. Bu videoyu izledikten sonra, tek bolus enjeksiyon tekniği kullanarak ve iki fazlı eksponansiyel DK modeli uygulayarak büyük farelerde GFR'nin nasıl ölçüleceği konusunda iyi bir anlayış kazanmış olmalısınız.