Münih Wistar Sıçanlarda 2-Foton Mikroskopi kullanarak Floresan Makromoleküllerin Glomerüler geçirgenliği miktarının

Bu prosedürün genel amacı, nefronun filtrasyon ünitesini başarılı bir şekilde görselleştirmek ve floresan makromoleküllerin filtrasyon bariyeri boyunca in vivo olarak idrar boşluğuna filtrasyonunu ölçmektir. Bu, önce canlı hayvan için mikroskop aşamasının hazırlanmasıyla gerçekleştirilir. Daha sonra böbrek açığa çıkarılır ve sıçan sahneye yerleştirilir.

Daha sonra tek tek glomerüller tanımlanır ve haritalanır ve arka plan 3D görüntüleri elde edilir. Son olarak, floresan albümin infüze edilir. Bireysel glomerüllerin 3D hacimleri elde edilir ve geçirgenlik ölçülür.

Sonuç olarak, flakon içi iki foton mikroskobu kullanılarak böbrekteki glomerüller boyunca makromoleküllerin filtrasyon katsayısını gösteren sonuçlar elde edilebilir. İki foton mikroskobunun ana avantajı, hayvanda hem glomerüler filtrasyonun hem de proksimal tübüler yeniden absorpsiyon ve transsitozun aynı anda ölçülmesine izin vermesidir. Aynı zamanda, tekniğin etkileri, hem glomerüler filtrasyonun hem de proksimal tübüler rolün anlaşılmasının önemi olarak, mekanik olanın ötesine tanısal ve terapötik olarak uzanır.

Albüminin yeniden emilimi, tedavi hedefinin belirlenmesinde kritik öneme sahiptir. Sıçanı uyuşturduktan sonra, juguler veya femoral ven boyunca kalıcı bir venöz erişim hattı yerleştirin ve sol kanadı göğüs kafesinin hemen altından sol uyluğun hemen üstüne kadar tıraş edin. Bu hayatta kalmayan bir ameliyattır.

Fareyi, sol tıraşlı tarafı yukarı bakacak şekilde sağ tarafına düz bir şekilde yerleştirin. Ön pençeleri birbirine değecek ve arka pençeleri birbirine çok nazikçe değecek şekilde duruşu uzatılmış ve çömelmemiş olarak bankta düz olduğundan emin olun. Retroperiton içinde doğal olarak nerede olduğunu belirlemek için böbreği hissetmek için palpe edin ve bir çift diş forseps ile vücuda paralel düz bir çizgi çizmek için bir sharpie kullanın.

Cildi alın ve dokuyu ezmek ve bir çift cerrahi makas kullanarak kanamayı önlemek için cildi çizilen çizgi boyunca sıkıştırmak için bir çift kanama durdurucu kullanın. Kesi boyunca kesin. Gerektiği kadar ince olan dış kas tabakasını kesmek için de aynı prosedürü kullanın.

Peritonu açığa çıkaracak olan iç kas tabakasına yapılan kesi için kanamayı önlemek için kanama durdurucular kullanın. Boyutu tahmin etmek için böbreği yeniden palpe edin. Böbrekten daha küçük bir kesi hattını sıkıştırın ve kesiğin böbreğin hemen üzerinde olduğundan emin olun.

Bu kesiyi çok küçük yapmak ve gerekirse büyütmek en iyisidir. Böbreği bulun ve böbreğin alt kutbuna doğru çalışarak çevredeki yağı el ele tutuşmak için forseps kullanın. Böbreğin alt kutbuna ulaşıldığında, böbreği dışlamak için böbreğin altına çok nazikçe sıkarken böbreği kesiden nazikçe çekin.

Kesi çok küçükse, kas tabakasını ezin ve genişletmek için kesin. Sıçanın böbreğini dıştan çıkardıktan ve sıçanı görüntüleme için mikroskop aşamasına yerleştirdikten sonra böbreği dıştan çıkarmak için prosedürü tekrarlayın. Mikroskobunuz, çift geçişli bir floresein çubuğu, domin filtresi ve düşük güçlü bir objektif kullanarak konumları işaretleyebilen motorlu bir sahne ile donatılmışsa, proksimal tübüllerle çevrili boş dairesel yapılar olarak görünecek olan tek tek glomerülleri bulun ve ortalayın.

Doğal bir sarı turuncu otomatik floresansa sahip olmak, her konumu işaretleyin, tareti daha yüksek güçlü bir suya daldırma hedefine getirin ve her glomerülün 3D veri setlerini alın. Kılcal halkaların ve Bowman boşluğunun açıkça görülebildiğinden emin olmak. Sahte bir renk paleti kullanmak, bu yapıları görselleştirmeye yardımcı olacaktır.

Daha sonra, yüzeysel bir kan damarına odaklanarak floresan albümini yavaşça infüze edin, düşük glomerüler cing katsayısı veya GSC'ye sahip moleküller için sistemik dağılıma izin vermek için zaman verildiğinden emin olun, plazmadaki yoğunluk değerlerini en üst düzeye çıkarmak önemlidir, ancak mikroskoptaki foto dedektörleri doyuracak seviyelere ulaşmamak önemlidir. Bu, filtrelenmiş moleküllerin tespit edilebilirliğini artırır Potansiyel küçük moleküler ağırlıklı fragmanların temizlenmesine izin vermek için yaklaşık 10 dakika bekledikten sonra, metamorf görüntü işleme yazılımı kullanarak albüminin hesaplanmasında kullanılmak üzere bir mikron aralıklarla 3D hacimler elde edin. Floresan albümin içeren birimdeki her bir glomerül için arka plan görüntüleriyle birlikte 3B veri setlerini yükleyin.

Tanımlanmış kenar boşlukları ile Bowman kapsülünün kenarı arasında yeterli boş alan bulunan yüzeysel bir kılcal halka bulun. Arka plan ses seviyesinde. Albümin içeren görüntünün tüm görsel ipuçlarını içermesi gereken aynı odak düzlemini bulun.

İlgilenilen kılcal döngü içinde bir bölge seçin ve ortalama yoğunluk okumasını not edin. Ardından, Bowman alanı içinde bir bölge seçin ve ortalama yoğunluk okumasını not edin. Bunlar, nicelik için arka plan değerleri olarak kullanılacaktır.

Albümin içeren görüntüdeki Bowman boşluğu içindeki benzer bölgeyi seçin. Bowman'ın uzayı içindeki ortalama yoğunluk için bir değer elde etmek için bunu en az iki diğer bölge için yapın. En parlak plazma yoğunluğuna sahip kılcal halkayı seçin ve etrafına bir bölge çizin.

Daha sonra, eşik fonksiyonunu kullanarak, dolaşımdaki plazma içindeki parlak değerleri vurgulayın ve dolaşımdaki kırmızı kan hücrelerini dolaşan koyu çizgilerden kaçının. Seçilen plazma boşluğunun ortalama yoğunluk değerlerini not edin. Tercihen plazmanın parlak alanlarını seçmek önemlidir, çünkü kandaki faktörler sadece plazma floresan seviyelerinin hafife alınmasına neden olacaktır.

GSC'nin ham okçu alanının farkına eşit olduğu GSC'yi hesaplamak için değerleri bir Excel elektronik tablosuna girin. Yoğunluk eksi arka plan Bowman uzay yoğunluğu, ham kılcal döngü yoğunluğu eksi arka plan kılcal döngü yoğunluğu farkına bölünür. Filtrelenmiş floresan albümin alımı ağırlıklı olarak proksimal tübüllerin erken segmentinde meydana gelir.

S bir, bu panel bir glomerulusun bir kesitini ve bir Münih Wistar prompter faresinden alınan bir S bir segmenti, ilk Texas kırmızı RSA bolusunun infüzyonundan yaklaşık 20 dakika sonra gösterir. Bowman boşluğunun açılması ve albüminin kırmızı renkte hevesli bir şekilde alınması S one segmentinde gösterilmiştir. Bu panel, aynı veri kümesinin sığ bir 20 mikron 3D projeksiyonunu gösterir ve burada gösterilen, infüzyondan yaklaşık 60 dakika sonra alınan daha düşük bir güç projeksiyonudur.

Bu görüntüler, intra vital mikroskopinin, filtrasyondan sonra infüzyon materyalinin kaderinin görselleştirilmesine izin verebileceğini ve bir dereceye kadar doğrulayabileceğini göstermektedir, burada gösterilen gözlenen filtrasyon katsayısı, yüzey glomerulusundan alınan görüntülerdir. Bu panel bir arka plan görüntüsüdür ve bu görüntü, Texas Red sıçan serum albümininin infüzyonundan yaklaşık 12 dakika sonra çekilmiştir. Bu iki panel sahte renkte çizilmiştir.

Bowman'ın uzayında çizilen üç küçük ilgi bölgesi, filtrasyon bariyeri boyunca hareket eden floresan albüminin ortalama yoğunluğunu hesaplamak için kullanılır. Tek tek bölgeler için ortalama yoğunluk değerleri, gösteri bölgesi İstatistikleri iletişim kutusunda vurgulanan alanda rapor edildi. Bu bireysel glomerulus için türetilen 0.0111 albümin için GSC değeri, beslenen durumdayken Münih yıldız sıçanlarının bu türündeki aralık sahnesine girer.

Bu prosedürü takiben, makromolekülün geliştirildikten sonra idrar boşluğuna filtrasyondan sonra nihai olarak kaçakçılığı gibi ek soruları yanıtlamak için diğer böbrek yapıları üzerinde kantitatif ve kalitatif analiz gibi diğer yöntemler uygulanabilir. Bu teknik, böbrek fizyolojisindeki araştırmacıların dinamik fizyolojik ve patofizyolojik süreçleri sadece bir kez değil, uzunlamasına keşfetmelerine izin verdi. Zamanla öyle oldu.