La supplémentation alimentaire en acides gras polyinsaturés dans Caenorhabditis elegans

L’objectif global de l’expérience suivante est d’utiliser des moyens diététiques pour modifier la composition en acides gras de l’élégance marine afin d’étudier la fonction et la régulation des acides gras. Ceci est réalisé en cultivant la source de nourriture du nématode en présence d’acides gras insaturés. Ensuite, l’élégance de la mer est nourrie avec les bactéries supplémentées, ce qui permet l’absorption de l’acide gras et son incorporation dans le ver.

Les lipides changent alors dans l’élégance marine. La composition en acides gras est confirmée par chromatographie en phase gazeuse par spectrométrie de masse. Enfin, après s’être nourris d’acides gras insaturés, les vers sont marqués pour leur stérilité.

On obtient des résultats qui montrent les effets physiologiques de la modification de la composition en acides gras par le développement, le comportement et les changements dans l’expression des gènes. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans les domaines de l’élégance marine, du développement et de la physiologie, car nous pouvons utiliser à la fois la manipulation génétique et les contributions diététiques pour modifier la composition en acides gras et surveiller les conséquences. En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode doivent être prudentes et prudentes, car il est difficile d’obtenir des résultats cohérents en raison de la sensibilité des acides gras insaturés à l’oxygène et aux températures élevées.

Pour préparer un litre de milieu supplémenté en acides gras, mesurez les composants suivants dans un flacon. Ajoutez de l’eau milliporeuse jusqu’à 800 millilitres et autoclavez le milieu avec une bouteille en verre vide pour chaque concentration d’acide gras à tester, ainsi que des cylindres gradués appropriés pendant que le milieu refroidit à 55 degrés Celsius. Préparez la solution mère de travail du sel de sodium d’acide gras en ouvrant soigneusement le flacon en verre afin de ne pas introduire de particules de verre dans la poudre et en pesant suffisamment pour faire une solution mère de 100 millimolaires, ajoutez la quantité nécessaire d’eau purifiée.

Ensuite, à l’aide d’argon ou d’azote gazeux, purgez la solution pour prévenir l’oxydation des acides gras. Ensuite, bouchez le flacon et conservez le flacon dans l’obscurité pendant que l’acide gras, le sel de sodium, se dissout. Lorsque l’agri s’est refroidi à 55 degrés Celsius à la suivante, puis près d’une flamme, transférez la solution dans un cylindre gradué stérile.

Avant d’ajouter de l’eau stérile jusqu’à un litre, transférez le milieu dans le ballon et continuez à mélanger. À l’aide d’un cylindre gradué stérile, transvaser une aliquote de milieu dans un flacon autoclavé pour chaque concentration d’acide gras à tester. Ensuite, gardez les bouteilles au chaud sur une plaque à mélanger.

Incorporer la concentration appropriée de solution mère d’acides gras avant d’utiliser une pipette stérile de 25 millilitres pour verser les plaques une fois que les plaques se sont solidifiées, et conservez-les à température ambiante dans un endroit bien contrôlé et dans l’obscurité. Deux jours plus tard, utilisez e coli OP 50 pour ensemencer les plaques, puis incubez les plaques dans un environnement sombre à température ambiante pendant que la pelouse bactérienne sèche. Préparez une population synchronisée de larves de L one en traitant Ravi Hermaphrodites avec une solution d’hypochlorite alcaline.

Bercez doucement les hermaphrodites GR dans cette solution jusqu’à ce que les vers adultes se dissolvent. Puis centrifuger à basse vitesse pour granuler les œufs. Utilisez le tampon M nine pour laver les œufs trois fois.

Ensuite, dans un tube de 15 millilitres, mettez-les en suspension dans cinq millilitres de tampon M nine et basculez-les pendant la nuit. Ajoutez les larves L one à des plaques ensemencées OP 50 qui ont été complétées avec 0,3 millimolaire d’acide di homo gammalin ou DGLA et incubez-les à 20 degrés Celsius pendant trois jours ou jusqu’à ce que les larves atteignent le stade adulte. Utilisez un microscope à dissection pour évaluer la stérilité des vers adultes.

Une perte de germes réussie se manifestera par un utérus clair et dépourvu d’ovules. Vous pouvez également marquer les vers en les choisissant dans une goutte de tampon M neuf sur un verre de montre. Ensuite, utilisez un millilitre de solution de dappy de 0,2 nanogramme par millilitre pour inonder le verre de la montre et incuber pendant environ cinq minutes.

Après l’incubation, prélevez les vers dans une goutte de milieu de montage sur une lame avant de les recouvrir d’une lamelle, scellez la lamelle et stockez-la à quatre degrés Celsius dans l’obscurité pendant la nuit ou observez-la immédiatement sous un microscope fluorescent pour produire des esters méthyliques d’acides gras ou des fames. Pour quantifier l’absorption d’acides gras, prélevez 500 à 1000 vers adultes en utilisant de l’eau pour les laver des plaques et les transférer sur des vers siliconés. Tubes à vis en verre de 13 x 100 millimètres.

Laissez les vers se déposer par gravité, puis utilisez un verre au-delà de la pipette pour retirer autant d’eau que possible. Ajoutez un millilitre d’acide sulfurique à 2,5 % dans du méthanol et chauffez les tubes dans un bain-marie à 70 degrés Celsius pendant une heure après refroidissement pendant une minute sous le capot, extrayez les cadres en ajoutant 1,5 millilitre d’eau et 0,25 millilitre d’hexane. Rebouchez les tubes et secouez vigoureusement.

Ensuite, centrifugez les tubes dans une centrifugeuse clinique de table pendant une minute pour séparer l’hexane du solvant aqueux. Transférez la couche supérieure d’hexane dans une chromatographie en phase gazeuse ou un insert de flacon GC à l’intérieur d’un flacon GC. Pour l’analyse par gc, injecter un à deux microlitres de fames sur une colonne de chromatographie en phase gazeuse capillaire polaire adaptée à l’analyse de fame.

Réglez l’injecteur à 250 degrés Celsius avec un débit de 1,4 millilitre par minute. Programmez le four pour une température initiale de 130 degrés Celsius maintenue pendant une minute. Ensuite, augmentez la température de 10 degrés Celsius par minute jusqu’à ce qu’elle atteigne 190 degrés Celsius, puis augmentez-la à nouveau à cinq degrés Celsius par minute jusqu’à 210 degrés Celsius, puis maintenez pendant une minute supplémentaire pour vous assurer que l’absorption de DGLA a eu lieu.

Analysez les membrures par détection par ionisation de flamme ou par spectrométrie de masse ou détection MS en utilisant des normes authentiques pour l’identification de l’élégance de la mer. La supplémentation en acides gras du régime d’élégance marine est limitée par la capacité de la source de nourriture bactérienne à absorber et à incorporer les acides gras dans la membrane bactérienne pour déterminer la capacité d’E coli OP 50 à assimiler divers acides gras dans ses membranes. L’OP 50 a été appliqué sur un milieu sans supplément, avec des concentrations de 0,1 millimolaire et de 0,3 millimolaire d’acide stérique, de sodium ate et de sodium DGLA, comme le montre cette figure. L’analyse de l’OPG par le GCMS démontre que les acides gras insaturés, y compris l’oléate et le DGLA, s’incorporent à l’OP 50 à des concentrations plus élevées que l’acide stérique, un acide gras saturé.

De plus, la mesure des quantités d’acides gras chez les vers adultes révèle que la supplémentation en acides gras saturés n’a aucun effet sur la quantité relative d’acides gras saturés dans les tissus des vers. Cependant, la supplémentation en acides gras insaturés a augmenté les quantités relatives de ces graisses prises ensemble. Ces données indiquent que l’accumulation relative d’acides gras supplémentés dans l’élégance est directement corrélée à l’accumulation relative d’acides gras dans l’alimentation.

Comme nous l’avons démontré précédemment, ce graphique illustre la relation dose-réponse de l’induction de la stérilité par DGLA dans l’élégance marine. La concentration de DGLA dans les lipides des vers, dans lesquels 50 % de la population sera stérile, est d’environ 12 %Et il est intéressant de noter que la réponse à DGLA peut être modifiée par des mutations génétiques chez les vers. Sur la base d’une découverte récente selon laquelle les voies de stress dépendantes du facteur de croissance de l’insuline peuvent influencer la destruction des cellules germinales induite par la DGLA.

Nous avons complété l’alimentation de vers contenant des mutations délétères dans le récepteur IGF de l’insuline DAF deux ou le facteur de transcription FOXO DAF 16 Avec DGLA, Un score de stérilité dans chaque souche a montré que les deux mutants DAF étaient fertiles avec peu ou pas de perte de cellules germinales induite par rapport aux vers de type sauvage aux deux concentrations de DGLA. En revanche, les vers supplémentés en DGLA avec du vox O inactif présentaient un pourcentage plus élevé de vers stériles par rapport au type sauvage lorsqu’ils étaient nourris sur des plaques contenant 0,15 millimolaire de l’acide gras. En suivant cette procédure, les chercheurs peuvent effectuer de nombreux tests avec l’élégance marine supplémentaire, tels que des études d’expression génique, des tests comportementaux ou des analyses de développement ou de reproduction.

Ces tests révéleront le rôle d’acides gras spécifiques dans ces processus. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de préparer régulièrement des milieux supplémentés en acides gras qui peuvent être utilisés pour modifier la composition en acides gras de l’élégance marine.