Simulando pâncreas Neuroplasticidade: In Vitro Dual-neurônio Plasticidade Assay

O objetivo geral do experimento a seguir é estudar as alterações reativas dos neurônios periféricos a diferentes microambientes pancreáticos. Isso é conseguido primeiro gerando lisados de tecido inteiro a partir do pâncreas humano normal e do tecido pancreático doente. Como segunda etapa, as células DRG são isoladas de ratos recém-nascidos, que são posteriormente tratados com os lisados de tecido isolados.

Em seguida, após incubação por 48 horas, as células são fixadas para posterior coloração de imunofluorescência dupla. Os resultados mostram as diferenças no padrão de ramificação da densidade de neuritos dos neurônios e na densidade glial dos neurônios cultivados em diferentes extratos teciduais. Este método pode ajudar a facilitar estudos no campo da neurogastroenterologia, como o papel dos mediadores moleculares, das alterações neuroplásticas em diferentes doenças gastrointestinais.

Embora esse método possa fornecer informações sobre os diferentes atributos neurotróficos das doenças pancreáticas, ele também pode ser aplicado a outros sistemas, como cânceres ou estados inflamatórios de todo o trato gastrointestinal. Tivemos a ideia de usar esse método pela primeira vez quando iniciamos nossas colaborações com pesquisadores de pesquisa no campo de doenças neuropáticas no sistema pediátrico, como, como a doença de Ong, e aplicamos isso para nossos propósitos de homogeneizar o tecido pancreático humano. Transfira cubos de cinco por cinco milímetros de tecido pancreático diretamente de 80 graus Celsius negativos para nitrogênio líquido.

Em seguida, coloque os blocos congelados primeiro em tubos de homogeneização que podem conter uma bola de dissociação de metal e, em seguida, no homogeneizador de tecido homogeneizado sem permitir que o tecido descongele imediatamente após a dissociação. Resus suspende o pó sólido como homogeneizado em 300 a 500 microlitros de 0,1 XPBS gelado. Não use nenhum tampão de lise, pois isso pode.

Piolhos os neurônios e centrifugam os homogêneos a 21, 130 vezes G a quatro graus Celsius por pelo menos 15 minutos. Colete o supernat transparente, que contém o extrato de tecido para coletar o supernat da linha celular de linhagens celulares pancreáticas humanas. Cultive as células a pelo menos 70 a 80% de confluência em crescimento normal. Média.

Quando estiverem prontas, lave as células pelo menos três vezes com cultura de células, classifique PBS e cultive-as em meio livre de soro por até 48 horas. Em seguida, meça a concentração de proteína do homogeneizado de tecido ou sobrenadantes de linha celular por meio do ensaio de proteína de Bradford. Em seguida, alíquota dos extractos teciduais e dos sobrenadantes da linha celular de modo a que a concentração final do extracto ou sobrenadante no meio neuronal seja de 100 microgramas por mililitro.

E armazene-os a 80 graus Celsius negativos. Usando um rato recém-nascido decapitado P dois a P 12, corte a pele e exponha a coluna vertebral. Em seguida, faça uma laminectomia anterior para expor a medula espinhal.

Em seguida, exponha e remova os gânglios da raiz dorsal ou d RRGs. Coloque o DRG em MEM gelado fornecido com gentamicina e metronidazol. Continue a coletar DRGs, começando com os DRGs de mimo e subindo até os DRGs cervicais superiores.

Quando terminado, 52 DRGs são coletados o suficiente para uma placa de 24 poços. Em seguida, use uma microtesoura para separar os DRGs de suas raízes e nervos. Em seguida, corte todas as projeções periféricas e centrais restantes.

Após a coleta dos DRGs. Incube-os em HBSS fornecido com colagenase tipo dois a 37 graus Celsius por 20 a 30 minutos. Após a incubação, tritra os DRGs por meio de seringas com diâmetro decrescente.

Observe que o tri excessivo pode destruir neurônios, mas é menos destrutivo da glia. Quando o meio contendo os DRGs estiver turvo, centrifugue a suspensão a 93,9 vezes G por cinco minutos. Em seguida, descarte o meio e resus.

Suspenda as células em meio neurobasal para prepará-las para a cultura. Use um hemocitômetro para estimar o número total de neurônios e glia. Em seguida, semeie as células em lamínulas pré-revestidas de 13 milímetros.

Em uma placa de 24 poços, o revestimento utilizado depende dos objetivos experimentais. Em seguida, cubra os poços com meio neurobasal e permita que as células se liguem aos poços durante a noite. No dia seguinte, descongele o meio suplementado com extrato de tecido ou o meio suplementado com sobrenadante da linha celular.

Em seguida, aspire o meio de semeadura dos DRGs e faça uma lavagem opcional e muito suave com PBS. Em seguida, pipete lentamente o tecido, extraia o meio suplementado ou o meio suplementado com sobrenadante da linha celular nas células para obter 100 microgramas por mililitro. Agora deixe as células crescerem por 48 horas a 37 graus Celsius no extrato de tecido ou no sobrenadante da linha celular fornecido após 48 horas.

Aspire o meio e fixe em aldeído paraforme a 4% para imunocoloração. Para coloração imunofluorescente dupla, use marcadores específicos para neurônios e glia para morfogeometria. Use um microscópio de luz invertida equipado com uma câmera CCD em combinação com software automatizado para medir a densidade de neuritos usando uma ampliação de 200 x.

Meça a densidade de neuritos de culturas neuronais sobrepondo uma grade de 50 por 50 mícrons e contando a densidade de fibras por quadrado medida nas fibras que se cruzam. Repita esta análise para quatro regiões diferentes de crescimento mais denso em quatro a cinco micrografias fotográficas representativas em cada lamínula. Meça o crescimento médio de neuritos, o número médio de ramos por neurônio, o comprimento médio do ramo e o tamanho perianal de 30 neurônios solitários selecionados aleatoriamente de cada lamínula, marcando os neuritos e neurônios DRG péricos cultivados com um extrato de tecido de um pâncreas normal são mostrados aqui.

Em contraste, neurônios DRG cultivados com pancreatite crônica ou extratos de tecido de câncer de pâncreas. Exibir uma maior densidade de neuritos mostrada. Aqui estão os neurônios do plexo mioentérico cultivados com vários extratos de tecido pancreático humano.

Os neurônios do plexo mioentérico cultivados em extratos de pancreatite crônica ou câncer de pâncreas constroem neurônios mais longos e exibem um padrão de ramificação mais complexo do que aqueles cultivados em extratos de um pâncreas normal. Quando os neurônios DRG foram cultivados com o sobrenadante de células cancerígenas pancreáticas, também foi observado um aumento na densidade neurológica semelhante ao observado com extratos de tecido. Esse aumento, no entanto, foi reversível quando fatores neurotróficos selecionados, como nosso fator de crescimento nervoso ou teína, foram esgotados ou bloqueados.

As células ggl também respondem de maneira diferente a diferentes extratos de tecido pancreático, extratos de pancreatite crônica ou câncer de pâncreas, crescimento glial aprimorado por tecido e contagem de células gliais em culturas gliais derivadas de DRG. Embora o efeito tenha sido mais pronunciado com câncer de pâncreas, então extratos de pancreatite crônica Uma vez dominados. Esta técnica pode ser feita em quatro a cinco horas se for realizada corretamente Após seu desenvolvimento.

Este método abriu caminho para pesquisadores no campo da neurogastroenterologia explorarem mecanismos de neuroplasticidade em diferentes doenças gastrointestinais, incluindo distúrbios gastrointestinais inflamatórios e malignos. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa visão de como isolar neurônios periféricos para estudar a neuroplasticidade pancreática no pâncreas e como implementar esse sistema e outras alterações neurais e outros ensaios de neuroplasticidade em distúrbios gastrointestinais.