Synthèse d'une protéine artificielle induite par une intéine Hydrogel

L’objectif global de cette procédure est de synthétiser un hydrogel de protéines très stable qui peut être utilisé comme échafaudage général pour l’immobilisation des protéines. Ceci est accompli en synthétisant d’abord deux blocs de construction d’hydrogel protéique dans un hôte bactérien. Chaque bloc de construction contient une sous-unité d’une protéine chimérique qui sert de réticulant et la moitié de l’ène divisé NPU.

Ces protéines sont ensuite purifiées par chromatographie d’affinité dans un deuxième temps. Les éléments constitutifs des protéines purifiées sont mélangés, ce qui déclenche des réactions de transépissage chez les adolescents qui constituent un polypeptide auto-assemblé flanqué d’agents de réticulation déclenchant la formation d’hydrogel. Cet hydrogel est très stable en solution et incorpore un motif de liaison approprié dans le bloc protéique.

Les copolymères permettent l’incorporation pratique et spécifique au site de protéines gulaires fonctionnelles dans les blocs de construction de l’hydrogel, ce qui entraîne la formation d’un hydrogel, qui immobilise les protéines Les protéines gulaires immobilisées présentent un faible taux de lixiviation sur trois semaines à température ambiante. Enfin, les enzymes immobilisées dans cet hydrogel protéique sont protégées de la dénaturation par les solvants organiques. Ainsi, cet hydrogel peut également servir de bioréacteur pour la synthèse organique.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes d’immobilisation stable des protéines, y compris celles impliquant la réticulation de la surface LI ou l’encapsulation d’enzymes dans des supports poreux ou inter-enzymes La réticulation est la capacité d’immobiliser de manière stable les protéines cibles dans un environnement poreux et hautement hydraté sans aucune modification chimique de la chaîne latérale de la protéine. Cette technologie permet également l’assemblage de plusieurs enzymes dans une voie dans un arrangement tridimensionnel prédéterminé qui peut faciliter la canalisation du substrat entre les enzymes. Avant de commencer cette procédure, générez les deux copolymères de blocs protéiques N et C via la construction plasmidique par des technologies d’ADN recombinant suivies d’une expression protéique et d’une REIA coli B 21 de trois pour purifier et remettre en suspension les culots cellulaires dans le tampon A à raison de 10 millilitres par gramme de pastille humide.

Ensuite, plongez la suspension de pastilles dans un bain d’eau glacée et perturbez les cellules par sonication à 10 ampères avec une impulsion d’une seconde et une pause de six secondes pendant une minute une fois terminé. Centrifugez le lysat à 6 000 fois G pendant 20 minutes à quatre degrés Celsius. Après avoir retiré le tube de la centrifugeuse, jetez le surnageant S et remettez en suspension la pastille dans le tampon DA après la centrifugation en utilisant les mêmes conditions que précédemment, en faisant passer le surnageant à travers une colonne NTA de cinq millilitres préalablement équilibrée avec le tampon DA à l’aide d’un système de chromatographie à basse pression.

Ensuite, lavez la colonne avec 30 millilitres de tampon DA complété par 45 millimolaires d’élu olé, la protéine purifiée à l’aide de 20 millilitres de tampon DA complété par 150 millimolaires d’ole. Transférez la protéine purifiée dans un tube à centrifuger contenant une colonne de spin d’ultrafiltration de 30 kilodaltons. Centrifugez l’échantillon à 2 800 fois G et quatre degrés Celsius jusqu’à ce que le volume soit inférieur à un millilitre.

Une fois terminé, ajoutez 14 millilitres de tampon DPBS à la colonne pour diluer l’échantillon de protéines. Répétez les étapes de centrifugation et de dilution trois fois de plus après l’échange de tampon, ajoutez du DTT à la protéine purifiée pour obtenir une concentration finale de deux millimolaires. Ensuite, concentrez la protéine à environ 100 milligrammes par millilitre par centrifugation à travers une colonne de spin d’ultrafiltration de 30 kilodaltons à 2, 800 fois G à quatre degrés Celsius pendant environ 45 minutes à une heure.

Pour faire un mélange d’hydrogel de 100 microlitres, 42 microlitres d’une solution mère de C de 100 milligrammes par millilitre avec 10 microlitres d’azoture de sodium à 5 %, cinq microlitres de DTT de 100 millimolaires et 42 microlitres d’une solution mère de 100 milligrammes par millilitre de N.In un flacon en verre de deux millilitres, ajoutez un microlitre de tampon DPBS au flacon pour obtenir un volume final de 100 microlitres et mélangez manuellement tous les composants à l’aide d’un Mouvement tourbillonnant à l’aide d’une pointe de pipette. Après avoir centrifusé le mélange pendant deux minutes à 8 000 fois G, incubez-le à température ambiante pendant la nuit pour permettre à la réaction de transépissage ENE d’atteindre son terme. Ensuite, confirmez la formation d’hydrogel en retournant le tube pour fabriquer 50 microlitres d’un hydrogel GFP fonctionnalisé de 1,2 millimolaire.

Combinez 17 microlitres d’une solution mère contenant 100 milligrammes par millilitre de CSH trois ligands et neuf microlitres d’une solution de 230 milligrammes par millilitre de SH 3G FP dans un rapport molaire de un à un dans un tube à centrifuger de 1,7 millilitre, et incubez le mélange à température ambiante pendant 30 minutes. Ensuite, ajoutez cinq microlitres d’azoture de sodium à 5 %, 2,5 microlitres de DTT à 100 millimolaires et 0,5 microlitre de DPBS dans le même tube. Ajoutez ensuite 16 microlitres d’azote pour obtenir un rapport molaire de N à un et de trois ligands CSH et mélangez l’échantillon par un mouvement tourbillonnant à l’aide d’une pointe de pipette, centrifugez le mélange à 8 000 fois G pendant deux minutes.

Une fois terminé, incubez le mélange à température ambiante pendant une nuit dans l’obscurité pour former un hydrogel et encapsuler SH 3G FP. Pour une application supplémentaire, préparez une solution mère de 0,63 millimolaire de peroxydase de raifort HRP dans DPBS pour produire 30 microlitres d’un hydrogel de 1,6 millimolaire et un HRP de piégeage combiné à 12 microlitres d’une solution mère de C de 100 milligrammes par millilitre avec deux microlitres de HRP, trois microlitres d’azoture de sodium à 5 % et 0,5 microlitre de DTT de 300 millimolaires et un tube à centrifuger de 1,7 millilitre. Ajoutez 12 microlitres d’une solution de 100 milligrammes par millilitre de N et 0,5 microlitre de DPBS et mélangez la solution par un mouvement tourbillonnant à l’aide d’un embout EPI. Après centrifusion du mélange à 8 000 fois G pendant deux minutes, incubez-le à température ambiante pendant la nuit.

Pour la réaction enzymatique, immergez l’hydrogel dans un millilitre d’un cocktail réactionnel contenant 5,8 millimolaires de NN diméthyl PPH phénol diamine, 5,8 millimolaires de phénol et 2,9 millimolaires de tourte de butyle hydro peroxyde dans n heptane Perturbez manuellement le gel à l’aide d’une pointe de pipette pour augmenter la surface de contact de l’hydrogel et du solvant. Détecter le produit HRP et le colorant de type indel phénol en prélevant des échantillons du solvant à différents moments et en mesurant l’absorbance optique à 546 nanomètres dans un lecteur de plaques mélangeant du N et du C purifiés en présence de l’agent réducteur, le DTT induit la formation d’une troisième protéine, le produit ligaturé J individuellement. Les blocs de construction de l’hydrogel n NC existent sous forme de fluides visqueux le mélange de n NC donne un matériau semi-solide transparent qui est retenu au fond d’un flacon en verre après inversion indiquant la formation d’un hydrogel.

Cet hydrogel protéique médié par l’ène présente une grande stabilité de solution. Il y a peu ou pas de perte d’échafaudage d’hydrogel réticulé après 21 jours à 22 degrés Celsius dans le tampon DPBS. Comme la quantité totale de protéines libérée dans le tampon DPBS ne dépasse que légèrement la quantité théorique d’ène épissé à partir de l’hydrogel, la cytométrie dense a révélé que lors de la formation de l’hydrogel, les réactions de transépissage étaient efficaces à environ 80 %.

L’analyse du gel de la page FDS a montré que seules des traces du produit trans-épissé étaient présentes dans le tampon entourant l’hydrogel. Confirmation que la perte de l’échafaudage d’hydrogel réticulé à cause de l’érosion est minime. La principale protéine présente dans le tampon d’hydrogel est l’intuned épissé.

Aucun signe visible d’érosion n’a été observé dans un hydrogel non perturbé, immergé dans une solution aqueuse à température ambiante pendant plus de trois mois. L’hydrogel est également très stable à 37 degrés Celsius et dans des tampons acides et basiques. Pour faciliter l’immobilisation des protéines, une protéine et son ligand peptidique ont été utilisés pour arrimer les protéines d’intérêt dans l’échafaudage de l’hydrogel.

Nous avons choisi la protéine SH trois, un domaine d’homologie SAR trois de la protéine adaptatrice CRK comme protéine d’amarrage pour la fusion à une protéine d’intérêt et son ligand comme peptide de station d’accueil pour l’incorporation dans l’échafaudage d’hydrogel. Cette paire d’interaction a été choisie en raison de sa taille moléculaire relativement petite et de sa finitude d’affinité élevée. Le ligand S SH trois a été inséré entre le NPUC et la coupe A pour former le ligand CSH trois.

La protéine S SH trois a été fusionnée à l’extrémité d’une protéine globulaire cible modèle, la GFP. Le processus décrit dans le protocole produit un hydrogel contenant 1,2 millimolaire d’hydrogel trans-épissé et 1,2 millimolaire de GFP. L’hydrogel contenant la GFP présentait une stabilité similaire à celle de l’hydrogel dépourvu de GFP avec une perte totale de protéines d’environ 35 % après 21 jours.

Dans le tampon DPBS, la plupart des protéines présentes dans le tampon d’érosion ont été clivées à l’adolescence. La lixiviation de SH 3G FP à partir d’un hydrogel contenant le ligand S SH trois est d’environ 30 % après trois semaines, ce qui est significativement plus faible que celle d’un hydrogel dépourvu du ligand s sh trois, comme on le voit ici hydrogel contenant le peptide de la station d’accueil. Le ligand S SH trois conserve la majeure partie de la fluorescence GFP.

Après trois semaines, alors que l’hydrogel manque de trois ligands SSH devient essentiellement non fluorescent. La densité de la GFP immobilisée dans ce travail est d’environ 33 % molaire de l’hydrogel. Une densité d’immobilisation plus élevée peut potentiellement être obtenue lorsque plusieurs peptides de station d’accueil sont incorporés dans le bloc de construction de l’hydrogel.

Ensuite, l’enzyme HRP a été incorporée dans l’hydrogel protéique pour démontrer sa capacité à soutenir les biocatalyseurs dans les solvants organiques. L’activité enzymatique a été mesurée en surveillant le couplage oxydatif du NN, du diméthyl pph, du lène diamine et du phénol avec le peroxyde de butyle et de tourte au fil du temps. L’hypothèse était que l’environnement hydraté de l’hydrogel protégerait l’enzyme attachée de l’effet dénaturant du solvant organique.

Après l’immersion d’un solvant organique, le HRP contenant de l’hydrogel a été perturbé manuellement en petits amas pour augmenter la surface d’interface hydrophobe hydrophile. L’hydrogel incorporé HRP a catalysé efficacement la réaction d’oxydation rapide, donnant naissance à un produit colormétrique. L’accumulation du produit suit une pente linéaire indiquant peu ou pas d’enzyme en activation.

Au cours de l’expérience, l’HRP a d’abord dissous A-D-P-B-S suivi d’un ajout au solvant organique, a pu catalyser la conversion, mais à une vitesse de réaction beaucoup plus faible. Le faible taux de conversion des enzymes dissoutes dans le DPBS est probablement dû à la petite surface interfaciale entre le DPBS et le solvant organique, qui limite le taux de diffusion du produit du substrat. L’incorporation du fragment s hautement hydrophile dans le squelette de l’hydrogel, qui emprisonne efficacement l’eau à l’intérieur de l’hydrogel et empêche le solvant organique d’accéder à l’intérieur de l’hydrogel, permet à l’hydrogel de résister à l’effet dénaturant du solvant organique.

Ces résultats indiquent que l’hydrogel protéique médié par l’ène peut être un échafaudage efficace pour les réactions enzymatiques dans les solvants organiques. La flexibilité structurelle et la grande stabilité de cet hydrogel auto-assemblé lui permettent d’être utilisé non seulement dans les protéines et la mobilisation, mais également dans d’autres applications, notamment les piles à biocombustible, les vecteurs d’administration de médicaments injectables et les échafaudages d’ingénierie tissulaire.