Production de protéine élastine Hydrogels pour Encapsulation et immunomarquage des cellules en 3D

L’objectif global de ce protocole est d’exprimer et de purifier des protéines de type élastine dérivées de manière recombinante pour les utiliser comme hydrogel accordable pour l’encapsulation de cellules 3D. De plus, ce protocole présente la méthodologie de marquage fluorescent en aval en microscopie confocale de cellules encapsulées. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans les domaines des biomatériaux, de la médecine régénérative et de la biologie cellulaire, telles que la compréhension du rôle des interactions cellule-matrice extracellulaire en 3D.

Le principal avantage de cette technique est qu’elle fournit une plate-forme de matériaux reproductible, accordable et modulaire qui se prête à l’étude de plusieurs types de cellules. Dans l’ensemble, la mise en œuvre de cette technique peut améliorer notre compréhension des paramètres critiques de signalisation ECM cellulaire qui pourraient dicter le succès des futures thérapies régénératives à base de cellules. Striez une plaque de gélose à l’ampicilline et au chloramphénicol avec un stock bactérien préfabriqué contenant un vecteur qui code pour l’ELP d’intérêt.

Ensuite, incubez la plaque striée à l’envers à 37 degrés Celsius pendant la nuit pour permettre la croissance bactérienne. Le lendemain, prélevez une seule colonie dans l’assiette et inoculez la culture de démarrage préchauffée. Incuber la culture dans un agitateur à 37 degrés Celsius pendant 16 heures.

Après la période d’incubation, à l’aide d’une pipette sérologique, transférer 20 millilitres de la culture de démarrage dans chaque flacon d’expression. Laissez l’expression agiter le ballon pendant une heure. Au bout d’une heure, mesurer la densité optique à 600 nanomètres d’une aliquote de la fiole d’expression.

Dès que la lecture atteint 0,6, réduisez la température de l’agitateur à 32 degrés Celsius. Lorsque la lecture atteint 0,8, ajoutez un millilitre d’une molaire stérile IPTG filtrée pour induire l’expression de l’ELP dans la fiole d’expression. Laissez la culture s’exprimer pendant sept heures.

Après sept heures, centrifuger le milieu d’expression à 12 000 x g pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius dans une centrifugeuse au sol. Après la centrifugation, à l’aide d’une spatule, prélever les granules de cellules dans le récipient de la centrifugeuse et les placer dans un sac ziploc pré-pesé. Ensuite, dissolvez la pastille cellulaire dans un tampon TEN filtré stérile.

Massez la pastille cellulaire pour former une solution homogène. Congelez le sac ziploc avec les granules de cellules en suspension dans un récipient secondaire à 80 degrés Celsius. À la pastille cellulaire décongelée, ajoutez environ 30 à 40 milligrammes de désoxyribonucléase et un millilitre de 100 millimolaires de PMSF pour 100 millilitres de lysat cellulaire.

Incuber le lysat à quatre degrés Celsius sur un agitateur pendant la nuit. Après le troisième cycle de congélation-décongélation, centrifuger les échantillons à au moins 15 000 x g pendant une heure à quatre degrés Celsius. Après la centrifugation, videz le surnageant du récipient de centrifugation et transférez la solution dans un nouveau récipient de centrifugation.

Pour chaque 100 millilitres de surnageant, ajoutez 5,84 grammes de chlorure de sodium en trois parties à une concentration molaire finale. Incuber la suspension dans un incubateur à 37 degrés Celsius pendant trois heures. Après l’incubation, centrifuger les échantillons à au moins 15 000 x g pendant une heure à 37 degrés Celsius.

Après la centrifugation, jetez le surnageant du récipient de centrifugation et mettez la pastille en masse. Ensuite, ajoutez 10 millilitres d’eau ultrapure autoclavée par gramme de granulé obtenu après centrifugation. Pour vous assurer que la protéine se dissout complètement, utilisez une spatule en métal pour écraser et remettre en suspension la pastille.

Incuber la pastille remise en suspension à quatre degrés Celsius pendant la nuit sur un agitateur orbital. Répétez les étapes de centrifugation à froid et à chaud pendant un total de trois cycles pour purifier davantage l’ELP. Ensuite, composez le surnageant résiduel dans une membrane de dialyse de 3,5 kilodaltons contre quatre litres d’eau ultrapure pré-refroidie à quatre degrés Celsius pendant trois jours pour dessaler la solution protéique.

Centrifuger la solution finale dialysée dans une centrifugeuse prérefroidie. Congelez le surnageant à 80 degrés Celsius dans un tube conique pré-pesé. Enfin, lyophilisez la solution congelée pendant trois jours, puis pesez le produit lyophilisé final pour déterminer le rendement en protéines.

À l’aide d’un poinçon de biopsie, créez des trous dans une feuille de silicone de 0,5 millimètre d’épaisseur. Découpez ensuite un carré autour de chaque trou. Ensuite, à l’aide d’une pince à épiler, retirez la pellicule plastique de chaque côté des moules individuels.

Après avoir retiré la pellicule plastique, utilisez la pince à épiler pour positionner le même nombre de moules en silicone nus et de lamelles en verre en rangées alternées sur le couvercle d’une plaque à 48 puits pour une liaison plasma ultérieure. Une fois que tous les matériaux de culture cellulaire ont été fabriqués, la préparation du type de cellule d’intérêt pour l’encapsulation d’hydrogel en aval peut commencer. Après avoir dissocié les cellules en une suspension unicellulaire, aliquote le nombre souhaité de cellules dans un tube à centrifuger de 1,5 millilitre.

Ensuite, centrifugez les cellules à environ 200 x g pendant trois minutes. Après la centrifugation, aspirez le surnageant et stockez la pastille sur de la glace. Remettre en suspension la pastille cellulaire dans la solution mère ELP à 80 % du volume final.

Ensuite, à l’aide d’une pipette, mélangez la solution en une suspension homogène de cellules dans ELP. Pour les 20 % restants du volume final, ajouter la solution mère de THPC à la suspension ELP en cellules. Pipeter plusieurs fois pour s’assurer de la formation d’un mélange homogène, tout en évitant la formation de bulles d’air.

Ensuite, dans un mouvement circulaire, pipetez le mélange de cellules ELP THPC dans chaque moule d’une plaque à 24 puits. Ensuite, incubez les échantillons à température ambiante pendant 15 minutes. Après 15 minutes, incubez les échantillons à 37 degrés Celsius pendant 15 minutes supplémentaires.

Une fois l’incubation terminée, ajoutez soigneusement 750 microlitres de milieu de culture cellulaire chaud dans chaque puits dans une plaque de 24 puits. Laissez l’hydrogel à 37 degrés Celsius pendant la durée de culture souhaitée. Tout d’abord, aspirez le milieu de chaque puits.

Lavez ensuite les puits avec un millilitre de DPBS chaud. Une fois le lavage terminé, ajoutez 750 microlitres de solution de fixation dans chaque puits. Ensuite, incubez la plaque à 24 puits à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes.

Après l’incubation, aspirez la solution de fixation de chacun des puits et jetez le fixateur dans un conteneur à déchets dangereux. Ensuite, ajoutez un millilitre de DPBS à l’échantillon et jetez immédiatement le DPBS dans un conteneur de déchets dangereux. Ensuite, ajoutez 750 microlitres de solution de perméabilisation pour perméabiliser l’échantillon pendant une heure à température ambiante sur le rocker à 15 tours par minute.

Après une heure, aspirez la solution de perméabilisation et ajoutez 750 microlitres de solution bloquante à l’échantillon. Laissez l’échantillon sur la bascule à température ambiante pendant trois heures. Diluez ensuite les anticorps primaires souhaités avec la solution de dilution d’anticorps.

Ensuite, ajoutez 500 microlitres de solution d’anticorps à chaque échantillon. Incuber les échantillons pendant la nuit à quatre degrés Celsius. Le lendemain, aspirez la solution d’anticorps primaires, puis lavez les échantillons avec du PBST pendant une heure trois fois à température ambiante à 15 tours par minute.

Ensuite, diluez les anticorps secondaires appropriés dans cinq milligrammes par millilitre de solution mère de DAPI pour obtenir une concentration finale de 2,5 microgrammes par millilitre. Ensuite, ajoutez 500 microlitres de la solution à chaque échantillon. Ensuite, utilisez du papier d’aluminium pour couvrir la plaque à 24 puits et incubez la plaque à quatre degrés Celsius pendant la nuit.

Le lendemain, aspirez la solution d’anticorps secondaire et lavez les échantillons avec du PBST trois fois chacun pendant 30 minutes à température ambiante sur une bascule. Ensuite, placez une goutte de support de montage rigide sur la surface d’une lame de verre et placez l’échantillon sur le support de montage. Enfin, utilisez du vernis à ongles pour sceller les échantillons sur la lame de couverture en verre afin d’éviter la contamination ou le mouvement de l’échantillon.

Ici, l’expression de la protéine cible avec l’ELP pleine longueur dans des conditions contrôlées est validée par la présence de bandes à 37 kilodaltons dans l’analyse SDS-PAGE et l’analyse par western blot. Cependant, dans des conditions non contrôlées, plusieurs bandes de faible poids moléculaire sont également visibles à l’aide du transfert Western. Les bandes de poids moléculaire inférieur correspondent à des protéines avec moins de quatre répétitions de domaine semblable à l’élastine, ce qui indique que la protéine n’est pas complètement traduite pendant l’expression.

Ce résultat est courant lorsque l’on effectue l’expression au-dessus de 32 degrés Celsius. Pour faire varier la concentration du ligand adhésif cellulaire tout en maintenant les propriétés mécaniques de l’hydrogel constantes, le rapport de la variante ELP contenant l’adhésif cellulaire dérivé de la fibronectine et les séquences adhésives non cellulaires est ajusté. De plus, les cellules progénitrices neurales murines sont également viables sur une période de sept jours lorsqu’elles sont encapsulées dans un hydrogel ELP à 3 %.

Les cellules vivantes sont identifiées en vert grâce à la coloration AM de la calcéine, tandis que l’homodimère rouge de l’éthidium est préférentiellement absorbé par les cellules mortes. Pour valider le phénotype des cellules souches des cellules progénitrices neurales, l’expression de marqueurs canoniques tels que Sox2 et la nestine est également visualisée par immunomarquage lorsque les cellules sont encapsulées dans les hydrogels 3D ELP. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’exprimer et de purifier la protéine de type élastine pour l’encapsulation en aval de divers types de cellules, et en outre, étudier le rôle du microenvironnement 3D dans la modulation du phénotype cellulaire.