Une tumeur modèle murin de stress chirurgical à explorer les mécanismes de l'immunosuppression postopératoire et évaluer de nouvelles immunothérapies périopératoires

L’objectif global de cette procédure est d’observer l’effet de l’immunothérapie administrée pendant la période périopératoire sur la réduction des métastases et un modèle murin de tumeur et de stress chirurgical. Ceci est accompli en injectant d’abord quatre cellules tumorales T one dans le coussinet adipeux à mémoire de souris afin d’établir une tumeur primaire. Le 13e jour ou un jour avant la chirurgie du cancer, une immunothérapie est administrée, ce qui est supposé atténuer la maladie métastatique postopératoire le 14e jour, après l’implantation de cellules tumorales.

La tumeur primaire est réséquée, suivie d’un stress chirurgical supplémentaire sous la forme d’une néphrectomie abdominale et d’un sous-ensemble de souris. La dernière étape consiste à sacrifier et à quantifier le nombre de nodules tumoraux pulmonaires métastatiques chez toutes les souris. En fin de compte, ce modèle murin de métastases spontanées et de stress chirurgical est utilisé pour montrer l’effet bénéfique de l’immunothérapie périopératoire.

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l’oncologie chirurgicale, telles que l’impact d’une intervention chirurgicale majeure sur le système immunitaire et, par conséquent, sur la formation d’une maladie métastatique dans la période postopératoire, et comment les thérapies immunitaires peuvent être utilisées pour atténuer cet effet. La démonstration de cette procédure sera faite par Christiano 10 dusa, un technicien de recherche et le laboratoire du Dr Rebecca pour mettre en place la culture de cellules tumorales. Commencez par placer 41 cellules tumorales non modifiées dans du DMEM complet dans des plaques de culture tissulaire de 10 centimètres et faites-les incuber à 37 degrés Celsius 5 % CO2 dans un incubateur de culture tissulaire.

Divisez les cultures deux à trois fois par semaine au besoin afin que les cellules ne dépassent pas 80 % de confluence. Dans le mois suivant la mise en place de la culture cellulaire, commencez à récolter les cellules tumorales en aspirant le milieu de culture à partir de la plaque de culture tissulaire. Ajoutez 10 millilitres d’un PBS stérile X contenant deux millilitres d’EDTA et incubez la plaque à 37 degrés Celsius, 5 % de CO2 pendant cinq à sept minutes.

Ensuite, après avoir retiré la solution de PBS de la plaque, rincez la plaque deux à trois fois avec du PBS et transférez les cellules dans un tube conique de 50 millilitres. Ensuite, centrifugez les cellules dans une centrifugeuse de paillasse à 500 G et quatre degrés Celsius pendant cinq minutes. Après l’aspiration, les surnageants remettent en suspension la pastille cellulaire et le DMEM libre de sérum.

Ensuite, utilisez un compteur de cellules pour déterminer la concentration cellulaire et diluez les cellules avec un milieu exempt de sérum à une fois 10 à six cellules par 500 microlitres et placez les cellules sur de la glace une heure avant la chirurgie. Injectez par voie sous-cutanée à une souris 0,05 milligramme de buprénorphine par kilogramme pour la gestion de la douleur. Après avoir anesthésié la souris avec du fluor ISO à 2,5 %, pincez le coussinet du pied pour assurer un niveau d’anesthésie adéquat.

Ensuite, chargez une seringue ultra fine d’un demi-pouce de calibre 30 avec précisément 50 microlitres de suspension de cellules tumorales. Tapotez le côté de la seringue pour déloger les bulles d’air. En continuant l’anesthésie au fluor ISO, placez la souris côté ventral vers le haut sur la table chirurgicale.

Introduisez maintenant l’aiguille horizontalement et directement dans le quatrième coussinet adipeux à mémoire de forme et distribuez lentement le volume de la seringue. Cela devrait prendre environ une minute pour terminer l’injection. Utilisez un coton-tige pour nettoyer toute fuite après l’injection.

Laissez la souris se remettre de l’anesthésie avant de la remettre dans sa cage. Poursuivez la gestion de la douleur en administrant 0,05 milligramme par kilogramme de buprénorphine par voie sous-cutanée toutes les huit heures pendant deux jours à 13 jours d’injection de cellules postum. Utilisez un pied à coulisse externe pour mesurer la taille de la tumeur primaire.

Mesurez le plus grand diamètre ou la plus grande longueur longitudinale et le plus grand diamètre ou la plus grande largeur transversale à l’aide d’un pied à coulisse. La formule ellipsoïdale modifiée est utilisée pour calculer le volume tumoral comme la moitié de la longueur multipliée par la largeur au carré. À ce stade, en supposant que la tumeur primaire mesure environ un centimètre cube, le réactif de traitement périopératoire de choix, qui dans ce cas est un virus oncolytique dans un x, PBS stérile, a été préparé.

Chargez une seringue à insuline d’un demi-pouce de calibre 27 avec précisément 100 microlitres de la thérapie virale oncolytique. Retirez toutes les bulles d’air de la seringue. Ensuite, placez une souris dans une contention, en laissant la queue accessible.

À l’aide d’eau chaude du robinet, chauffez doucement la queue. Pour visualiser les veines latérales de la queue, sélectionnez la veine latérale de la queue et injectez-lui le virus oncolytique. Si l’aiguille est correctement insérée dans une veine latérale, aucune résistance ne doit être ressentie lors de l’enfoncement de la seringue.

Une fois terminé, remettez la souris dans sa cage pendant la nuit à 14 jours d’injection de cellules postum. Traitez la souris par voie sous-cutanée avec 0,05 milligramme par kilogramme de buprénorphine une heure avant la chirurgie pour la gestion de la douleur, induisez et maintenez l’anesthésie à l’aide de fluor ISO à 2,5 %. Après avoir fait une incision cutanée d’un à deux centimètres, retirez doucement l’ensemble de la tumeur primaire du coussinet adipeux mammaire, la tumeur et tous les débris attachés doivent sortir en un seul morceau.

Conservez la tumeur dans Formin pour une analyse immunohistochimique ultérieure. Après l’excision de la tumeur, fermez l’incision avec deux à trois agrafes de neuf millimètres. L’étape suivante consiste à effectuer une intervention chirurgicale majeure sur un sous-ensemble de souris.

Commencez par une incision médiane ventrale à travers la peau et la couche sous-cutanée. Faites ensuite une incision de trois à quatre centimètres au niveau du coude linéaire pour accéder au péritoine. Maintenant, déplacez les intestins sus-jacents d’un côté pour exposer le côté intérieur gauche de l’abdomen.

Gardez les intestins humides avec une gaze stérile imbibée de solution saline. Ensuite, à l’aide d’une paire de pinces chirurgicales émoussées, saisissez doucement le rein gauche. Ensuite, utilisez une suture en soie tressée enduite de cire 3.0 attachée dans une boucle pour ligaturer le hile du rein gauche.

Fixez la suture avec trois nœuds chirurgicaux. Retirez maintenant le rein gauche avec des ciseaux chirurgicaux. Inspectez soigneusement le lien de suture pour vous assurer qu’une hémostase adéquate est obtenue.

Ensuite, fermez la couche sous-cutanée avec une suture en boucle continue à l’aide de cinq sutures résorbables tressées. Agrafez ensuite la couche de peau à l’aide d’agrafes de neuf millimètres. La néphrectomie devrait durer 10 minutes par animal.

Une fois rétabli, remettez l’animal dans sa cage et continuez à gérer la douleur pendant deux jours en administrant 0,05 milligramme par kilogramme de buprénorphine sous-cutanée toutes les huit heures à 28 jours après l’injection de quatre T une tumeur, euthanasiez la souris et vaporisez-la avec de l’éthanol à 70 %. Commencez l’ablation du poumon en utilisant des ciseaux pour faire une incision initiale juste en dessous de la cage thoracique. Coupez la peau et la couche sous-cutanée le long de la ligne médiane ventrale de la cavité thoracique pour exposer le thorax.

Faites ensuite des incisions latérales à travers la peau et les tissus de chaque côté jusqu’au cou. Maintenant, saisissez doucement les poumons tout en coupant le tissu conjonctif jusqu’à ce que les poumons soient libres. Coupez la trachée au-dessus de la bifurcation, qui maintiendra les lobes gauche et droit ensemble.

Ensuite, trempez les poumons extraits dans du PBS froid pour éliminer tout sang résiduel et placez-les dans une finition de formine tamponnée à 10 % en photographiant les poumons pour l’évaluation des métastases tumorales et en les pesant pour la quantification de la charge tumorale. 14 jours après la résection tumorale à quatre T, les poumons ont été prélevés et visualisés pour les métastases montrées ici comme le poumon d’une souris qui n’a pas eu de néphrectomie abdominale. Certaines tumeurs métastasées sont visibles.

En revanche, une néphrectomie chirurgicale immédiatement après la résection de la tumeur a entraîné une augmentation visible du nombre de métastases pulmonaires. Cette photographie montre les poumons d’une souris traitée par le virus oncolytique après résection tumorale et néphrectomie illustrés ici sont les poumons d’une souris traitée avec un vaccin antigrippal après résection tumorale et néphrectomie Le comptage des nodules tumoraux pulmonaires dans chacune de ces catégories montre une nette augmentation du nombre de métastases pulmonaires et de souris ayant subi une néphrectomie par rapport à celles sans chirurgie, ou ceux avec une intervention thérapeutique préopératoire. Les poumons des souris ayant subi une néphrectomie, mais aucun traitement préopératoire, pèsent beaucoup plus que les autres catégories de tests.

Ainsi, l’administration préopératoire du virus oncolytique réplicatif et du vaccin antigrippal inactivé a permis de sauver de manière significative les effets prométastatiques d’une intervention chirurgicale majeure après une résection tumorale. Ces graphiques montrent le nombre de tumeurs pulmonaires chez les souris avec un nombre normal ou intact de cellules NK et chez les souris dont les cellules NK étaient pharmacologiquement appauvries à l’aide d’anasi ALO GM one. Les souris appauvries en NK ont eu un effet thérapeutique réduit des immunothérapies périopératoires par virus oncolytique ou vaccin antigrippal.

Cela suggère que les cellules NK jouent un rôle médiateur dans la prévention des métastases après le traitement vaccinal. Pour caractériser davantage la fonction des cellules NK, la destruction ex vivo des cellules NK a été évaluée en purifiant les cellules positives DX cinq à partir de contrôles soumis à un stress chirurgical et non traités ont été cultivées avec des cellules cibles Yak One. La ligne continue noire indique la capacité de destruction des cellules NK des souris non traitées et la ligne pointillée noire démontre la capacité de destruction des cellules NK des souris soumises à un stress chirurgical.

La diminution du pourcentage de cytotoxicité montrée par le décalage vers le bas de la ligne continue noire à la ligne pointillée noire démontre un défaut de la fonction cytotoxique des cellules NK et des souris après la chirurgie. Les lignes continues grises indiquent la destruction des cellules NK de souris qui ont reçu une immunothérapie, soit un virus oncolytique, soit un vaccin contre la grippe, mais pas de chirurgie. Les lignes pointillées grises indiquent la capacité de destruction des cellules NK chez les souris qui ont reçu à la fois une immunothérapie périopératoire et une intervention chirurgicale.

La diminution du pourcentage de cytotoxicité montrée par le décalage vers le bas de la ligne continue grise à la ligne pointillée grise démontre un défaut de la fonction cytotoxique des cellules NK et des souris après une intervention chirurgicale malgré une immunothérapie périopératoire. Plus important encore, les pointillés gris sont toujours beaucoup plus hauts que les pointillés noirs. Cela suggère qu’il pourrait être possible de sauver le dysfonctionnement cytotoxique des cellules NK induit par la chirurgie avec une immunothérapie périopératoire.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de créer un modèle animal de métastases spontanées et de stress chirurgical en établissant les meilleures tumeurs primaires. Résection des tumeurs primaires induisant un stress chirurgical supplémentaire par néphrectomie et évaluation des nodules tumoraux métastatiques pulmonaires au point final. De plus, vous devez comprendre comment ce modèle peut être utilisé pour étudier les effets suppresseurs de la chirurgie sur le système immunitaire inné et la capacité des immunothérapies à inverser cet effet.