Name: Lutilisation des tableaux cibles fluorescentes pour lévaluation des réponses des cellules T In vivo (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 9 s
Description: Apprenez à générer des tableaux cibles fluorescents pour évaluer les réponses des cellules T in vivo par cytométrie en flux. Cette méthode permet de mesurer simultanément plus de 250 paramètres immunologiques.

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Ce travail a été soutenu par des subventions du projet # 1010395 (BQ et CP) et # 525431 (CR), et un programme de subventions # 455395 (CP) du Conseil de recherches en santé et médical national de l&#39;Australie, un Centre australien pour l&#39;hépatite et le VIH Virologie EOI 2012 subvention (CR et JJR) et une subvention de la Fondation Gordon Bouvier et Gretel (BQ et CR). Nous tenons à remercier Harpreet Vohra et Michael Devoy pour leur excellent entretien du laboratoire JCSMR FACS, le Fonds australien Cancer Research Foundation biomoléculaire ressources, JCSMR, ANU, pour la synthèse peptidique, et le Dr David Boyle, CSIRO animaux laboratoires de santé, Geelong, Australie pour fournir les mères VIH stocks de vaccins.

<ol><li>Quah, B. J., Wijesundara, D. K., Ranasinghe, C., Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+target+array+killing+assay%3A+A+multiplex+cytotoxic+T-cell+assay+to+measure+detailed+T-cell+antigen+specificity+and+avidity+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Fluorescent target array killing assay: A multiplex cytotoxic T-cell assay to measure detailed T-cell antigen specificity and avidity in vivo.</a> Cytometry A. 81, 679-690 (2012).</li>
<li>Quah, B. J., Wijesundara, D. K., Ranasinghe, C., Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+target+array+T+helper+assay%3A+a+multiplex+flow+cytometry+assay+to+measure+antigen-specific+CD4%2B+T+cell-mediated+B+cell+help+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Fluorescent target array T helper assay: a multiplex flow cytometry assay to measure antigen-specific CD4+ T cell-mediated B cell help in vivo.</a> J Immunol Methods. 387, 181-190 (2013).</li>
<li>Quah, B. J., Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+and+improved+methods+for+measuring+lymphocyte+proliferation+in+vitro+and+in+vivo+using+CFSE-like+fluorescent+dyes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">New and improved methods for measuring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo using CFSE-like fluorescent dyes.</a> J Immunol Methods. 379, 1-14 (2012).</li>
<li>Mata, M., Paterson, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Th1+T+cell+responses+to+HIV-1+Gag+protein+delivered+by+a+Listeria+monocytogenes+vaccine+are+similar+to+those+induced+by+endogenous+listerial+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Th1 T cell responses to HIV-1 Gag protein delivered by a Listeria monocytogenes vaccine are similar to those induced by endogenous listerial antigens.</a> J Immunol. 163, 1449-1456 (1999).</li>
<li>Earl, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+evaluation+of+multi-gene%2C+multi-clade+HIV-1+MVA+vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Design and evaluation of multi-gene, multi-clade HIV-1 MVA vaccines.</a> Vaccine. 27, 5885-5895 (2009).</li>
<li>Wild, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preclinical+evaluation+of+the+immunogenicity+of+C-type+HIV-1-based+DNA+and+NYVAC+vaccines+in+the+Balb%2FC+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Viral+Immunol%22%5BJournal%5D)">Preclinical evaluation of the immunogenicity of C-type HIV-1-based DNA and NYVAC vaccines in the Balb/C mouse model.</a> Viral Immunol. 22, 309-319 (2009).</li>
<li>Takeshita, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+analysis+of+the+same+HIV+peptide+functionally+binding+to+both+a+class+I+and+a+class+II+MHC+molecule%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Molecular analysis of the same HIV peptide functionally binding to both a class I and a class II MHC molecule.</a> J Immunol. 154, 1973-1986 (1995).</li>
<li>Krutzik, P. O., Nolan, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+cell+barcoding+in+flow+cytometry+allows+high-throughput+drug+screening+and+signaling+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fluorescent cell barcoding in flow cytometry allows high-throughput drug screening and signaling profiling.</a> Nature Methods. 3, 361-368 (2006).</li>
<li>Gilbert, D. F., Wilson, J. C., Nink, V., Lynch, J. W., Osborne, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+labeling+of+viable+cells+for+high-throughput+analysis+of+glycine+receptor+function+using+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Multiplexed labeling of viable cells for high-throughput analysis of glycine receptor function using flow cytometry.</a> Cytometry A. 75, 440-449 (2009).</li>
<li>Quah, B. J., Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+carboxyfluorescein+diacetate+succinimidyl+ester+%28CFSE%29+to+monitor+lymphocyte+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">The use of carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) to monitor lymphocyte proliferation.</a> J Vis Exp. , (2010).</li>
<li>Quah, B. J., Warren, H. S., Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+lymphocyte+proliferation+in+vitro+and+in+vivo+with+the+intracellular+fluorescent+dye+carboxyfluorescein+diacetate+succinimidyl+ester%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Monitoring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo with the intracellular fluorescent dye carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester.</a> Nat Protoc. 2, 2049-2056 (2007).</li>
<li>Durward, M., Harms, J., Splitter, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen+specific+killing+assay+using+CFSE+labeled+target+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Antigen specific killing assay using CFSE labeled target cells.</a> J Vis Exp. , (2010).</li>
<li>Hermans, I. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+VITAL+assay%3A+a+versatile+fluorometric+technique+for+assessing+CTL-+and+NKT-mediated+cytotoxicity+against+multiple+targets+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">The VITAL assay: a versatile fluorometric technique for assessing CTL- and NKT-mediated cytotoxicity against multiple targets in vitro and in vivo.</a> J Immunol Methods. 285, 25-40 (2004).</li>
<li>Busch, D. H., Pamer, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+affinity+maturation+by+selective+expansion+during+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">T cell affinity maturation by selective expansion during infection.</a> J Exp Med. 189, 701-710 (1999).</li>
<li>Savage, P. A., Boniface, J. J., Davis, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+kinetic+basis+for+T+cell+receptor+repertoire+selection+during+an+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">A kinetic basis for T cell receptor repertoire selection during an immune response.</a> Immunity. 10, 485-492 (1999).</li>
<li>Wang, X. L., Altman, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caveats+in+the+design+of+MHC+class+I+tetramer%2Fantigen-specific+T+lymphocytes+dissociation+assays%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Caveats in the design of MHC class I tetramer/antigen-specific T lymphocytes dissociation assays.</a> J Immunol Methods. 280, 25-35 (2003).</li>
<li>von Essen, M. R., Kongsbak, M., Geisler, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+behind+functional+avidity+maturation+in+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Dev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Mechanisms behind functional avidity maturation in T cells.</a> Clin Dev Immunol. , (2012).</li>
<li>Prussin, C., Metcalfe, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+intracytoplasmic+cytokine+using+flow+cytometry+and+directly+conjugated+anti-cytokine+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Detection of intracytoplasmic cytokine using flow cytometry and directly conjugated anti-cytokine antibodies.</a> J Immunol Methods. 188, 117-128 (1995).</li>
<li>Foster, B., Prussin, C., Liu, F., Whitmire, J. K., Whitton, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+intracellular+cytokines+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Immunol%22%5BJournal%5D)">Detection of intracellular cytokines by flow cytometry.</a> Curr Protoc Immunol. , (2007).</li>
<li>Czerkinsky, C. C., Nilsson, L. A., Nygren, H., Ouchterlony, O., Tarkowski, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+solid-phase+enzyme-linked+immunospot+%28ELISPOT%29+assay+for+enumeration+of+specific+antibody-secreting+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">A solid-phase enzyme-linked immunospot (ELISPOT) assay for enumeration of specific antibody-secreting cells.</a> J Immunol Methods. 65, 109-121 (1983).</li>
<li>Klinman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ELISPOT+assay+to+detect+cytokine-secreting+murine+and+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Immunol%22%5BJournal%5D)">ELISPOT assay to detect cytokine-secreting murine and human cells.</a> Curr Protoc Immunol. , (2008).</li>
<li>Yerly, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+cytotoxic+T-lymphocyte+epitope+variant+cross-recognition+and+functional+avidity+are+associated+with+hepatitis+C+virus+clearance%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Increased cytotoxic T-lymphocyte epitope variant cross-recognition and functional avidity are associated with hepatitis C virus clearance.</a> J Virol. 82, 3147-3153 (2008).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent qu&#39;ils n&#39;ont aucun intérêt financier concurrents.

L&#39;avantage de tests basés sur l&#39;ALE est qu&#39;elles permettent la discrimination de&gt; 250 populations de cellules cibles viable et pleinement fonctionnel à partir d&#39;un seul animal hôte par cytométrie de flux. Cela fournit un niveau de complexité vivo découler des essais in base cytométrie qui n&#39;a pas été possible avant. Cela est mis en évidence dans les deux expériences sur les animaux indiqués ci-dessus, où les réponses à 7 épitopes viraux distincts à 6 concentrations pourraient êtr...

Lymphocytes T jouent un rôle central dans la réponse immunitaire adaptative et sont souvent la cible de la manipulation dans l&#39;immunothérapie. Cellules CD4 + T effecteurs répondent à un antigène étranger en sécrétant des cytokines qui régulent de nombreux aspects de l&#39;immunité et peuvent aussi aider directement les cellules B à fabriquer des anticorps. Cellules T cytotoxiques CD8 + (CTL) peuvent également répondre à un antigène étranger en sécrétant des cytokines ainsi que de jouer un rôle central à tuer directement les cellules exprimant un antigène étranger. L&#39;interaction fondamentale qui initie ces fonctions effectrices des cellules T implique l&#39;interaction du récepteur de lymphocyte T (TCR) avec des peptides étrangers présentés sur les molécules du CMH à la surface des cellules. Cellules T CD4 + reconnaissent peptides présentés sur les molécules du CMH de classe II sur les cellules présentatrices de l&#39;antigène et des cellules T CD8 + reconnaissent peptides présentés sur les molécules du CMH de classe I qui sont habituellement affichées sur les cellules microbiennes infectés. Pourafin d&#39;évaluer le rôle des cellules T jouent dans une réponse immunitaire, il est indispensable que leurs fonctions effectrices sont mesurées par des techniques fiables et sensibles. Des méthodes communes pour l&#39;évaluation de la réponse T cellulaire comprennent; CMH class-I/II/peptide tétramère réactivité; la production de cytokine par ELISPOT et coloration des cytokines intracellulaires; et tuant capacité de 51 Cr-tests de libération. Ces tests, cependant, sont généralement effectuées ex vivo avec une stimulation in vitro, ou donnent un aperçu limité dans la fonction des cellules T. Idéalement, lorsque l&#39;on mesure les réponses des cellules T, il serait bénéfique pour les évaluer in situ, in vivo, car ils se produisent, sans aucune manipulation de cellules T de manière à éviter des changements dans les paramètres de fonctionnement qui peuvent se produire par la stimulation in vitro. Parmi les plus couramment utilisés in vivo de cellules T des tests fonctionnels sont basées sur la mesure de meurtre CTL médiée par les cellules cibles marquées avec des peptides du CMH de classe I-contraignantes, qui sont énumérés in vivovia leur détection par marquage fluorescent avec des colorants vitaux tels que CFSE. Bien que ces types d&#39;essais peuvent surveiller meurtre CTL médiation de cibles quand ils se produisent in vivo, ils ont déjà eu une capacité relativement limitée pour évaluer assassinat de cibles multiples présentant différentes concentrations et différents types d&#39;épitopes peptidiques, qui est nécessaire pour permettre paramètres qualitatifs tels avidité fonctionnelle et comme variante de l&#39;épitope de réactivité croisée à évaluer. Ces essais ne fournissent pas d&#39;informations sur les réponses à médiation cellulaire T CD4 +. Pour surmonter bon nombre des difficultés avec les méthodes actuelles utilisées pour évaluer les réponses des lymphocytes T, nous avons récemment mis au point un test multiplex sur la base de tableaux fluorescentes cibles (ALE), qui permet le suivi des réponses des lymphocytes T contre&gt; 250 cellules cibles simultanément dans un animal par la cytométrie de flux 1, 2. ALE sont constitués de lymphocytes marqués par sevconcentrations et combinaisons sieurs de colorants vitaux comme CFSE, CTV et DPC permettant&gt; 250 groupes de cellules de fluorescence unique à être générés. Étant donné que ces cellules restent viables et totalement fonctionnel, elles peuvent être injectées dans des animaux pour permettre la surveillance de leur interaction avec les cellules in vivo 3 T effectrices. Par exemple, les agrégats de cellules ALE peuvent être puisées avec des peptides de classe I du CMH de liaison pour permettre une évaluation de la mise à mort médiée par des CTL spécifiques de l&#39;antigène des cellules cibles 1. En outre, les agrégats de cellules d&#39;ALE peut également être puisées avec des peptides du CMH de classe II se liant, ce qui permet l&#39;évaluation de spécifique cellulaire de l&#39;antigène T auxiliaire (T H) de l&#39;activité par l&#39;évaluation de l&#39;activation (par évaluation des marqueurs d&#39;activation tels que CD69, CD44 et / ou CD62L) des cellules B dans l&#39;ALE portant peptide apparenté 2. Depuis plus de 250 cibles peuvent être détectés simultanément, il est possible de mesurer de CTL et T H réponses contre de nombreux amas de cellules cibles puisées avec npeptides ombreux à différentes concentrations et l&#39;inclusion de nombreux répétitions. Le test FTA fournit donc un niveau de T effecteur cellulaire évaluation de la réponse in vivo sans précédent. Ici, nous décrivons en détail la construction d&#39;un ALE et montrons comment ils peuvent être appliqués à l&#39;évaluation des réponses des lymphocytes T in vivo. Le mode opératoire décrit la construction d&#39;un FTA composé de 252 groupes de cellules discernables par l&#39;utilisation de trois colorants vitaux, composés de six répétitions de 42 groupes de cellules puisées avec des peptides de liaison II-CMH de classe I et. L&#39;étiquetage des 42 groupes de cellules se produit dans 10 ml conique à fond des tubes et il est utile de prévoir ceux-ci dans un porte-tube, comme décrit dans le Tableau 1. Cette méthode peut être ajustée pour un plus petit nombre de grappes discernables au besoin, en réduisant la quantité d&#39;étiquetage de chaque colorant a effectué 1. Nous soulignons l&#39;utilité de l&#39;analyse en montrant comment il peut mesurer responsabes générés par la vaccination poxvirus recombinant contre plusieurs épitopes dans une petite cohorte de souris. Ceci montre comment le dosage ALE peut être utilisée pour mesurer les réponses cumulatives et avidité fonctionnelle par le biais, respectivement, l&#39;utilisation de l&#39;aire sous la courbe (AUC) et les évaluations mesure de la concentration de peptide efficace nécessaire pour générer des réponses maximales moitié (CE 50).

<table><tbody><tr><td>RPMI</td><td>Sigma</td><td>R8758</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal</td><td>Serana</td><td>FCS-500</td><td></td></tr><tr><td>CTV</td><td>Invitrogen</td><td>C34557</td><td></td></tr><tr><td>CFDA, SE</td><td>Invitrogen</td><td>C1157</td><td></td></tr><tr><td>CPD</td><td>eBioscience</td><td>65-0840-90</td><td></td></tr><tr><td>anti-B220 PerCp-Cy5.5</td><td>eBioscience</td><td>110730</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD69 violet brillant 605</td><td>Biolegend</td><td>104529</td><td></td></tr><tr><td>PKH-26</td><td>Sigma</td><td>PKH26GL-1KT</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>Scientific Industries Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cytomètre en flux (Fortessa ou équivalent avec source laser bleue, rouge et violette)</td><td>BD Bioscience</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

l&#39;utilisation des tableaux cibles fluorescentes pour l&#39;évaluation des réponses des cellules t<em&gt; in vivo</em

The Use of Fluorescent Target Arrays for Assessment of T Cell Responses In vivo

La capacité de surveiller les réponses des lymphocytes T in vivo est importante pour le développement de la compréhension de la réponse immunitaire et les immunothérapies. Nous décrivons ici l&#39;utilisation de la matrice cible fluorescente (ALE) de la technologie, qui utilise des colorants vitaux tels que l&#39;ester carboxyfluoroscéine succinimidylique (CFSE), laser violet colorants excitables (CellTrace Violet: CTV) et laser rouge colorants excitables (prolifération cellulaire Dye eFluor 670: DPC ) à combinatoire lymphocytes de souris d&#39;étiquettes dans&gt; 250 discernables amas de cellules fluorescentes. amas de cellules au sein de ces ALE peuvent être puisées avec majeur d&#39;histocompatibilité (CMH) des peptides de liaison de classe I et du CMH de classe II et ainsi agir comme cellules cibles pour CD8 + et les cellules T CD4 +, respectivement. Ces cellules ALE restent viables et entièrement fonctionnel, et peuvent donc être administrés à des souris pour permettre l&#39;évaluation de CD8 + T meurtre à médiation cellulaire des cellules cibles de l&#39;ALE et T CD4 + hel médité cellulairep B de FTA cellules cibles des cellules en temps réel in vivo par cytométrie de flux. Depuis&gt; 250 cellules cibles peuvent être évaluées à la fois, la technique permet la surveillance des réponses des lymphocytes T contre plusieurs épitopes antigéniques à plusieurs concentrations, et dans de multiples répétitions. En tant que tel, la technique permet de mesurer les réponses des lymphocytes T à la fois quantitative (par exemple, l&#39;ampleur cumulée de la réponse) et un (avidité fonctionnelle par exemple. Épitope et-réactivité croisée de la réponse) qualitative niveau. Ici, nous décrivons comment ces ALE sont construits et donnent un exemple de la manière dont ils peuvent être appliqués afin d&#39;évaluer les réponses des cellules T induites par un vaccin contre le virus de la variole recombinant.

A titre d&#39;exemple de l&#39;utilisation du dosage FTA, une souris BALB / c a été immunisée avec un virus recombinant de la vaccine (VV) exprimant des épitopes du VIH-I (VV-VIH) et les réponses aux épitopes du VIH-I CTL, Gag, mut Gag, Env et Pol, la VV CTL épitopes F2L et F2L mut, et l&#39;épitope du VIH-I T H, Gag Th (comme décrit en 2) ont été évalués à l&#39;aide d&#39;un paramètre 252 ALE essai (figure 1B). variantes d&#39;épitopes de Gag (mut Gag) et F2L (F2L mut) ne sont pa...

La capacité de surveiller les réponses des cellules T en détail in vivo est importante pour le développement de la compréhension de la réponse immunitaire. Nous décrivons ici l&#39;utilisation de réseaux de cibles fluorescentes (ALE) dans un test in vivo de cellules T en évaluant&gt; 250 paramètres simultanément par cytométrie de flux.

L&#39;utilisation des tableaux cibles fluorescentes pour l&#39;évaluation des réponses des cellules T<em&gt; In vivo</em

The ability to monitor T cell responses in vivo is important for the development of our understanding of the immune response and the design of ...

L'objectif général de cette procédure est de générer un réseau pouvant atteindre 252 cellules cibles fluorescentes distinctement marquées pour des dosages immunitaires utilisant la cytométrie en flux multiparamétrique. Cette étape est réalisée en marquant d'abord les lymphocytes cibles avec des combinaisons uniques et des intensités variables de colorants vitaux tels que le CFSE et le CTV. L'étape suivante consiste à exposer chaque population distincte de lymphocytes cibles à des épitopes peptidiques candidats se liant aux molécules de classe I et de classe II du CMH.Cela est suivi par un lavage approfondi des cellules afin de préserver la spécificité des épitopes, puis par la mise en commun des cellules et leur injection dans un animal. Les étapes finales consistent à prélever les cellules portant le réseau de marqueurs fluorescents à partir de tissus spécifiques, à les marquer et à évaluer les réponses spécifiques aux peptides du CMH. En définitive, les résultats de cytométrie en flux peuvent révéler des réponses de lymphocytes T cytotoxiques en mesurant la mort des cellules cibles, et peuvent également montrer des réponses des lymphocytes T auxiliaires CD4 positifs en mesurant l

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