L'utilisation des tableaux cibles fluorescentes pour l'évaluation des réponses des cellules T In vivo

L’objectif global de cette procédure est de générer un réseau de jusqu’à 252 cellules cibles fluorescentes distinctement marquées pour des tests immunitaires à l’aide de la cytométrie en flux multiparamétrique. Pour ce faire, on marque d’abord les lymphocytes cibles avec des combinaisons et des intensités uniques de colorants vitaux tels que le CFSE et le CTV. L’étape suivante consiste à pulser chaque population lymphocytaire cible distincte avec des épitopes peptidiques de liaison du CMH de classe un et de classe deux du CMH.

S’ensuit un lavage approfondi des cellules pour maintenir la spécificité des épitopes, puis un regroupement des cellules et leur injection dans un animal. Les dernières étapes consistent à récolter les cellules du réseau de marqueurs fluorescents dans des tissus spécifiques, à les marquer et à évaluer les réponses spécifiques aux peptides du CMH. En fin de compte, les résultats de la cytométrie en flux peuvent montrer des réponses CTL en mesurant la mort cellulaire cible et ils peuvent montrer des réponses T auxiliaires positives CD quatre en mesurant la régulation positive des marqueurs d’activation de la cible des cellules B Sur le principal avantage de cette technique par rapport aux tests CTL in vivo conventionnels est qu’elle permet une mesure simultanée de plus de 250 cellules cibles chez un animal, démontrant que la procédure sera Ben Quire, un chercheur dans mon laboratoire.

La procédure nécessite des lymphocytes prélevés dans la rate et / ou les ganglions lymphatiques isolés de souris, filtrés et remis en suspension jusqu’à 200 millions de cellules par millilitre dans 11,5 millilitres de RPMI contenant 5 % de sérum de veau fœtal. La préparation de la FDA commence par l’étiquetage. 42 tubes en plastique à fond conique de 10 millilitres de un à 42 dans toutes les cellules seront pulsés avec sept épitopes peptidiques différents à six concentrations différentes, répétés six fois pour générer 252 amas de cellules discernables.

Maintenant, résanimez soigneusement les lymphocytes en inversant le tube plusieurs fois. Ajoutez ensuite 1,9 millilitre de suspension cellulaire aux tubes de 10 millilitres étiquetés 37 à 42. En prenant soin de ne pas mouiller la moitié supérieure des tubes.

Maintenant, débouchez le tube 38 et posez-le horizontalement jusqu’au sommet du tube 38. Ajouter 83 microlitres de PBS. Ajoutez ensuite 17 microlitres du stock CTV approprié tel que présenté dans le tableau deux du protocole texte.

Une fois le tube chargé, vortexez-le. Répétez cette opération avec les tubes 39 à 42. S’assurer que chaque tube reçoit un stock CTV différent, comme indiqué dans le tableau deux.

Incuber maintenant les cellules pendant au moins cinq minutes à température ambiante. Ajoutez ensuite cinq millilitres de RPMI contenant 5 % de FCS dans chaque tube Remettez soigneusement les cellules en suspension en tourbillonnant à partir de chaque tube. Transférez un millilitre de suspension dans six autres tubes en suivant le schéma de charge suggéré décrit dans le protocole textuel Lors de chaque transfert, il reste important de ne pas mouiller la partie supérieure du tube chargé pour étiqueter les cellules avec CFSE, retirer les capuchons des tubes 31 à 36 contenant un millilitre de cellules et poser les tubes horizontalement à côté de chacun des tubes.

Tout d’abord, ajoutez 103 microlitres de PBS, en l’éjectant sur la paroi supérieure sèche. Ajoutez ensuite sept microlitres de la crosse CFSE appropriée selon le tableau trois du protocole de texte et tourbillonnez immédiatement le tube. Répétez cette opération avec les tubes tels qu’ils sont regroupés dans le tableau trois.

S’assurer que chaque tube reçoit une action CFSE différente. Incuber tous les tubes pendant au moins cinq minutes à température ambiante. Après avoir attendu cinq minutes, lavez les cellules pour terminer l’étiquetage.

Diluez chaque suspension avec neuf millilitres de RPMI à température ambiante avec 5 % de FCS. Granulez les cellules à 300 GS pendant 10 minutes à température ambiante et éliminez les surnageants par aspiration à l’aide d’une pipette de transfert ; la préparation des peptides de liaison du CMH de classe un et de classe deux du CMH est présentée dans le protocole de texte. Cette section montre comment marquer par impulsion les cellules avec ces peptides.

Tout d’abord, remettez en suspension la pastille cellulaire dans un milieu résiduel, par exemple en faisant passer les tubes le long d’un gril. Portez ensuite le volume total de la suspension cellulaire à 250 microlitres dans notre PMI contenant 5 % de FCS. Chaque granule de cellule devrait avoir besoin d’environ 200 microlitres de fluide.

Ensuite, ajoutez 250 microlitres de stocks de peptides pré-préparés énumérés dans le tableau cinq dans les tubes désignés. Suivez le modèle présenté dans le tableau un et assurez-vous d’inclure un tube de contrôle de PBS seul pour calculer les réponses des lymphocytes T. Il est essentiel que chaque épitope peptidique et chaque concentration peptidique soient attribués à un seul tube et que cela soit clairement enregistré en fonction de la fluorescence attendue des cellules de ce tube.

Étant donné que la signature fluorescente de cet amas définira ce peptide, mélangez chaque suspension cellulaire par vortex, puis incubez les cellules à 37 degrés Celsius pendant une heure. Après l’incubation, procédez au lavage des cellules pour laver les cellules. Tout d’abord, ajoutez cinq millilitres de RPMI glacé avec 5 % de FCS dans chaque suspension de cellule et remettez les cellules en suspension en inversant les tubes.

Ensuite, sous-couche soigneusement chaque suspension cellulaire avec trois millilitres de sédiment FCS glacé, les cellules avec 10 minutes de rotation à 300 G maintenues à quatre degrés Celsius. Utilisez une accélération et un freinage lents pour vous assurer que l’interface de la solution est maintenue dans chaque tube. Aspirez soigneusement le RPMI, puis aspirez le FCS en laissant la pastille de cellule lavée intacte.

Après avoir isolé les granules, lavez à nouveau les cellules jusqu’à ce que les granules soient lavées deux fois. Suspendez-les dans 10 millilitres de RPMI glacé avec 5 % de FCS et répétez la centrifugation après l’essorage des surnageants. Ensuite, regroupez toutes les populations dans un nouveau tube de 10 millilitres avec six millilitres de RPMI glacé contenant 5 % de sédiments FCS, les cellules regroupées par centrifugation et aspirant le NATANT SUP avec une pipette de transfert à ce stade de toute la procédure.

Six réplicats intra-test peuvent être générés en marquant les cellules d’impulsion peptidique avec six concentrations différentes de CPD. Tout d’abord, ajoutez 11,4 millilitres de RPMI à température ambiante contenant 5 % de FCS à la pastille de cellule mélangée et remettez complètement en suspension par pipetage. Deuxièmement, ajoutez 1,9 millilitre de suspension cellulaire à six nouveaux tubes de 10 millilitres étiquetés de A à F, en prenant soin de ne pas mouiller la moitié supérieure du tube.

Pour commencer à étiqueter les cellules avec le tube B non bouché de CPD et poser le tube horizontalement le long de la paroi sèche Tout d’abord, ajoutez 92 microlitres de PBS suivis d’un volume de CPD de stock selon le tableau quatre. Puis vortex le mélange. Répétez cette étape avec le tube C deux F en vous assurant que chaque tube reçoit un stock CPD différent, comme dans le tableau quatre.

Une fois tous les tubes mélangés, laissez-les incuber pendant cinq minutes à température ambiante. Ensuite, lavez les cellules deux fois, remettez-les en suspension dans 10 millilitres de milieu à température ambiante. Deuxièmement, faites-les tourner vers le bas et troisièmement, aspirez les surnageants avec une pipette de transfert.

Répétez ensuite le processus. Maintenant, regroupez toutes les cellules des tubes A à F en un seul tube dans huit millilitres de glace. Milieux froids.

Collectez les cellules en les faisant tourner vers le bas et procédez à l’injection des cellules dans les animaux et à l’analyse ultérieure par cytométrie en flux. Les détails sont donnés dans le protocole texte. Une souris de la Colombie-Britannique a été immunisée avec le virus de la vaccine recombinant exprimant les épitopes du VIH V un et les réponses à divers épitopes ont été évaluées à l’aide d’un test FTA à 252 paramètres.

Deux variantes d’épitopes, gag mute et FTL mute, n’ont pas été exprimées dans le vecteur, et des souris naïves ont également reçu une injection de FTA. Le TA a été discriminé des cellules de souris hôtes par le marquage P KH 26 et les cellules FTAB ont été discriminées par coloration des anticorps B 20 par cytométrie en flux. Chacune des six réplicats intra-animaux a été contrôlée en fonction de la fluorescence CPD Les cibles FTA exprimant les diverses concentrations d’épitopes ont été contrôlées en fonction de la fluorescence CFSE et CTV.

La fraction de destruction spécifique de chaque réplique a été évaluée en comparant la mort cellulaire en grappes FTA chez les animaux amorcés par rapport aux grappes FTA correspondantes chez les animaux naïfs. L’activité T auxiliaire a été évaluée en comparant la régulation positive du CD 69 par les lymphocytes B FTA chez les animaux amorcés par rapport aux grappes correspondantes de lymphocytes B FT a chez les animaux naïfs. D’après cette analyse, l’infection V-V-H-I-V a généré les réponses CTL les plus fortes contre l’épitope VV immunodominant F deux L avec 100 % des cellules cibles de la FDA pulsées avec 0,001 micromolaire ou plus de l’épitope retiré de la rate.

En plus des réponses CTL, le test FTA a également mesuré les réponses T auxiliaires en évaluant l’activation des cellules FTAB, exprimant l’épitope de liaison H-I-V-M-H-C de classe deux HIV gag th Cela a montré que l’activation des lymphocytes B spécifiques de l’antigène s’est produite chez les animaux amorcés, suggérant une génération de gag du VIH, effecteurs de lymphocytes T auxiliaires spécifiques du VIH. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de générer un réseau de cibles fluorescentes de plus de 250 cellules cibles.