A base Fluorescence-lymphocytaire Assay Convient pour Criblage à haut débit des petites molécules

L'objectif général de ce dosage des lymphocytes basé sur la fluorescence est d'identifier de nouvelles petites molécules immunomodulatrices. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l'immunologie concernant le mécanisme d'activation et d'inhibition des lymphocytes. Le principal avantage de cette fonction phénotypique et de ce dosage réside dans sa capacité à être adapté à la découverte de médicaments.

Le démonstrateur de la procédure sera Ahmed Fouda, étudiant diplômé de notre laboratoire. Sous une hotte de travail stérile, désinfecter le pelage d'une souris femelle Nurr77 GFP âgée de six à huit semaines à l'aide d'éthanol à 70 %, puis placer l'animal sur son côté droit. Ensuite, pratiquer une incision dans la peau et les muscles du quadrant abdominal supérieur gauche, localiser la rate et l'extraire, puis placer le tissu dans un milieu pour splénocytes placé sur de la glace.

Une fois que toutes les splènes ont été collectées, transférez les tissus dans une boîte de culture cellulaire de 10 centimètres carrés contenant cinq millilitres de milieu pour splénocytes préchauffé, puis utilisez le piston d'une seringue stérile pour broyer les tissus jusqu'à ce que la solution devienne trouble. Après un broyage approfondi dans le milieu pour splénocytes, filtrez la suspension cellulaire à travers un tamis cellulaire de 70 microns dans un tube de 50 millilitres afin d'éliminer tous les débris, puis centrifugez la suspension monocellulaire obtenue. Resuspendez le culot dans deux à trois millilitres de tampon d'hémolyse des globules rouges, puis arrêtez la réaction en ajoutant cinq millilitres de RPMI, ou un autre tampon approprié, après 20 à 30 secondes.

Ensuite, récupérez les cellules par une autre centrifugation et resuspendez le culot dans deux millilitres de milieu pour splénocytes afin de compter les cellules. Pour isoler les lymphocytes T, centrifugez à nouveau les cellules et resuspendez le culot dans un milieu RPMI sans sérum à une concentration de un fois dix puissance sept cellules par millilitre. Transférez les cellules dans un tube en polystyrène de cinq millilitres et mettez de côté un aliquot de 100 microlitres de splénocytes destiné à être utilisé ultérieurement pour l'évaluation de la pureté.

Ensuite, ajouter 50 microlitres par millilitre de sérum de rat normal aux cellules, suivi de l'ajout de 50 microlitres par millilitre de cocktail d'anticorps pour l'isolement des lymphocytes T avec un mélange doux. Après 10 minutes, incuber les cellules avec des billes magnétiques conjuguées à la streptavidine pendant deux minutes et demie. Puis, ajouter un milieu sans sérum aux cellules pour un volume final de deux millilitres et demi, et placer le tube dans un aimant d'isolement cellulaire pendant trois minutes.

À la fin de l'incubation, maintenir le tube dans l'aimant et verser le surnageant d'un seul mouvement dans un nouveau tube en polystyrène. Les cellules T peuvent alors être comptées. Ensemencer les cellules T dans une plaque 96 puits à fond rond à une concentration de 2,5 × 10⁵ cellules par puits, chaque puits contenant 200 µL de milieu frais pour splénocytes.

Ajouter l'interleukine 7 recombinante et les billes magnétiques CD3/CD28 dans les puits appropriés, puis placer la plaque dans un incubateur de culture cellulaire. Douze heures plus tard, homogénéiser délicatement la suspension cellulaire de chaque puits afin de dissocier les agrégats de cellules et de billes. Ensuite, transférer les suspensions cellulaires de chaque puits dans des tubes en polystyrène individuels de cinq millilitres.

Lorsque toutes les cellules ont été collectées, placer chaque tube de cellules dans l'aimant de séparation pendant cinq minutes, puis décantation des surnageants lorsque le tube est encore à l'intérieur de l'aimant, dans de nouveaux tubes en polystyrène à la fin de chaque incubation. Ensuite, recueillir les cellules par centrifugation et resuspendre les culots dans un milieu frais de splénocytes à une concentration de deux fois 10 à la puissance six cellules par millilitre. Pour le criblage à haut débit de petites molécules, répartir 40 microlitres de cellules par puits dans une plaque de 384 puits, puis traiter les puits appropriés avec le médicament ou le véhicule choisi pendant la période de traitement souhaitée dans l'incubateur de culture cellulaire.

30 minutes avant l'analyse de la GFP, colorer les cellules avec la concentration appropriée de solution de Hoechst, en répartissant soigneusement le colorant par pipetage doux. Une fois que tous les puits ont été colorés, centrifuger les plaques pour regrouper les cellules au fond des puits, puis laisser les cellules reposer 15 minutes à température ambiante. Charger la plaque conformément aux instructions du fabricant.

Ensuite, réglez l'objectif à 40X ou plus. Réglez la caméra numéro quatre pour la lampe UV, puis réglez la caméra numéro un pour le laser 488. Chargez la plaque dans le système de criblage à haut débit.

Ensuite, configurez le système automatisé de criblage en imagerie confocale à haut débit pour lire six à dix champs par puits, avec deux lectures séquentielles par champ, à 488 nanomètres et en lumière UV. Les lymphocytes T positifs pour le CD3 représentent environ 30 % de la rate d'un souris donné, avec une expression basale de GFP de 10 %. Après une stimulation par des billes activateurs du récepteur des lymphocytes T CD3/CD28, on observe une augmentation de cinq à six fois du pourcentage de cellules exprimant la GFP.

De même, les cellules B positives pour le CD19 représentent 50 à 55 % des splénocytes totaux, avec une expression basale de la GFP similaire à celle des cellules T non activées. Fait intéressant, la stimulation du récepteur des cellules B à l’aide d’anticorps anti-IgG, anti-IgM de souris et de CD40L recombinant induit uniquement une augmentation négligeable de l’expression de la GFP. Après l’isolement par billes magnétiques tel que vient d’être démontré, les cellules T positives pour le CD3 isolées présentent toujours une expression basale de 10 % de la GFP.

Cependant, la stimulation par billes CD3/CD28 induit une régulation positive significative de la réponse GFP. De même, après l'isolement magnétique des cellules B, les cellules B activées purifiées présentent une expression plus élevée de GFP par rapport aux cellules B activées dans les splénocytes. Dans cette expérience représentative, un criblage primaire à haut débit de 4398 composés a révélé plusieurs activateurs et inhibiteurs de l'activation des lymphocytes T.

Mais l'expression de la GFP observée dans les lymphocytes T stimulés, 20 fois plus élevée que celle mesurée dans les lymphocytes T non stimulés, permet de définir une fenêtre de zone d'action dans laquelle les composés inhibiteurs de la GFP peuvent être facilement détectés. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en 36 à 48 heures si elle est correctement effectuée.

Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se souvenir de compter les cellules après chaque étape. Après cette procédure, d'autres méthodes comme le dosage immunoenzymatique (ELISA) ou le western blot peuvent être réalisées afin de répondre à toute autre question complémentaire. Cette technique ouvrira la voie à la découverte de médicaments à visée immunomodulatrice chez les rongeurs.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'isoler et d'activer les cellules T ou B provenant des plaques de souris Nurr77 GFP.