A base Fluorescence-lymphocytaire Assay Convient pour Criblage à haut débit des petites molécules

L’objectif global de ce test lymphocytaire basé sur la fluorescence est d’identifier de nouveaux immunomodulateurs à petites molécules. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l’immunologie sur le mécanisme d’activation et d’inhibition des lymphocytes. Le principal avantage de cette fonction phénotypique et de ce dosage, c’est qu’il peut être adapté à la découverte de médicaments.

Ahmed Fouda, un étudiant diplômé de notre laboratoire, fera la démonstration de la procédure. Sous une cagoule de travail stérile, désinfectez la fourrure d’une souris femelle Nurr77 GFP âgée de six à huit semaines avec de l’éthanol à 70 % et placez l’animal sur son côté droit. Ensuite, faites une incision dans la peau et les muscles du quadrant abdominal supérieur gauche, puis localisez et retirez la rate, en plaçant le tissu dans un milieu splénocytaire sur de la glace.

Lorsque toutes les rates ont été prélevées, transférez les tissus dans une boîte de culture cellulaire de 10 centimètres carrés contenant cinq millilitres de milieu splénocytaire préchauffé, et utilisez un piston de seringue stérile pour écraser les tissus jusqu’à ce que la solution soit trouble. Après un brassage intensif dans un milieu splénocytaire, filtrez la suspension cellulaire à travers une crépine cellulaire de 70 microns dans un tube de 50 millilitres pour éliminer tous les débris, puis centrifugez la suspension unicellulaire résultante. Remettez la pastille en suspension dans deux à trois millilitres de tampon de lyse des globules rouges, en amortissant la réaction avec cinq millilitres de RPMI, ou un autre tampon approprié, après 20 à 30 secondes.

Ensuite, collectez les cellules avec une autre centrifugation et remettez la pastille en suspension dans deux millilitres de milieu splénocytaire pour le comptage cellulaire. Pour isoler les lymphocytes T, centrifugez à nouveau les cellules et mettez à nouveau la pastille en suspension dans un milieu RPMI sans sérum à une fois 10 à la concentration de sept cellules par millilitre. Transférez les cellules dans un tube de polystyrène de cinq millilitres et mettez de côté une aliquote de 100 microlitres de splénocytes à utiliser plus tard pour l’évaluation de la pureté.

Ensuite, ajoutez 50 microlitres par millilitre de sérum de rat normal aux cellules, suivi de l’ajout de 50 microlitres par millilitre de cocktail d’anticorps d’isolement des cellules T avec un mélange doux. Après 10 minutes, incubez les cellules avec des billes magnétiques conjuguées à la streptavidine pendant deux minutes et demie. Ensuite, ajoutez un milieu exempt de sérum aux cellules pour un volume final de deux millilitres et demi, et placez le tube dans un aimant d’isolement cellulaire pendant trois minutes.

À la fin de l’incubation, en tenant le tube dans l’aimant, versez le surnageant dans un nouveau tube en polystyrène en un seul mouvement. Les lymphocytes T peuvent ensuite être comptés. Insérez les lymphocytes T dans une plaque à fond rond de 96 puits à une concentration de 2,5 fois 10 à la cinquième cellules par puits contenant 200 microlitres de milieu splénocytaire frais par puits.

Ajoutez des billes magnétiques recombinantes d’interleukine 7 et de CD3/CD28 dans les puits appropriés, et placez la plaque dans un incubateur de culture cellulaire. 12 heures plus tard, triturez doucement la suspension cellulaire dans chaque puits pour briser les agrégats de cellules de billes. Transférez ensuite les suspensions cellulaires de chaque puits dans des tubes individuels en polystyrène de cinq millilitres.

Lorsque toutes les cellules ont été collectées, placez chaque tube de cellules dans l’aimant de séparation pendant cinq minutes à la fois, et décantez les surnageants lorsque le tube est encore à l’intérieur de l’aimant, dans de nouveaux tubes de polystyrène à la fin de chaque incubation. Ensuite, collectez les cellules par centrifugation et remettez les granules en suspension dans un milieu splénocytaire frais à deux fois 10 à six cellules par millilitre de concentration. Pour le criblage à haut débit de petites molécules, plaquez 40 microlitres de cellules par puits dans une plaque de 384 puits et traitez les puits appropriés avec le médicament ou le véhicule de votre choix pour la période de traitement souhaitée dans l’incubateur de culture cellulaire.

30 minutes avant l’analyse GFP, colorez les cellules avec la concentration appropriée de solution Hoechst, en répartissant soigneusement la coloration avec un pipetage doux. Lorsque tous les puits ont été teints, centrifugez les plaques pour recueillir les cellules au fond des puits et laissez reposer les cellules pendant 15 minutes à température ambiante. Chargez la plaque selon les instructions du fabricant.

Ensuite, fixez l’objectif à 40X ou plus. Réglez la caméra numéro quatre pour la lampe UV, puis réglez la caméra numéro un pour le laser 488. Chargez la plaque sur le système de criblage à haut contenu.

Ensuite, réglez le système de criblage confocal automatisé à haut contenu pour lire six à 10 champs par puits avec deux lectures séquentielles par champ, à 488 nanomètres et à la lumière UV. Les lymphocytes T CD3 positifs représentent environ 30 % de la rate d’une souris donnée, démontrant une expression basale de la GFP de 10 %. Après la stimulation par les billes du récepteur des lymphocytes T CD3/CD28, une augmentation de cinq à six fois du pourcentage d’expression de la GFP est observée.

De même, les lymphocytes B CD19 positifs représentent 50 à 55 % des splénocytes totaux, avec une expression basale de la GFP similaire à celle des lymphocytes T non activés. Il est intéressant de noter que la stimulation des récepteurs des lymphocytes B à l’aide d’IgG anti-souris, d’IgM et de CD40L recombinant, ne déclenche qu’une augmentation insignifiante de l’expression de la GFP. Après l’isolement des billes magnétiques comme nous venons de le démontrer, les lymphocytes T CD3 positifs isolés présentent toujours une expression basale de GFP de 10 %.

La stimulation des billes CD3/CD28 induit cependant une régulation positive significative de la réponse GFP. De même, après l’isolement des billes magnétiques des lymphocytes B, les lymphocytes B activés purifiés présentent une expression plus élevée de la GFP par rapport aux lymphocytes B activés dans les splénocytes. Dans cette expérience représentative, le criblage primaire à haut débit de 4398 composés a révélé plusieurs activateurs et inhibiteurs de l’activation des lymphocytes T.

Mais l’expression de la GFP observée des lymphocytes T stimulés était 20 fois plus élevée que celle mesurée pour les lymphocytes T non stimulés. Permettant la génération d’une zone de fenêtre d’action où les composés inhibiteurs de la GFP pourraient être facilement détectés. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en 36 à 48 heures si elle est correctement exécutée.

Lors de la tentative de cette procédure, il est important de ne pas oublier de compter les cellules après chaque étape. Après cette procédure, d’autres méthodes telles que l’ELISA ou le western blot peuvent être effectuées pour répondre à toute autre question supplémentaire. Cette technique ouvrira la voie à la découverte de médicaments : l’immunomodulation chez les rongeurs.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’isoler et d’activer les lymphocytes T ou B dérivés des plaques de souris GFP Nurr77.