Un test basé sur la fluorescence utilisant des lymphocytes modifiés pour le criblage de composés immunomodulateurs

Commencez avec une plaque multipuits compatible avec la fluorescence contenant une suspension de lymphocytes T dérivés de souris transgéniques.

Ces lymphocytes contiennent une protéine fluorescente verte ou cassette d’expression GFP, contrôlée par l’engagement du récepteur des lymphocytes T ou TCR avec des composés immunomodulateurs.

Traitez bien chaque puits avec une solution contenant des composés immunomodulateurs de potentiels différents.

Pendant l’incubation, les composés immunomodulateurs interagissent avec les TCR des lymphocytes T.

L’interaction du TCR avec un composé stimulant déclenche l’activation de la cassette de gènes, augmentant ainsi l’expression de la GFP.

En revanche, l’interaction du TCR avec un composé inhibiteur inhibe la cassette de gènes et réduit l’expression de la GFP.

Ensuite, superposez les cellules avec un colorant fluorescent d’acide nucléique pour colorer les noyaux.

Centrifuger la plaque pour stabiliser les cellules afin d’obtenir une mesure précise de la fluorescence.

Au microscope à fluorescence, les lymphocytes T viables présentent deux signaux de fluorescence correspondant à des noyaux cellulaires et à des protéines fluorescentes vertes.

La fluorescence verte intensifiée signifie une stimulation réussie des lymphocytes T, tandis qu’un faible signal de fluorescence verte intracellulaire confirme l’effet inhibiteur des composés immunomodulateurs sur les lymphocytes T.

Pour le criblage à haut débit de petites molécules, mettez en plaques 40 microlitres de cellules par puits dans une plaque de 384 puits et traitez les puits appropriés avec le médicament ou le véhicule de votre choix pour la période de traitement souhaitée dans l’incubateur de culture cellulaire.

30 minutes avant l’analyse GFP, colorez les cellules avec la concentration appropriée de solution Hoechst, en répartissant soigneusement la coloration avec un pipetage doux. Lorsque tous les puits ont été teints, centrifugez les plaques pour recueillir les cellules au fond des puits et laissez reposer les cellules pendant 15 minutes à température ambiante.

Chargez la plaque selon les instructions du fabricant. Ensuite, fixez l’objectif à 40X ou plus. Réglez la caméra numéro 4 pour la lampe UV, puis réglez la caméra numéro 1 pour le laser 488. Chargez la plaque sur le système de criblage à haut contenu. Ensuite, réglez le système de criblage confocal automatisé à haut contenu pour lire 6 à 10 champs par puits, avec deux lectures séquentielles par champ à 488 nanomètres et à la lumière UV.