Medindo alimentação resposta induzida por glutationa em Hydra

Neste vídeo, descrevemos um método para medir o comportamento alimentar em Hydra. Em resposta à forma reduzida de glutationa, Hydra se alimenta de uma variedade de animais, nematóides, crusta e peixes recém-nascidos. Na camada externa deste animal em camadas de duas células, existem células especializadas chamadas nematocistos.

Os nematocistos têm gatilhos que, quando ativados pelo movimento da presa no fluido circundante, causam a descarga dos fios de amarração. Os fios pungentes são inseridos na presa. A presa ferida libera glicose em excesso.

Ion hydro tem uma sensação de quimioterapia para detectar a glutationa no líquido circundante. Isso desencadeia um comportamento alimentar envolvendo seu sistema nervoso. O comportamento alimentar em Hydra inclui enrolar os tentáculos para trazer a presa em direção a uma abertura hiperscópica da boca e engolfamento da presa.

De fato, adicionar íon glut ao ambiente causa a reação de alimentação na hidra, mesmo na ausência de presas. Para entender a interação da sensação de quimioterapia e do sistema nervoso, precisamos quantificar o comportamento e criar medidas precisas e confiáveis. Em alguns relatos anteriores, o tempo durante o qual a boca é hidro permanece aberta é tomado como uma medida da resposta alimentar, mas observar a duração da abertura da boca nos pólipos hidro é tedioso e está sujeito a variações induzidas por parâmetros incontroláveis, como a orientação da boca devido a observações.

Outro método de quantificação do comportamento é baseado no número de hidras em uma população que mostra a resposta alimentar. No entanto, como a resposta alimentar é um parâmetro quantitativo individual, as abordagens baseadas na população são variações subjetivas causadas pela opinião do observador individual. As principais vantagens do método alternativo que descrevemos aqui é que ele é muito fácil de executar e altamente reprodutível.

Mantenha a hidra a 18 graus Celsius sob 12 horas de luz. Ciclos escuros de 12 horas em um meio contêm em uma tigela de vidro e alimentam-nos diariamente com emia para medir a resposta alimentar. Transfira um hidropólipo maduro para um poço de uma placa de 24 poços, remova o meio residual do poço usando um pivô.

Isso é facilitado inclinando a placa, descartando o excesso de meio e, em seguida, adicionando imediatamente 500 microlitros de meio fresco Preparação da solução de glutationa. Uma solução de nove micromolares de glutationa é preparada usando meio hidro. Lembre-se de que a solução de glutationa é propensa à oxidação, portanto, sempre use uma solução de glutationa recém-preparada.

Para cada experimento, transfira a placa para a plataforma de imagem de um microscópio. Tendo provisão para gravação de imagens, use um fundo escuro de modo que o comportamento do hidropólipo possa ser claramente visualizado contra o fundo contrastante. Certifique-se de que o pólipo esteja localizado ao longo da parte central do poço capturou uma imagem de hidra no estado relaxado.

Esta será uma observação de ponto de tempo zero. Adicione rapidamente nove soluções micromolares de glutationa para atingir uma concentração final de três micromolares no poço. Inicie o temporizador imediatamente após adicionar a solução de glutationa e capture imagens a cada 15 ou 30 segundos por quatro a cinco minutos sem alterar as configurações de ampliação.

Para medições, usamos gim versão dois, gim. Um programa de manipulação de imagens GNU é um software que pode ser baixado gratuitamente da Internet. Abra cada uma das imagens capturadas no gim.

Este programa possui uma ferramenta de medição disponível nas ferramentas do menu. Meça a distância entre hipers, estoma, extremidade apical de cada um dos tentáculos pode ser medida usando esta ferramenta. Essa distância é chamada de propagação de tentáculos.

Calcule a propagação média do tentáculo para cada pólipo antes e depois da glutationa. Calcule a proporção da propagação média dos tentáculos no tempo zero. Aponte para isso em cada um dos pontos de tempo subsequentes.

Vamos chamar isso de propagação relativa de tentáculos. Faça essas medições para pelo menos 20 pólipos para fome. Transfira alguns hidropólipos para uma tigela de vidro separada e não os alimente por cinco dias.

Alimente os pólipos de controle diariamente com artia no dia do experimento. Alimente o grupo de controle de Hydra com artia para um R e use essas hydra para os experimentos subsequentes. Meça a resposta alimentar da hidra faminta em comparação com a hidra do grupo de controle pelo método descrito anteriormente neste vídeo para evitar qualquer viés devido ao tempo de alternância, as medições de cada um dos pólipos hidrópicos famintos e controlados.

A glutationa faz com que a hidra exiba o enrolamento dos tentáculos em direção à boca. Essa curvatura aproxima as extremidades apicais dos tentáculos da tempestade hipoglicêmica. Isso resulta na redução da distância linear entre as extremidades apicais do tentáculo e a hipertempestade ou propagação do tentáculo.

O tentáculo relativo se espalhou após a adição do meio. A falta de glutationa reduz apenas transitoriamente. Ele volta para um em cerca de um minuto.

Sabe-se que a fome causa melhora do comportamento alimentar induzido pela glutationa. O tentáculo espalhado um minuto após a adição de glutationa foi significativamente menor para o grupo de funcionários em comparação com o grupo saciado. Todos os animais usam a sensação de quimioterapia para detectar alimentos.

Hydra usa um sinal químico na forma de glutationa liberada da presa ferida, tem um sistema nervoso simples sem qualquer estrutura semelhante ao cérebro, então o mecanismo molecular da sensação de quimioterapia e sua modulação dependente do status de alimentação também são provavelmente simples. A compreensão desse mecanismo pode lançar luz sobre a evolução de uma regulação da alimentação em animais superiores. No entanto, nem o receptor que pode se ligar à glutationa nem quaisquer outros componentes da cascata de sinalização a jusante são relatados em Haida até esta data.

Inibidores farmacológicos de vias comuns de sinalização sensorial de quimioterapias e o uso de técnicas avançadas de biologia molecular para alterar a expressão de tais proteínas de sinalização e receptor de glutationa podem se mostrar ferramentas poderosas para a compreensão do mecanismo molecular da alimentação. Em Hydra, no entanto, uma medida confiável do comportamento alimentar alterado é necessária para entender a extensão de quaisquer modificações causadas por tais investigações experimentais. Aqui apresentamos um método que não é apenas confiável, mas também fácil de executar e altamente reprodutível.