Name: Medindo alimentação resposta induzida por glutationa em Hydra (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 10 s
Description: Aprenda a medir a resposta alimentar induzida por glutationa em Hydra usando análise de vídeo e medição da distância tentáculo-boca. Este método reprodutível auxilia pesquisas em neurociência e biologia do comportamento.

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Os autores agradecem a K. P. Madhu, Nita Beliappa e equipe do Centro de Mídia do Instituto Indiano de Educação e Pesquisa Científica, Pune, por sua ajuda na produção do vídeo. O trabalho foi apoiado por financiamento do programa Centro de Excelência do Departamento de Biotecnologia, Governo da Índia para SG e bolsa de pós-doutorado do Departamento de Ciência e Tecnologia, Governo da Índia para RK.

1. Hydra Cultura e medição da resposta Alimentação <ol><li> Manter pólipos hidra em cultura, alimentando-os com diária de artemia e mantendo-os num meio (tampão de 1 mM Tris-HCl, pH 7,6, NaCl a 1 mM, CaCl2 1 mM, KCl 0,1 mM, e 0,1 mM de MgSO4) contida em um tigela de vidro a 18 ° C sob ciclos escuros hr de luz 12 12 h, como descrito anteriormente 12. </li><li> Para a medição da resposta de alimentação, transferir um pólipo amadurecer hidra tendo 5 a 6 tentáculos para um único poço de uma placa de 24 poços. Retirar o meio residual do bem, inclinando-lo, e em seguida, adicione imediatamente 500 mL de meio fresco. </li><li> Preparar a solução de glutationa 9 uM em meio de hidra. Uma vez que a solução de glutationa é propenso a oxidação, usar sempre a glutationa solução preparada de fresco para cada experiência. </li><li> Transferir a placa para a plataforma de imagem de um microscópio tendo disposições para a gravação da imagem. Usar um fundo escuro de tal modo que o comportamentof pólipo hidra pode ser claramente fotografada contra o fundo contrastante. </li><li> A sala utilizada para a observação e imagem do comportamento de hidra livre de luzes de intensidade flutuante, correntes de ar e de ruído. Tais perturbações podem também fazer com que o pólipo hidra para mostrar a contracção dos tentáculos - mesmo na ausência de glutationa. </li><li> Permitir que o pólipo para relaxar por 5 min. </li><li> Certifique-se de que o pólipo está localizado ao longo da região central da cavidade de tal modo que o comportamento pode ser trabalhada de forma clara. Se o pólipo está na borda do poço, trazê-la para o centro, através de lavagem do meio utilizando uma pipeta e novamente permitir que ele relaxe. </li><li> Capturar uma imagem da hidra no estado relaxado. Este será o ponto de observação de tempo zero. </li><li> Rapidamente adicionar 9 uM solução glutationa para alcançar uma concentração final de 3 uM no poço. Dependendo da finalidade da experiência e a resposta mostrada por hidra, testar uma gama de diferentes concentrações de glutationa e Chooif a concentração adequada e necessária. </li><li> Inicie o cronômetro imediatamente após a adição de solução de glutationa e capturar imagens após cada 15-30 seg para 4-5 min. Não altere as configurações de ampliação durante a imagiologia de lapso de tempo. </li><li> Adicionar a solução de glutationa suavemente e com um fluxo uniforme de tal modo que a posição do animal no poço seria minimamente perturbado no campo de visão do microscópio. No entanto, se o pólipo se move extensivamente após a adição de solução de glutationa, mover a placa muito suavemente para trazer o pólipo no campo de visão para a captura de imagem. </li><li> No experimento de controle, use meio sem glutationa, mantendo todos os outros parâmetros idênticos. </li><li> Certifique-se de executar todas as etapas experimentais acima durante a primeira metade do dia - antes de 13:00 para evitar o possível efeito do ritmo circadiano sobre a extensão da resposta de alimentação. </li><li> Abra cada uma das imagens capturadas usando o GNU Image Manipulation Program (GIMP). Use a ferramenta "Medida", disponível a partir de Menu&gt; Ferramentas&gt; Medida para determinar a distância entre a extremidade apical de cada um dos tentáculos e hypostome. Se a abertura boca é observado em qualquer uma das imagens, determinar a distância entre o centro da boca aberta e a extremidade apical do tentáculo. Consulte a esta distância como a propagação tentáculo. </li><li> Calcule o spread médio tentáculo para cada pólipo antes e depois da exposição a glutationa. Calcular a proporção de spread médio tentáculo no ponto de tempo zero para que em cada um dos pontos de tempo subsequentes. Esta relação será chamado propagação tentáculo relativa. </li><li> Repita as medições por pelo menos 20 pólipos. </li></ol><img alt="Equação 1" fo:content-width="3.5in" src="/files/ftp_upload/52178/52178eq1.jpg" width="400"> <img alt="Equação 2" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/52178/52178eq2.jpg" width="450"> 2. método de validação usando oA fome Modelo <ol><li> Para a fome, transferir alguns pólipos Hydra para uma tigela de vidro separada e não alimentá-los durante 5 dias. Alimente o grupo de alguns pólipos controle diário com artemia em uma tigela de tamanho similar. Mudar o meio de tanto experimental taças diariamente para evitar crescimento de fungos no meio. </li><li> No dia do experimento, alimentar o grupo de controle hidra com artemia por 1 hr e usá-los hidra para os experimentos posteriores após a remoção de todos artemia não consumidos e mortos a partir do meio. </li><li> Meça a resposta de alimentação da hidra fome em comparação com a hidra do grupo de controle pelo método descrito anteriormente na etapa 1. Para evitar qualquer viés devido ao tempo de observação, alternar as medidas de cada da fome e controlar pólipos hidra. </li></ol>

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<li>Ramazani, R. B., Krishnan, H. R., Bergeson, S. E., Atkinson, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computer+automated+movement+detection+for+the+analysis+of+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Meth%22%5BJournal%5D)">Computer automated movement detection for the analysis of behavior.</a> J. Neurosci. Meth. 162, 171-179 (2007).</li>
</ol>

Os autores declaram não haver interesses financeiros concorrentes.

Comportamento alimentar em hidra representa um dos sistemas de quimio mais ancestrais dos metazoários. Embora a presença de GSH no fluido crustáceo libertado após assistida-nematocyst captura de presa foi detectada há muito tempo 1, nem a proteína GSHR nem o gene que codifica putativo / s têm sido caracterizadas a partir da hidra até à data. Poucas tentativas têm sido feitas para caracterizar as proteínas de ligação a GSH na hidra 8, 14, 15. No entanto, a identidade destas proteínas receptoras puta...

Hydra é o organismo mais primitivo que possui um sistema nervoso e quimiossensação para detectar glutationa reduzida (GSH) para capturar a presa1. Alimenta-se de uma variedade de animais, como nematóides, crustáceos, larvas de insetos, girinos e peixes recém-nascidos1. O movimento desses organismos de presa causa descarga mecanossensorial das cápsulas urticantes chamadas nematocistos da hidra, que são inseridas na presa2. O GSH presente no fluido liberado da presa ferida subsequentemente ativa a resposta alimentar na hidra, que inclui o enrolamento dos tentáculos para trazer a presa em direção à boca, abertura da boca e consequente engolfamento da presa. Várias moléculas, como dopamina3, glutamato4, GABA, glicina5, receptores NMDA6 e alatotropina7, demonstraram estar envolvidas na resposta alimentar na hidra. Também foi demonstrado que a resposta quimiossensorial induzida pelo GSH é modulada pelo estado alimentar do animal, de modo que a hidra faminta exibiu uma resposta alimentar aprimorada1. Esse aumento na sensibilidade do GSH é biologicamente relevante, uma vez que, sob a fome, a hidra precisa encontrar sua presa com maior sensibilidade. 
Embora a resposta alimentar induzida pelo GSH possa ser claramente observada ao microscópio, os métodos normalmente usados para medir as observações da resposta alimentar não são quantitativos. Na maioria dos casos, o tempo durante o qual a boca da hidra permanece aberta foi tomado como medida da resposta alimentar8,9; enquanto em outro caso, a quantificação foi baseada no número de hidras de uma população mostrando a resposta alimentar10. No entanto, observar o tempo de abertura da boca dos pólipos da hidra é complicado e sujeito a variações induzidas por parâmetros incontroláveis, como a direção da orientação da boca durante as observações. Da mesma forma, como a resposta alimentar é um parâmetro quantitativo, as abordagens de base populacional estão sujeitas a variações/erros causados pela opinião ou viés observacional do observador individual. Para contornar esses problemas, desenvolvemos um método para a quantificação relativa da resposta alimentar em hidra (Hydra vulgaris Ind-Pune11) com base na distância da extremidade apical do tentáculo da boca do pólipo da hidra.

<table><tbody><tr><td>Incubadora Refrigerada</td><td>Panasonic&nbsp;</td><td>Microscópio MIR-254-PE</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Leica</td><td>S8AP0&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Câmera para microscópio</td><td>Leica&nbsp;</td><td>EC3</td><td></td></tr><tr><td>Glutationa reduzida</td><td>Sigma</td><td>G4251</td><td>Armazenado a 4 °C. Leve o frasco à temperatura ambiente antes de abrir para evitar oxidação</td></tr><tr><td>Programa de edição de imagem</td><td>GIMP</td><td>Versão 2.8</td><td></td></tr></tbody></table>

medindo alimentação resposta induzida por glutationa em hydra

Measuring Glutathione-induced Feeding Response in Hydra

Hydra está entre os organismos mais primitivos que possuem um sistema nervoso e quimiossensação para detectar glutationa reduzida (GSH) para capturar a presa. O movimento dos organismos presas causa descarga mecanossensorial das células urticantes chamadas nematocistos da hidra, que são inseridas na presa. A resposta alimentar na hidra, que inclui o enrolamento dos tentáculos para trazer a presa em direção à boca, abertura da boca e consequente engolfamento da presa, é desencadeada pelo GSH presente no fluido liberado da presa ferida. Para poder identificar o mecanismo molecular da resposta alimentar em hidra que é desconhecido até o momento, é necessário estabelecer um ensaio para medir a resposta alimentar. Aqui, descrevemos um método simples para a quantificação da resposta alimentar no qual a distância entre a extremidade apical do tentáculo e a boca da hidra é medida e a razão dessa distância antes e depois da adição de GSH é determinada. Descobriu-se que a proporção, chamada de propagação relativa dos tentáculos, fornece uma medida da resposta alimentar. Este ensaio foi validado usando um modelo de fome no qual a hidra faminta mostra uma resposta alimentar aprimorada em comparação com a hidra alimentada diariamente.

A glutationa faz com que a hidra exibem ondulação dos tentáculos para a boca com a finalidade de engolindo a presa. Essa ondulação de tentáculos traz extremidades apicais dos tentáculos mais perto do hypostome. Isto resulta na redução da propagação tentáculo, ou a distância linear entre a extremidade apical do tentáculo e hipostoma (Figura 1). A propagação tentáculo parente, ou a proporção de tentáculo média espalhar antes e após a adição de glutationa, em média em vários pólipos reduz ao longo do tempo...

Aqui descrevemos um ensaio simples para a quantificação da resposta alimentar em hidra induzida pela forma reduzida de glutationa. Este ensaio baseia-se na medição da distância entre a extremidade apical do tentáculo e a boca da hidra.

Medindo alimentação resposta induzida por glutationa em Hydra

Hydra is among the most primitive organisms possessing a nervous system and chemosensation for detecting reduced glutathione (GSH) for capturing the prey. ...

Neste vídeo, descrevemos um método para medir o comportamento alimentar em Hydra. Em resposta à forma reduzida de glutationa, Hydra se alimenta de uma variedade de animais, nematóides, crusta e peixes recém-nascidos. Na camada externa deste animal em camadas de duas células, existem células especializadas chamadas nematocistos.Os nematocistos têm gatilhos que, quando ativados pelo movimento da presa no fluido circundante, causam a descarga dos fios de amarração. Os fios pungentes são inseridos na presa. A presa ferida libera glicose em excesso.Ion hydro tem uma sensação de quimioterapia para detectar a glutationa no líquido circundante. Isso desencadeia um comportamento alimentar envolvendo seu sistema nervoso. O comportamento alimentar em Hydra inclui enrolar os tentáculos para trazer a presa em direção a uma abertura hiperscópica da boca e engolfamento da presa.De fato, adicionar íon glut ao ambiente causa a reação de alimentação na hidra, mesmo na ausência de presas. Para entender a interação da sensação de quimioterapia e do sistema nervoso, precisamos quantificar o comportamento e criar medidas precisas e confiáveis. Em alguns relatos anteriores, o tempo durante o qual a boca

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