A medição da função do músculo liso nas Isolado tecido de banho-aplicativos para Farmacologia Research

O objetivo geral deste procedimento é medir o tônus do músculo liso. Isso é realizado primeiramente dissecando e preparando os tecidos. O segundo passo é montar o tecido em um banho de tecido isolado.

Em seguida, a viabilidade do tecido é testada e são realizadas medições de contração isométrica. Em última análise, o preparo de banho de tecido isolado é utilizado para testar a função do receptor, a sinalização do receptor e a reatividade do músculo liso. De modo geral, as principais vantagens desta técnica são a flexibilidade do sistema, a rapidez na obtenção de resultados e a manutenção do tecido inteiro intacto.

Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais em qualquer área que utilize fármacos para interferir na sinalização de receptores ou no músculo liso. Existem alguns preparativos que devem ser enfatizados. É essencial pré-aquecer o sistema de banho de tecidos a 37 graus Celsius ligando o banho de água aquecido com recirculação. A água deve fluir para dentro de cada componente pela conexão barbada mais baixa e sair pela conexão barbada mais alta.

Cada componente deve ser conectado. Os transdutores de força devem ser calibrados e também devem ser ligados pelo menos 15 minutos antes do experimento para que sua temperatura atinja o equilíbrio. Em seguida, ao conectar o gás, verifique vazamentos e depois pressurize o sistema.

Após preencher o sistema com a solução, certifique-se de escorvá-lo e remover todas as bolhas de ar. Também é recomendável testar os aeradores do banho de tecidos. Uma boa aeração distribuirá os fármacos de forma eficaz, sem desestabilizar o tecido imediatamente antes do experimento.

Disseque o tecido. Após anestesiar o rato, crie um pneumotórax usando uma tesoura. Corte ao longo do diafragma na parte inferior da caixa torácica.

Em seguida, corte desde a base da caixa torácica até o esterno e divida o tecido ao meio. Remova os órgãos que recobrem a coluna vertebral para localizar a aorta, que se situa diretamente ao longo da coluna vertebral. Agora, corte todas as conexões com a aorta e seccione a aorta perpendicularmente à coluna vertebral ao nível do diafragma.

Em seguida, segure suavemente a aorta e dissecione a aorta da coluna vertebral. Comece na região inferior do diafragma adjacente à coluna vertebral e progrida em direção ao coração. Apenas tenha cuidado para não puxar ou tracionar o tecido aórtico, pois isso pode danificá-lo imediatamente.

Coloque a aorta em uma placa de dissecação contendo PSS. Agora, pegue um fio e faça um pequeno ângulo de 90 graus. Em uma das extremidades, fixe a ponta angulada do fio na base da placa de dissecação.

Em seguida, introduza cuidadosamente o fio guia na luz da aorta e deslize a aorta sobre o fio. Quando a extremidade livre do fio se tornar visível, dobre-a suavemente e empurre-a para dentro da base, estabilizando assim o tecido. Agora, utilizando pequenas tesouras de dissecção e pinças, remova o tecido adiposo perivascular e outros tecidos estranhos até que a aorta torácica apareça branca e ligeiramente fibrosa.

Após remover os tecidos em excesso, retire cuidadosamente a aorta limpa do fio. Finalize esta etapa cortando a aorta em anéis com largura de três a cinco milímetros. Um anel aórtico alcançado.

Prepare dois ganchos para tecidos com suturas para fixá-los na câmara do banho. Um gancho deve ter uma sutura com uma pequena alça amarrada para fixação em uma haste. O outro gancho precisa de um pedaço de sutura com comprimento entre 10 e 14 centímetros.

Para amarrar um nó, prenda cuidadosamente um par desses ganchos para tecidos a cada anel aórtico. Tenha cuidado para evitar embaraçar os ganchos. Em seguida, transfira cada fragmento de tecido para uma placa com PSS à temperatura ambiente, utilizando um suporte para tecidos fixado a um suporte em forma de tripé.

Em seguida, deslize o laço com nó sobre o pino da haste e use o pedaço longo de fio cirúrgico para manter o tecido suspenso. Depois, coloque a haste na câmara e certifique-se de que a haste está firme. Agora, amarre o fio cirúrgico do gancho restante ao transdutor de força.

Deixe folga suficiente na sutura, para que a tensão entre o transdutor de força e o tecido possa ser ajustada pelo micrômetro. Repita este processo para cada anel em cada câmara. Agora, defina a tensão passiva.

Use o micrômetro para aumentar a tensão até dois gramas e aguarde até que a tensão no tecido pare de aumentar. Em seguida, aumente a tensão em mais dois gramas e, novamente, aguarde a estabilização da mudança na tensão. Para finalizar.

A tensão agora deve estar em torno de 3,2 gramas. Repita este processo em cada anel em cada câmara. Após ajustar todas as tensões passivas, deixe os tecidos equilibrarem por uma hora.

Durante este período, substitua a PSS a cada 15 minutos e realize outros preparativos para o experimento, como a preparação das drogas no final do período de equilíbrio. Lave o tecido uma última vez, salve os dados e reinicie todas as entradas. Em seguida, seguindo os detalhes descritos no protocolo textual, realize o desafio inicial.

Certifique-se de documentar essas ações no software. Após o estímulo inicial, a alteração da tensão atingirá um platô. Em seguida, lave o fármaco estimulante para que o tônus do tecido retorne à linha de base.

Deixe o tecido em repouso nesse tônus basal por cerca de 10 minutos agora, colocando um banho com o veículo, neste caso água, no outro. Adicione prazosina suficiente para uma concentração de cinco nanomolares no banho. Deixe os banhos de tecido incubarem por uma hora sem lavagem.

Enquanto isso, aplique a fenil-rina em uma ampla faixa de concentrações ao longo de uma curva logarítmica. Após uma hora, adicione o agonista da fenil-rina em concentrações crescentes ao banho para gerar uma resposta cumulativa à concentração. Após cada adição, aguarde o platô da resposta do tecido antes de adicionar a próxima concentração.

Continue fazendo adições até que elas não alterem mais o tônus do tecido ou até que toda a curva de resposta tenha atingido um platô. Em vez disso, a aorta torácica foi incubada no antagonista do receptor alfa-1 adrenérgico POZ sim por uma hora antes de adicionar o agonista alfa-1 adrenérgico fenil rina ao banho de tecido e gerar curvas cumulativas de resposta contrátil, com as contrações máxima e à meia máxima de fenil rina. No tecido controle com veículo isolado, estão marcadas em verde.

A metade do valor máximo identifica a concentração efetiva da droga. As mesmas medições para o tecido tratado com razin são mostradas em preto. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como medir a função do músculo liso em um banho de tecido isolado.